專利名稱：一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的建立及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種高效表達人源蛇毒激肽原酶的麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)、其構(gòu)建方法及應用。
背景技術(shù)：
激肽原酶是動物體內(nèi)的ー種蛋白水解酶，存在于許多器官的組織中。人們認識最早、研究最為清楚的是蛇毒中的胰激肽原酶。胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)又稱為胰激肽釋放酶(Pancreatic Kallikrein)是ー類內(nèi)切型蛋白水解酶,存在于哺乳動物體內(nèi)的多種組織，尤以蛇毒中含量最為豐富。在體內(nèi)作用于激肽原，使其釋放出激肽，從 而發(fā)揮出一系列的藥理作用使微血管擴張，改善外周血液循環(huán)；促進前列腺素分泌，擴張小動脈，増加腎血管流量；激活纖溶酶系統(tǒng)，使纖維蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。臨床上主要用于微循環(huán)障礙引起的腎病變及眼底供血障礙、高血壓癥、腦動脈硬化和腦動脈血栓、冠心病及其它閉塞性周圍血管性疾病的治療。目前國內(nèi)臨床上所使用的激肽原酶均為從哺乳動物的胰腺中提取，純度不高，具有一定的抗原性，進入人體后，可能誘發(fā)一系列的抗原抗體反應，已有報道注射胰激肽原酶導致固定性藥疹及重癥多形紅斑藥疹，且不能實現(xiàn)靜脈注射給藥，使藥物不能最大限度發(fā)揮作用。經(jīng)過多年的臨床實踐，發(fā)現(xiàn)江浙蝮蛇蛇毒類激肽原酶有最好的療效。然而蛇毒資源是非常有限的，如果通過基因工程來獲得產(chǎn)品，則是ー個很有前途的途徑。為此，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，通過反轉(zhuǎn)錄克隆了江浙蝮蛇中的蛇毒激肽原酶基因，利用麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)對其進行表達，使蛇毒激肽原酶的安全生產(chǎn)成為可能，同時為蛇毒激肽原酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究提供了實驗材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個能夠高效表達重組蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)。本發(fā)明的另一目的是提供上述高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的構(gòu)建方法。本發(fā)明的進ー步目的是提供上述高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)在生產(chǎn)重組蛇毒激肽原酶中的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的ー種含有蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其出發(fā)菌株為大腸桿菌DH5a。上述基因工程菌的構(gòu)建方法，其包括步驟1)從江浙蝮蛇組織中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增得到VK基因；2)將步驟I)中得到的VK基因插入到表達載體中；3)將步驟2)中構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選陽性克隆，得到重組大腸桿菌工程菌。前述的方法，其中所述表達載體的出發(fā)載體為PCS2+。前述的方法，其中所述VK基因具有Seq ID No: I所示的核苷酸序列。
為了獲得麥胚無細胞表達載體質(zhì)粒，本發(fā)明通過反轉(zhuǎn)錄江浙蝮蛇組織得到VK基因，用PCR方法在5’端加上GGATCC以構(gòu)成BamHI酶切位點，在BamHI后加入CACCATCATCATCATCAT以構(gòu)成組氨酸標簽，3’端加上CTCGAG以構(gòu)成XhoI酶切位點，然后經(jīng)BamHI及XhoI兩種酶消化后，即可直接克隆至pCS2+質(zhì)粒，得到pCS2+/VK質(zhì)粒。本發(fā)明以pCS2+作為表達載體,是由于pCS2+適合于麥胚無細胞表達系統(tǒng)。目的基因被克隆到PCS2+質(zhì)粒載體上，受SP6轉(zhuǎn)錄及翻譯(可選擇)信號控制；由外源SP6 RNA聚合酶誘導進行轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)適合眾多實驗應用，如細菌或哺乳動物蛋白的細胞內(nèi)表達，無細胞表達等。此外在PCS2+質(zhì)粒載體上所表達的外源蛋白的N端引入His蛋白標簽，可以用Ni柱洗脫的方法進行純化，從而極大地簡化了重組蛋白的后續(xù)純化工作，非常適合目的蛋白的收集。本發(fā)明以輪選987硬質(zhì)小麥為原料，先人エ將麥胚分離出來，液氮中磨碎加入抽提物緩沖液，離心取上清得到麥胚抽提物，-80°C保存?zhèn)溆谩３樘嵛锞彌_液包括40mM、Hepes - KOH pH7. 