專利名稱：用于檢測萊姆病螺旋體的環(huán)介導等溫擴增法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及萊姆病螺旋體的檢測，具體地說，涉及用于檢測萊姆病螺旋體的環(huán)介導等溫擴增法。
背景技術(shù)：
萊姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋體(Bolrelia burgdorferi)弓丨起的一種慢性自然疫源性疾病。伯氏疏螺旋體是ー種單細胞的革蘭氏陰性螺旋體。該病主要是通過節(jié)肢動物蜱的叮咬在宿主動物與宿主動物及人之間傳播。萊姆病臨床表現(xiàn)初期多有典型皮膚損害--慢性游走性紅斑(ECM)，同時伴有頭痛、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲乏不適.局部淋巴結(jié)腫大等癥狀，后期表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、運動系統(tǒng)等呈間歇性、交替性出現(xiàn)的各種損害。具有分布廣、病程長、病死率較高等特點。如能早期診斷、早期治療?？扇?，否則會出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥。因此開發(fā)萊姆病螺旋體的早期快速檢測技木，對萊姆病早期診斷、早期治療具有重要的意義。目前萊姆病的主要診斷方法包括病原學檢測和特異性抗體檢測。病原學檢測包括直接鏡檢法、病原分離培養(yǎng)、多聚酶鏈反應(PCR)和熒光定量PCR(real-time PCR);常用的特異性抗體檢測包括間接免疫熒光抗體法(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和蛋白免疫印跡法(WB)。直接鏡檢法需要操作者具備豐富的檢驗經(jīng)驗，然而對于混合感染的情況，則無法檢測到，而且該法容易漏檢，與其他診斷方法相比，直接檢查的檢出率相對較低。病原分離培養(yǎng)法的分離率低，耗時較長，敏感性差。IFA只能檢測到菌體表面的抗原，靈敏度和特異性都比較低，且IFA受實驗因素影響大，易造成假陽性或假陰性。ELISA主要對萊姆病特異抗體IgG進行檢測，傳統(tǒng)ELISA檢測方法，存在非特異反應，雖然靈敏度高，但缺乏特異性，易誤診。WB可以判斷和驗證IFA和ELISA的真假陽性，但由于萊姆病螺旋體有不同的致病基因型，而這幾種基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各國應根據(jù)實際情況，制定出針對本國流行的基因型的WB陽性診斷標準，而且WB的操作比較復雜，不利于推廣。PCR技術(shù)的不足之處在于(I)靶基因易被污染；(2)易出現(xiàn)非特異性擴増；(3)擴增反應易受多種因素的影響；(4)需要投入比較昂貴的精密儀器(如PCR儀、凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng))；耗時長，需要2 3h的反應時間和I 2h的電泳時間。這些均不利于現(xiàn)場的快速檢測，給技術(shù)的基層推廣造成了極大障礙。2000年Notomi等開發(fā)了一種新的核酸等溫擴增方法，即環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),其特點是在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地擴增靶基因序列。目前LAMP技術(shù)主要應用于病原微生物的快速檢測，包括病毒、細菌、真菌、支原體、寄生蟲等，在臨床疾病診斷、食品衛(wèi)生檢驗及環(huán)境監(jiān)測方面應用廣泛，另外，LAMP也應用于動物胚胎的性別鑒定、腫瘤的基因檢測及原位擴增等。然而未見利用LAMP技術(shù)進行萊姆病螺旋體檢測的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種便于基層推廣使用的檢測萊姆病螺旋體的環(huán)介導等溫擴增法。本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的ー種用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物F3 :5 ’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3 ’ ；外側(cè)反向引物B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3 ’ ；內(nèi)側(cè)反向引物BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。本發(fā)明還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測萊姆病螺旋體的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述試劑盒中還包括Bst DNA聚合酶和/或反應緩沖液。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。本發(fā)明進一歩提供用于檢測萊姆病螺旋體的環(huán)介導等溫擴增法，包括步驟1)提取樣品中的DNA ;2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用上述LAMP引物組，進行LAMP擴增反應；3)分析產(chǎn)物，即對上述擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判定樣品中是否含有萊姆病螺旋體。其中，LAMP反應體系以25 μ I計為
模板DNA2μ1 20μΜ 引物FlP2μ20μΜ 引物BIP2μ! ΙΟμΜ引物F30.5μ1 ΙΟμΜ引物Β30·5μ1
8υ/μ1 Bst DNA 聚合酶Ιμ
2 X Reaction Mix12.5μ!ddH.O補足至 25μ1。LAMP反應條件為59-66 °C (優(yōu)選63 °C ) 60分鐘，冰上終止反應。用上述引物組對待測樣品DNA進行恒溫擴增，若電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)梯狀DNA條帶，則該樣品含有萊姆病螺旋體，若沒有擴增出條帶，則該樣品中不含萊姆病螺旋體。本發(fā)明將LAMP引物恒溫擴增技術(shù)用于萊姆病螺旋體的快速檢測，可從疑似病人血清中準確地檢測出萊姆病螺旋體。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR更高，可對不同致病基因型的萊姆病螺旋體進行檢測，對萊姆病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。


