專利名稱：一種巢式pcr法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的引物組及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢疫性病害檢驗(yàn)領(lǐng)域，尤其涉及一種巢式PCR法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的引物組及方法。
背景技術(shù)：
柑橘黑斑病(CitrusBlack Spot, CBS),由柑橘葉點(diǎn)霉菌(Phyllosticta citricarpa,有性態(tài)為柑橘球座菌Guignardia citricarpa)引起,主要危害柑橘果實(shí)，在果皮上形成病斑導(dǎo)致鮮果的商品性下降。CBS被歐盟列為Al類嚴(yán)禁入境的危險(xiǎn)性有害生物名單，也是美國嚴(yán)禁入境的有害生物(ΕΡΡ0. 2009. Guignardia citricarpa. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 39，318-327)，我國、巴西、阿根廷和南非等有柑橘黑斑病發(fā)生，出口柑橘到歐盟和美國均受檢疫法規(guī)的限制，一旦在其進(jìn)口國口岸被檢出有黑斑病的果實(shí)，就無條件被退貨。因此，作為出口國，首先需對出口的柑橘進(jìn)行嚴(yán)格的檢查，以免遭退貨帶來的損失。最近研究發(fā)現(xiàn)，我國柑橘存在四種葉點(diǎn)霉屬真菌，即柑橘葉點(diǎn)霉菌(P. citricarpa),亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌(P. citriasiana),中國柑橘葉點(diǎn)霉菌(P. citrichinaensis),以及內(nèi)生菌P. capitalensis,前兩者均是柑橘上的重要病原菌,而后兩者則是常見的，但無致病性的或只能引起微弱癥狀的內(nèi)生菌。歐盟和美國只是對柑橘葉點(diǎn)霉菌(P. citricarpa)實(shí)施檢疫(ΕΡΡ0. 2009. Guignardia citricarpa. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 39,318-327)。傳統(tǒng)的黑斑病診斷方法包括癥狀檢查，病菌的顯微鏡檢查，分離培養(yǎng)。采用癥狀檢查時(shí)，果實(shí)癥狀易與褐斑病、炭疽病和黑點(diǎn)病混淆；采用顯微鏡檢查時(shí)，有些病斑不存在子實(shí)體，無法經(jīng)顯微鏡檢查判斷；采用分離培養(yǎng)時(shí)，子實(shí)體的誘導(dǎo)和分離培養(yǎng)均需7-14d時(shí)間，這對需要快速通關(guān)的鮮果柑橘的出口來說顯然存在嚴(yán)重的缺陷。盡管國外發(fā)展了病斑PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR技術(shù)用于進(jìn)口柑橘的檢測，但已有的技術(shù)僅考慮柑橘葉點(diǎn)霉菌和內(nèi)生菌P. capitalensis,而無法將柑橘葉點(diǎn)霉菌、亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌和中國柑橘葉點(diǎn)霉菌分開。因此，出口柑橘的黑斑病檢疫急需一套將柑橘葉點(diǎn)霉菌和柑橘上其他3種葉點(diǎn)霉菌區(qū)分開的準(zhǔn)確，靈敏，且快速的檢測技術(shù)。巢式PCR (nested PCR)是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種PCR技術(shù)，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面。其原理是設(shè)計(jì)兩對引物，第一對PCR引物擴(kuò)增片段較長，第二對引物結(jié)合在第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增片段。其優(yōu)點(diǎn)是提高了 PCR擴(kuò)增的靈敏度，保障了反應(yīng)的特異性、準(zhǔn)確性。由于以往發(fā)表的文章僅設(shè)計(jì)了針對于柑橘葉點(diǎn)霉菌P. citricarpa和內(nèi)生菌P. capitalensis的特異性引物，并沒有針對于亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌P. citriasiana的特異性引物，且設(shè)計(jì)的針對于P. citricarpa的特異性引物無法將柑橘葉點(diǎn)霉菌和亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌區(qū)分，本實(shí)驗(yàn)室在ITSl區(qū)域設(shè)計(jì)了針對于亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的特異性弓I物Pca8/ITS4,該引物特異性好，靈敏度高(Wang X. H.，Chen G. Q.，Huang F.，etal.Phyllosticta species associated with citrus disease in China. FungalDiversity. 2011, 52(1):209_224)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種巢式PCR法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的引物組，用于柑橘黑斑病相關(guān)的四種葉點(diǎn)霉屬真菌的同時(shí)檢測，具有特異性好、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、快速簡便的特點(diǎn)。一種巢式PCR法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的引物組，包括四對引物第一對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 5 所示；第二對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 2所示，下游引物的堿基序列如 SEQ ID NO. 5 所示；第三對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 5 所示；第四對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 5 所示。