6、IOOmM 醋酸鉀、5mM 醋酸鎂、2mM 氯化鈣和 4mM DTT。將上述pCS2+/VK麥胚無細胞表達載體與SP6 RNA聚合酶、NTP以及相應緩沖液混合后37°C反應4h，得到重組蛇毒激肽原酶mRNA。將所得mRNA與麥胚抽提物和翻譯緩沖液混合后，用雙層法，反應16h得到目的蛋白。翻譯緩沖液包括25mM Hepes-KOH pH7. 6、100mM醋酸鉀、2. 7mM醋酸鎂、I. OmM ATP,O. 25mM GTP、16mM磷酸肌酸、O. 4mM各種氨基酸、O. 4mM亞精胺、5mM DTT。向翻譯體系中補充質(zhì)粒載體和15U SP6 RNA聚合酶，NTP及轉(zhuǎn)錄緩沖液適量，隨著質(zhì)粒載體的濃度提高蛋白產(chǎn)量也相應提高，質(zhì)粒載體濃度超過30ng/y I時蛋白產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，向翻譯體系中補充磷酸肌酸，隨著磷酸肌酸濃度提高蛋白產(chǎn)量也相應提高，濃度超過25mM時蛋白產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，而向翻譯體系中補充Cu2+是在其濃度5mM時，蛋白產(chǎn)量達到最大。為了分離純化蛇毒激肽原酶蛋白，本發(fā)明還提供了由上述工程菌所表達的蛇毒激肽原酶蛋白的純化方法，包括如下步驟I)收集翻譯后的混合液體；2)用His TrapTM FF凝膠柱進行親和層析；3)通過梯度脫鹽。具體地說，本發(fā)明中蛇毒激肽原酶蛋白的純化方法包括如下步驟I)收集翻譯反應完成后的混合液體；2)將步驟I)中得到的液體與His TrapTM FF凝膠柱結(jié)合，用洗滌緩沖液除去未結(jié)合的蛋白，然后用洗脫緩沖液洗脫，得到目的蛋白；所述結(jié)合緩沖液含有20mmol/L憐酸鈉、40mmol/L咪唑、O. 5mol/LNaCl>8mol/L尿素，pH值為8. O ;所述洗滌緩沖液含有20mmol/L磷酸鈉、100mmol/L咪唑、O. 5mol/L NaCl,8mol/L尿素，pH值為8. O ;所述洗脫緩沖液含有20mmol/L磷酸鈉、500mmol/L咪唑、O. 5mol/L NaCl、8mol/L 尿素，pH 值為 8. O ；本發(fā)明的純化方法，能使VK重組蛋白純度達到90%。根據(jù)蛇毒激肽原酶具有精氨酸酯酶活性，專ー性的水解精氨酸酯類化合物，從而釋放精氨酸，使其在253nm處吸光值增加的特性測量重組激肽原酶活性。
底物溶液含N-苯甲酰-L-精氨酸こ酯鹽酸鹽(BAEE) 17. 7mg, IMTris-HCl pH8. O。本發(fā)明得到重組蛋白比活力略小于天然蛋白比活力(I. 736U/mg)為I. 3U/mg。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(I)本發(fā)明通過RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄蛇毒激肽原酶基因，從而將蛇毒激肽原酶基因連接到麥胚無細胞表達載體上，進行體外轉(zhuǎn)錄和表達，VK蛋白表達量占總蛋白的50%。(2)使用麥胚無細胞蛋白表達系統(tǒng)，對蛇毒激肽原酶進行體外轉(zhuǎn)錄和表達，反應時間短整個過程僅需一天時間，省去了工程菌表達所需要的細胞培養(yǎng)時間，產(chǎn)量達到了O. 74mg/ml能夠?qū)崿F(xiàn)蛇毒激肽原酶基因的高效表達，且蛋白活性僅略低于天然蛋白，為后期臨床研究奠定了基礎(chǔ)。(3)本發(fā)明利用所表達的外源蛋白的N端具有His蛋白標簽，可以用Ni柱洗脫的方法進行純化，極大地簡化了重組蛋白的后續(xù)純化工作，純度高達90%以上，且純化效率 高、成本低，適合目的蛋白的大規(guī)模制備。


圖I為本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒pCS2+/VK的酶切鑒定電泳圖，其中，M為DL2000Marker ；1為雙酶切產(chǎn)物。圖2為本發(fā)明VK重組蛋白體外轉(zhuǎn)錄電泳圖，其中，M為DL2000Marker ；1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。圖3為本發(fā)明VK重組蛋白體外表達純化后的SDS-PAGE和Western blot分析圖；其中，A為SDS-PAGE分析圖，B為Western blot分析圖，其中，I為分子量蛋白Marker ;2為純化后重組蛋白；3為純化前重組蛋白；4為未加mRNA的反應混合物。圖4為本發(fā)明麥胚無細胞表達系統(tǒng)條件優(yōu)化電泳圖；A為磷酸肌酸優(yōu)化電泳圖，I為分子量蛋白Marker ;2、3、4分別向反應混合物中加入25mM，15mM, 5mM的磷酸肌酸銅離子濃度優(yōu)化電泳圖I為分子量蛋白Marker ;2、3、4、5分別向反應混合物中加入IOmM, 5mM, 2mM, OmM Cu2+ ；C為質(zhì)粒載體濃度優(yōu)化電泳圖I為分子量蛋白Marker ;2、3、4、5分別向反應混合物中加入Ong/ μ I, 5ng/ μ I, 15ng/ μ l,30ng/ μ I質(zhì)粒載體。圖5為本發(fā)明重組蛋白酶比活力柱狀圖，其中I為重組蛋白比活力1.736U/mg;2為天然蛋白去糖鏈后比活力I. 528U/mg ;3為天然蛋白比活力I. 3U/mg。