圖IA和圖IB為本發(fā)明LAMP引物組恒溫擴增結(jié)果；其中，圖IA中泳道1_5分別為萊姆病螺旋體B31、PD91、Fuji、FPU QX-S13，NC為陰性對照，圖IB泳道I為TO91，泳道2-12為8種立克次體屬的菌株和鉤端螺旋體、 布魯氏菌、大腸埃希菌共11種對照菌株。圖2為LAMP引物組恒溫擴增反應體系靈敏度檢測結(jié)果，其中，A1-A7分別代表重組質(zhì)粒濃度為 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、1.0Χ IO3Copies/ μ 1、1· OX IO2Copies/ μ 1、1· OX IO1Copies/ μ 1、1· OX IO0Copies/ μ I。圖3為普通PCR擴增反應體系靈敏度檢測結(jié)果，其中，M為IOObp Ladder, 1-7分別代表重組質(zhì)粒濃度為 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、
I.O X IO3Copies/ μ I、I. O X IO2Copies/ μ I、I. OX IO1Copies/ μ I、I. OX IO0Copies/ μ I, 8為陰性對照。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例均按照常規(guī)實驗條件，如SambiOOk等分子克隆實驗手冊(New York Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技術(shù)規(guī)程,或按照制造廠商所建議的實驗條件。實施例I用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP弓I物組的合成使用B31、PD91、Fujji, FPU QX-S13共5種萊姆病螺旋體菌株進行用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物的篩選。B31、Fuji購自美國ATCC，PD91、FP1、QX-S13由中國疾控中心傳染病所分離培養(yǎng)保存。使用日本榮研l(wèi)oopamp DNA擴增試劑盒(商品編號18001)，選取常用于 PCR 擴增反應的基因位點(fla、16SrDNA、rrf_rrl spacer、hbb、recA、ospA、ospC、groEL),用PrimerExplorer V4在線軟件設計LAMP引物并合成參數(shù)好的引物。用培養(yǎng)的B31、PD91、Fuji、FPl、QX-S13萊姆病螺旋體菌株篩選引物，相同條件下能使這5種菌株盡早達到陽性且峰高的引物為最佳引物。本發(fā)明的最佳引物為根據(jù)fla基因設計的引物。從GenBank數(shù)據(jù)庫中找到PBi-58125 (萊姆病螺旋體Brrelia gar ini i基因型的國外參考菌株)的全基因組序列，GenBank登錄號為NC_006156，并利用fla基因的普通PCR引物(正向引物5’ -AACACACCAGCATCACTTTCAGG-3，，反向引物5’ -GATTWGCRTGCGCAATCATTGCC-3’ )在DNAstar中找出fla的基因序列，根據(jù)此序列利用PrimerExplorer V4在線軟件設計LAMP引物，微調(diào)參數(shù)，GC含量從30% -65%調(diào)整為40% -65% ;5’ 末端 dG 將-3 改為-4。最終確定用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物 F3 :5 ’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3 ’ ；外側(cè)反向引物B3 :5 ’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3 ’ ；以及內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3 ’ ；內(nèi)側(cè)反向引物BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。弓丨物合成由上海生物工程有限公司完成。實施例2利用LAMP引物組檢測萊姆病螺旋體的特異性分析
I. I試劑和設備水浴鍋，LAMP試劑盒購自日本榮研公司。I. 2樣本來源本實施例中采用的5種萊姆病螺旋體菌株、8種立克次體屬的菌株和鉤端螺旋體、布魯氏菌、大腸埃希菌(表I)保存于中國疾控中心傳染病所或中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所。 表I用于LAMP檢測的樣本來源
編號_拉丁名_中文名_來源■
1B. burgdorferi sensu strict.。狹義伯氏螺旋體B31 ATCC 2B. garirrn伽氏疏螺旋體PD91中國
3B.garinii伽氏疏螺旋體FujiATCC
4B.afzelii阿弗西尼疏螺旋體FPI 中國
5B.valaisiana法雷斯疏螺旋體QX-S13 中國
6Rickettsia conorii斑點熱立克次體中國
7Rickettsia slovaca斑點熱立克次體中國, η
8Rickettsia hone斑點熱立克次體中國
9Coxiella burnettii貝納柯克斯體中國
10Orientia tsutsu^amushi東方春蟲病中國
11Bartonella Quintana巴爾通體中國
12Ehrlichiachaffeemis埃立克體中國
13Anaplasma DhagocytophUum無形體—國
14Leptospira spp鉤端螺旋體中國
15Brucellosis bacteria布魯氏菌中國
16Escherichia coli大腸埃希菌中國1.3 UNA 提取熱裂解法提取萊姆病螺旋體菌株DNA :將適量菌株接種BSKII培養(yǎng)基，33 °C培養(yǎng)7天，將培養(yǎng)好的菌株12000rpm離心30分鐘收集菌體，去上清；然后用PBS重懸洗滌，12000rpml離心30分鐘，PBS洗滌三遍，去上清；然后加適量ddH20重懸，100°C金屬浴煮10分鐘后3500rpm離心5分鐘，留取上清，4°C保存?zhèn)溆?。對照菌株DNA采用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒(商品編號69506)提取。I. 4 LAMP 反應
反應體系(25μ I)
模板DNA2μ1
20μΜ 引物FIP2μ1
20μΜ 引物BIP2μ!
