專利名稱：一種皮質(zhì)醇激素核酸適體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于糖皮質(zhì)激素檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種皮質(zhì)醇激素核酸適體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖皮質(zhì)激素(GC)是人體重要的激素，調(diào)節(jié)多種生理功能，其異常常導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，生物樣品中糖皮質(zhì)激素主要為皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮，其皮質(zhì)醇為主要成份，皮質(zhì)醇的檢測方法包括薄層色譜法(TCL)，氣相色譜(GC)，高效液相色譜法(HPLC)，氣-質(zhì)普連用法(GC-MS)，液質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)，毛細(xì)管電泳法等。這些方法雖具有較高的靈敏性和特異性，但需要復(fù)雜的凈化提純步驟和較貴重的儀器設(shè)備，不易推廣使用。單克隆抗體或多克隆抗體的ELISA檢測技術(shù)具有簡單快速靈敏的特點(diǎn)，可同時檢測大量樣品，采用先進(jìn)的競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測盒(R0MER美國)和Stat Fax303酶標(biāo)讀數(shù)儀(美國)，聯(lián)合分析皮質(zhì)醇激素。然而，皮質(zhì)醇作為小分子物質(zhì)，其免疫原性低，抗體制備較為困難。一般常需要與蛋白大分子偶聯(lián)后進(jìn)行免疫，而偶聯(lián)方法常較難，偶聯(lián)后常封閉其結(jié)構(gòu)特征；在抗體篩選中需要大量克隆才能獲得高特異和高親和力抗體，在后續(xù)的檢測中其方法建立難，其檢測的干擾因素較多，目前，基于抗體的檢測技術(shù)存在固有的局限性，如①不同廠家、不同抗體、不同批次生產(chǎn)抗體效價的不同；②抗體在保存、使用時有嚴(yán)格條件，諸如溫度、PH值、滲透壓的限制在進(jìn)行反應(yīng)時，有很多干擾因素的存在。現(xiàn)在，科學(xué)家不約而同的把注意力聚焦到分子生物學(xué)新技術(shù)在生物檢測的應(yīng)用上。SELEX技術(shù)(系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))是90年代初研制的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。其基本原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，其中隨機(jī)序列一般長度在20 40bp左右，文庫容量在IO14 IO15之間。由于單鏈隨機(jī)寡核苷酸片段特別是RNA易形成發(fā)卡、口袋、假節(jié)、G-四聚體等二級結(jié)構(gòu)，故能與蛋白質(zhì)、小肽，甚至金屬離子結(jié)合，形成具有很強(qiáng)結(jié)合力的復(fù)合物。這種方法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，與其他組合化學(xué)庫如隨機(jī)肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的靶標(biāo)特異單鏈寡核苷酸稱為核酸適體(也成為核酸適配體、核酸適配子)，核酸適體具有許多優(yōu)勢a.本身是寡核苷酸，分子量較小可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；b.具有比抗體更高的親和性和特異性；c.便于標(biāo)記，在不同部位有選擇性的標(biāo)記；d.穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配子在臨床檢測及診斷中具有良好的應(yīng)用前景
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種高特異性、高親和力的皮質(zhì)醇核酸適體替代抗體在皮質(zhì)醇激素檢測中應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述皮質(zhì)醇核酸適體進(jìn)行皮質(zhì)醇激素檢測方法。
一種皮質(zhì)醇激素核酸適體，該核酸適體包括(I)序列表中SEQ ID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列；(2)與序列表SEQ ID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的核苷酸序列；(3)序列表中SEQ ID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列中任何位置的堿基被甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后的序列，置換堿基的個數(shù)為1-10個；(4)序列表SEQ ID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的核苷酸序列中任何位置的堿基被甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后的序列，置換堿基的個數(shù)為1-10個。 一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，在皮質(zhì)醇激素核酸適體上標(biāo)記可檢測標(biāo)記物，將皮質(zhì)醇激素核酸適體與其互補(bǔ)序列退火組裝在一起，加入樣品，當(dāng)樣品中皮質(zhì)醇激素存在的情況下，破壞皮質(zhì)醇激素核酸適體與其互補(bǔ)序列的結(jié)合，通過檢測分離后的可檢測標(biāo)記物的信號而獲得皮質(zhì)醇激素濃度。所述可檢測標(biāo)記物為熒光素、膠體金、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換磷光顆?；蛎笜?biāo)親和素。所述檢測的方法為熒光偏振、共振能量轉(zhuǎn)移、等離子共振技術(shù)(SPR)、電化學(xué)(電位\電流\電容檢測模式)。一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，將皮質(zhì)醇激素核酸適體與其互補(bǔ)序列退火組裝在一起，加入磁珠，混勻，加入樣品，采用磁鐵磁分離方法分離磁珠，以分離磁珠后的剩余溶液為模板，進(jìn)行實(shí)時定量PCR，檢測皮質(zhì)醇激素的濃度。一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，其特征在于，將皮質(zhì)醇激素核酸適體膠體金混合在一起，加入靶標(biāo)，再加入鹽，膠體金聚集顯色，吸收波長改變，檢測吸收波長的變化程度與皮質(zhì)醇激素的濃度成線性相關(guān)，達(dá)到檢測的目的。本發(fā)明的有益效果具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)1)本發(fā)明的皮質(zhì)醇激素核酸適體本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；2)具有比抗體更高的親和性和特異性；3)便于標(biāo)記且可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記；4)重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對高溫和劇烈條件不敏感；5)檢測方法靈活，易于優(yōu)化；6)試劑盒使用方法簡單。