具體實施例方式以下步驟用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。步驟I蛇毒激肽原酶基因的擴增從江浙蝮蛇組織中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增得到VK基因。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的條帶后通過T4 DNA連接酶于4°C連接過夜至pGEM-T載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α ;轉(zhuǎn)化株先經(jīng)過藍白斑篩選，再用PCR擴增(擴增的程序為94°C預變性5min ；98°C變性10s，60°C復性15s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，結(jié)束反應)并進行
測序鑒定。步驟2表達載體的構(gòu)建及大腸桿菌的轉(zhuǎn)化設計上游引物I 5’ -T CATCATCATCATGTCATTGGAGGTGATGAATGTAACA-3’ 上游引物25’-CGCGGATCCATGCACCATCATCATCATCATGTCATTGGAGG-3’ (下劃線部分為 BamH I 酶切位點)和下游引物5’ -CCGCTCGAGTCACGGGGGGCATGTCAC-3’(下劃線部分為Xho I酶切位點)，用PCR方法擴增得到不含信號肽的VK基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Xho I消化后插入表達載體pCS2+的BamH I和Xho I位點，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，提取轉(zhuǎn)化株質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xho I酶切，測序鑒定后(圖1)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a。步驟3重組激肽原酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯(I)制備麥胚抽提物，選取輪 選987硬質(zhì)小麥為原料，人工提取麥胚，將其在液氮中磨成粉末加入抽提物緩沖液(40mMfepes - KOH pH7. 6、IOOmM醋酸鉀、5mM醋酸鎂、2mM氯化鈣和4mM DTT)離心取上清后，_80°C保存?zhèn)溆谩?2)體外轉(zhuǎn)錄，提取構(gòu)建好的pCS2+/VK載體，將其與轉(zhuǎn)錄緩沖液(5mM ATP、CTP,GTP、UTP(濃度？)、80mM Hepes-KOH pH7. 6，16mM 醋酸鎂、2mM 亞精胺、IOmM DTT、15 單位 SP6RNA聚合酶)混合，37°C反應4h得到激肽原酶mRNA。(圖2)(3)體外翻譯，將轉(zhuǎn)錄得到的激肽原酶mRNA與麥胚抽提物和翻譯緩沖液(25mMHepes-KOH ρΗ7· 6、IOOmM 醋酸鉀、2. 7mM 醋酸鎂、I. OmM ATP,O. 25mM GTP、16mM 磷酸肌酸、0.4mM各種氨基酸、0.4mM亞精胺、5mM DTT)混合，應用雙層法反應16h得到目的蛋白。(圖3)步驟4麥胚無細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)化(I)二次能源物質(zhì)磷酸肌酸的優(yōu)化，向翻譯系統(tǒng)中加入肌酸激酶(15U)和不同濃度的磷酸肌酸(25mM，15mM, 5mM)比較蛋白產(chǎn)量。(圖4A)(2)銅離子濃度優(yōu)化，向翻譯系統(tǒng)中加入Cu2+ (IOmM, 5mM, 2mM, OmM)比較蛋白產(chǎn)量。(圖 4B)(3)質(zhì)粒載體濃度的優(yōu)化，向翻譯系統(tǒng)中加入適量轉(zhuǎn)錄緩沖液和不同濃度的質(zhì)粒載體(Ong/μ l，5ng/y 1，15ng/μ 1，30ng/μ I)比較蛋白產(chǎn)量。(圖 4C)步驟5蛋白的純化His TrapTM FF凝膠柱用IOmL雙蒸水洗滌后用IOmL結(jié)合緩沖液平衡，上樣使目的蛋白與凝膠柱結(jié)合，沒有結(jié)合的蛋白用洗漆緩沖液(20mmol/L磷酸鈉，100mmol/L咪唑，O. 5mol/L NaCl, 8mol/L尿素,ρΗ8· O)除去,最后用洗脫緩沖液(20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L咪唑，O. 5mol/L NaCl，8mol/L尿素，ρΗ8· O)洗脫，得至Ij目的蛋白，純度達90%。步驟6重組蛋白的鑒定對步驟5中得到純化的目的蛋白和步驟I中得到的蛋白進行SDS-PAGE電泳和Weatern bloting分析。(圖3)并對步驟5中得到純化的目的蛋白進行了酶比活力的測定并與天然蛋白進行了比較。(圖5)雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，其包括步驟I)從江浙蝮蛇組織中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增得到蛇毒激肽原酶VK基因；2)以pCS2+作為表達載體，將VK基因插入到表達載體中并引入His標簽得到麥胚無細胞表達載體質(zhì)粒；3)將表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選陽性克隆，得到重組大腸桿菌工程菌，建立體外轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)。