ΙΟμν{引物F30.5μ1
ΙΟμΜ引物Β30.5μ!
SU/μΙ Bst 酶ΙμΙ 2 x Reaction Mix12.5μ!
CidH2O補足至 25μ1。LAMP反應條件為63°C，60分鐘，冰上終止反應。I. 5 結(jié)果對上述擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳檢測結(jié)果如圖IA和圖IB所示，圖IA泳道1-5為萊姆病螺旋體樣品，均能擴增出梯狀條帶；而圖1B，泳道I為萊姆病螺旋體菌株P(guān)D91，能擴增出梯狀條帶，泳道2-12為8種立克次體屬的菌株和鉤端螺旋體、布魯氏菌、大腸埃希菌，以及陰性對照(NC)均不產(chǎn)生條帶。該結(jié)果表明本發(fā)明引物組的特異性較好。
實施例3利用LAMP弓I物組檢測萊姆病螺旋體的靈敏度分析用LAMP外引物F3、B3作為引物PCR擴增TO91的fla基因，采用OMEGA公司的凝膠 提取試劑盒(商品編號D2500-01)膠回收純化PCR產(chǎn)物。然后用Takara公司的PMD-18TVector試劑盒(商品編號D102A)將純化的DNA與PMD-18T Vector連接，16°C水浴連接4小吋，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞(購自天根生化科技(北京)有限公司，簡稱天根公司)中。然后將大腸桿菌接種至含氨節(jié)西林(0. lmg/ml)的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，將長出的單個菌落分別擴大培養(yǎng)，然后采用天根公司的質(zhì)粒提取試劑盒(商品批號J9110)提取質(zhì)粒并進行克隆鑒定和濃度測定。將陽性克隆質(zhì)粒的濃度換算成質(zhì)粒拷貝數(shù)，采用的公式為
細樣品中檢測基因的拷貝數(shù)(οορ16φ1)=濃度(邶細)樣加德羅常數(shù)Xが然后用雙蒸水將質(zhì)粒稀釋到I. OX IO6Copies/ μ 1-1. OX IO0Copies/ μ I,共7個濃度梯度。然后采用日本榮研公司的loopamp DNA擴增試劑盒進行LAMP反應確定該LAMP方法的最低檢測下限，即敏感度。結(jié)果表明LAMP的敏感度可達到IO1c0Pies/μ I (圖2)，而普通PCR (引物為LAMP外引物F3和B3)的敏感度為IO2Copies/ μ I (圖3)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.用于檢測萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其特征在于，其包括 外側(cè)正向引物 F3 :5’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3’ ； 外側(cè)反向引物 B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 內(nèi)側(cè)正向引物 FIP :5’ -TGCAAATCTAITCTCTGGCGAAGGITGAGCACCTTCTTGAACA-3’ ； 內(nèi)側(cè)反向引物 BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGAITCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。
2.含有權(quán)利要求I所述LAMP引物組的用于檢測萊姆病螺旋體的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括BstDNA聚合酶和/或反應緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.用于檢測萊姆病螺旋體的環(huán)介導等溫擴增法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取樣品中的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用權(quán)利要求I所述的LAMP引物組，進行LAMP反應； 3)分析LAMP產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，LAMP反應體系以25yl計為模板DNA2^1 20|iiM 引物 FlP2)iii 20_ 引物BIP2pl I OmM 引物 F30.5^1 1OpM 引物 B30.5)iii 8U/4 Bst DNA聚合酶I叫 2X Reaction Mixi2.5f.ii ddH20補足至 25pl。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，LAMP反應條件為59-66°C，90分鐘，冰上終止反應。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，LAMP反應條件為63°C，60分鐘，冰上終止反應。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測萊姆病螺旋體的環(huán)介導等溫擴增法，其是采用引物FIP和BIP以及F3和B3(如Seq ID No.1-4所示)對待測樣品DNA進行恒溫擴增反應。本發(fā)明將LAMP引物恒溫擴增技術(shù)用于萊姆病螺旋體的快速檢測，可從疑似病人血清中準確地檢測出萊姆病螺旋體。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR更高，可對不同致病基因型的萊姆病螺旋體進行檢測，對萊姆病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。
文檔編號C12Q1/04GK102703587SQ20121015725
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者侯學霞, 張劉麗, 耿震, 郝琴 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所