圖I為膠體金聚集顯色法檢測皮質(zhì)醇激素的原理示意圖。圖2為皮質(zhì)醇特異核酸適體與皮質(zhì)醇特異結(jié)合的線性相關(guān)性圖。圖3為Apta-PCR檢測皮質(zhì)醇激素原理示意圖。圖4為Apta-PCR檢測皮質(zhì)醇的擴(kuò)增曲線及濃度-Ct效應(yīng)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例I皮質(zhì)醇激素核酸適體的篩選初始文庫為兩端固定，中心35個堿基的隨機(jī)序列，(5，-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGC N35 )ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC_3 ’)，DNA 合成儀合成，HPLC純化，溶于100 μ I SHMCK緩沖液中，偶聯(lián)引物磁珠(Μ-Ρ3)用SHMCK洗3次，置于400 μ I體系中，加入上述文庫和IOnmol引物P2 (5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCG_3’)，三組分混勻進(jìn)行雜交組裝反應(yīng)94°C I min，45°C 30min，室溫反應(yīng)6h，4°C過夜，洗滌后，靶標(biāo)皮質(zhì)醇加入到500 μ I SHMCK體系中孵育；取磁分離上清液分裝250 μ 1X2，乙醇沉淀過夜，去上清，完全干燥沉淀物，干燥物用ddH20溶解后合并混勻。以此為模板，進(jìn)行PCR，在PCR體系中，下游引物的Ρ2 (5’ -ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC-3’)，5’端標(biāo)記有生物素進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到3’端帶有生物素的dsDNA文庫dsDNA產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，與鏈親和素磁珠結(jié)合,此時dsDNA通過生物素與磁珠上的鏈親和素結(jié)合，然后用O. lmol/L的NaOH使dsDNA變性解鏈，生物素標(biāo)記的一條鏈與鏈親和素結(jié)合留在磁珠上，而生物素未標(biāo)記的一條鏈解離出來，經(jīng)乙醇沉淀，溶于SHMCK緩沖液中，測定光密度值作為下一輪篩選的ssDNA文庫。到第3輪后，直接取靶標(biāo)皮質(zhì)醇競爭后的液體直接作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備次級文庫。篩選條件見表1，共篩選12輪。將篩選的核酸適體PCR成dsDNA，裝入T載體，克隆、測序；篩選到的 皮質(zhì)醇激素核酸適體核苷酸序列如表2所示。表I 皮質(zhì)醇每輪篩選條件
SELEX輪數(shù)文庫量洗滌次數(shù)靶標(biāo)濃度孵育時間次級文庫投入模板
13. Inmol6200 μ M2h全部
2500pmol9200 μ MIh50%
3400pmol10100 μ MIh2 μ 1+2 μ I
42OOpmol10100 μ MIh2 μ 1+2 μ I
52OOpmoI1250 μ MIh2 μ 1+2 μ I62OOpmoI1550 μ M45min2 μ 1+2 μ I
72OOpmoI1850 μ M3Omin2 μ 1+2 μ I
82OOpmoI2140 μ M3Omin2 μ I
9IOOpmol2530 μ M30min2 μ I
10IOOpmol2520 μ MSOmin2 μ I
11IOOpmol2515 μ M3Omin2 μ I
12IOOpmol2510 μ M3Omin2 μ I表權(quán)利要求
1.一種皮質(zhì)醇激素核酸適體，其特征在于，該核酸適體包括 (1)序列表中SEQID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列； (2)與序列表SEQID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的核苷酸序列； (3)序列表中SEQID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列中任何位置的堿基被甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后的序列，置換堿基的個數(shù)為1-10個； (4)序列表SEQID No. I到SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的核苷酸序列中任何位置的堿基被甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后的序列，置換堿基的個數(shù)為1-10 個。
2.一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，其特征在于，在皮質(zhì)醇激素核酸適體上標(biāo)記可檢測標(biāo)記物，將皮質(zhì)醇激素核酸適體與其互補(bǔ)序列退火組裝在一起，加入樣品，當(dāng)樣品中皮質(zhì)醇激素存在的情況下，破壞皮質(zhì)醇激素核酸適體與其互補(bǔ)序列的結(jié)合，通過檢測分離后的可檢測標(biāo)記物的信號而獲得皮質(zhì)醇激素濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，其特征在于，所述可檢測標(biāo)記物為熒光素、膠體金、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換磷光顆?；蛎笜?biāo)親和素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，其特征在于，所述檢測的方法為熒光偏振、共振能量轉(zhuǎn)移、等離子共振技術(shù)或電化學(xué)。
5.一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，其特征在于，將皮質(zhì)醇激素核酸適體與其互補(bǔ)序列退火組裝在一起，加入磁珠,混勻,加入樣品,采用磁鐵磁分離方法分離磁珠，以分離磁珠后的剩余溶液為模板，進(jìn)行實(shí)時定量PCR，檢測皮質(zhì)醇激素的濃度。
6.一種皮質(zhì)醇激素檢測方法，其特征在于，將皮質(zhì)醇激素核酸適體與膠體金混合在一起，加入靶標(biāo)，再加入鹽，膠體金聚集顯色，吸收波長改變，檢測吸收波長的變化程度與皮質(zhì)醇激素的濃度成線性相關(guān)，達(dá)到檢測的目的。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于糖皮質(zhì)激素檢測技術(shù)領(lǐng)域的一種皮質(zhì)醇激素核酸適體及其應(yīng)用。該核酸適體包括序列表中SEQ ID No.1到SEQ ID No.10所示的核苷酸序列及其互補(bǔ)序列，以及這些序列的堿基被甲基化嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后的序列。本發(fā)明的皮質(zhì)醇激素核酸適體本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本，具有比抗體更高的親和性和特異性，便于標(biāo)記且可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對高溫和劇烈條件不敏感。
文檔編號C12Q1/68GK102660547SQ20121015417
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者弓景波, 張嶺, 錢令嘉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所