2.如權(quán)利要求I所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，該系統(tǒng)含有蛇毒激肽原酶(VK)基因的表達載體，所述蛇毒激肽原酶基因具有Seq ID No: I所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求I或2所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，建立體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，提取權(quán)利要求4所述工程菌中質(zhì)粒進行表達包括建立體外轉(zhuǎn)錄體系，將提取質(zhì)粒加入體系中于37°C反應4h，得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述體外轉(zhuǎn)錄體系包括5mM ATP、5mM CTP、5mM GTP、5mM UTP、8OmMH印es - KOH pH7. 6，16mM醋酸鎂、2mM亞精胺、IOmM DTT, 15單位SP6RNA聚合酶?！?br> 4.如權(quán)利要求I或2所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，建立體外翻譯系統(tǒng)，將權(quán)利要求5中得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與麥胚抽提物和翻譯緩沖液混合26V反應16h，得到目的蛋白并進行純化，所述翻譯緩沖液包括25mMHepesK0H pH7. 6、IOOmM醋酸鉀、2. 7mM醋酸鎂、I. OmM ATP,O. 25mM GTP、16mM磷酸肌酸、O.4mM各種氛基酸、O. 4mM亞精胺、5mM DTT。
5.如權(quán)利要求4所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，所述目的蛋白的純化方法，包括如下步驟 O收集含有目的蛋白的反應液； 2)將步驟I)中得到的混合液與His TrapTM FF凝膠柱結(jié)合，用洗滌緩沖液除去未結(jié)合的蛋白，然后用洗脫緩沖液洗脫，得到目的蛋白；所述洗脫緩沖液含有20mmol/L磷酸鈉、40mmol/L咪唑、O. 5mol/LNaCl、8mol/L尿素，pH值為8. O ;所述洗滌緩沖液含有20mmol/L磷酸鈉、100mmol/L咪唑、O. 5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值為8. O ;所述洗脫緩沖液含有20mmol/L 磷酸鈉、500mmol/L 咪唑、O. 5mol/L NaCl、8mol/L 尿素，pH 值為 8. O。
6.如權(quán)利要求6所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，所述體外翻譯系統(tǒng)的優(yōu)化為向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與麥胚抽提物和翻譯緩沖液混合液補充質(zhì)粒載體30ng/l·! 1，SP6RNA聚合酶15U，NTP及轉(zhuǎn)錄緩沖液適量，磷酸肌酸25mM以及Cu2+5mM反應16h，可使麥胚無細胞系統(tǒng)表達的VK蛋白產(chǎn)量由O. 13mg/ml提高到O.74mg/ml。
7.麥胚無細胞系統(tǒng)表達的VK蛋白的純化方法，包括如下步驟 1)蛋白翻譯完成后收集翻譯混合液體； 2)用HisTrapTM FF凝膠柱進行親和層析； 3)通過梯度透析，將蛇毒激肽原酶蛋白脫鹽。
8 重組蛇毒激肽原酶活性檢測，其特征在于，測定方法在253nm波長處，以底物溶液為空白，準確讀取I分鐘的吸光度Al和3分鐘的吸光度A3，ΔΑ{|( Δ A=A3 一 Al)的平均值代入下式計算
全文摘要
本發(fā)明建立了一個用來高效表達重組蛇毒激肽原酶的麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)，其是通過反轉(zhuǎn)錄克隆了江浙蝮蛇中的蛇毒激肽原酶基因，構(gòu)建麥胚無細胞表達質(zhì)粒pCS2+/VK，制備麥胚抽提物，建立體外轉(zhuǎn)錄和翻譯體系，對蛇毒激肽原酶進行表達并對系統(tǒng)進行了優(yōu)化。該表達系統(tǒng)所表達的外源蛋白的N端具有His蛋白標簽，通過Ni柱洗脫的方法進行純化，極大地簡化了重組蛋白的后續(xù)純化工作，且純化效率高、成本低。該外源蛋白還具有生物學活性為下一步臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/70GK102732548SQ20121015357
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者宋夢薇, 張雅楠, 王云鵬, 羅云波, 許文濤, 馬骉, 黃昆侖 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學, 北京賽升藥業(yè)股份有限公司