所述的四對引物的上游引物通過如下方法設(shè)計(jì)獲得通過比較柑橘上四種葉點(diǎn)霉屬真菌代表菌株的ITSl和18S區(qū)域序列，設(shè)計(jì)出針對柑橘葉點(diǎn)霉菌、中國柑橘葉點(diǎn)霉菌和內(nèi)生菌P. capitalensis的特異性上游引物Pd, Pccl和Pct4 ;結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的針對亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的特異性上游引物Pca8 (Wang et al.，2011)，以及真菌的通用下游引物 ITS4 (White, T. J. , Bruns, T. , Lee, S. and Taylor, J. Amplificationand direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In:PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications. Academic Press,San Diego,U.S. A. 1990，315-322.)，獲得針對柑橘葉點(diǎn)霉菌、中國柑橘葉點(diǎn)霉菌、內(nèi)生菌P. capitalensis和亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的引物對Pcl/ITS4，Pccl/ITS4，Pct4/ITS4和Pca8/ITS4。所述的四對引物的合成方法可以采用常規(guī)操作方法。本發(fā)明提供了一種巢式PCR法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的方法，包括(I)提取待測菌的DNA;(2)以提取的DNA為模板，利用真菌通用引物ITS4/ITS5進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(3)將第一輪PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物稀釋50-100倍，以稀釋后的產(chǎn)物為模板，利用上述四對引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(4)將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離、染色，根據(jù)擴(kuò)增條帶判定待測菌的種類。步驟(I)中，所述待測菌的DNA可以從待測菌的純培養(yǎng)菌絲或柑橘上的疑似病斑中提取。步驟(2)中，所述的真菌通用引物的上游引物ITS4的堿基序列如SEQ ID NO. 5所示，下游引物ITS5的堿基序列如SEQ ID NO. 6所示。引物ITS4/ITS5可以擴(kuò)增18S rRNA3'端的部分區(qū)域，第一個(gè)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1，5.8S rRNA，第二個(gè)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2，以及28S rRNA 5'端的部分區(qū)域。所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度優(yōu)選為
0.2-0. 3mmol/L ;更優(yōu)選為0. 25mmol/L。合適的引物濃度能提高第一輪PCR擴(kuò)增效率。
進(jìn)一步優(yōu)選地，第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為模板DNA10_50ng，弓丨物ITS4/ITS5 (濃度 5mmol/L)各 I μ L，10 X PCR buffer (含 Mg2+) 2 μ L、dNTP (IOmmoI/L)0. 4 μ L, Taq酶(5U/ μ L) (λ 2 μ L，雙蒸水補(bǔ)足至20 μ L，混勻。所述的第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件優(yōu)選為94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。該退火溫度可擴(kuò)增出所有真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)。步驟(3)中，模板DNA經(jīng)第一輪PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度較高，直接以其作為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增容易產(chǎn)生非特異性條帶，將其稀釋50-100倍，能有效減少第二輪擴(kuò)增中非特異性產(chǎn)物的形成，提高擴(kuò)增效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
優(yōu)選地，所述的四對引物在第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度分別為
第一對引物 0.1-0.2mmol/L;
第二對引物 O.丨-0.2mmol/L;
第三對？ j 物 O.I-0.2 mmol/L;
第四對弓 j 場0.3-0,4 mrnoi/L。更優(yōu)選地，所述的四對引物在第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度分別為
第一對引物0.15mmol/L;
第二對引物0.15 mmol/L;
第三對引物0.15 mmol/L;
第四對引物 0.375 mmol/L。引物濃度過高易引起模板與引物錯(cuò)配，PCR反應(yīng)的特異性下降，同時(shí)形成引物二聚體的幾率增大；引物濃度過低，引物與模板的結(jié)合率降低，PCR產(chǎn)物減少；當(dāng)引物組合終濃度如上所述時(shí)第二輪PCR擴(kuò)增效率最高。進(jìn)一步優(yōu)選地，第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為在20 μ L反應(yīng)體系中加入引物Pcl/ITS4、Pccl/ITS4、Pct4/ITS4 (濃度均為 5mmol/L)各 0. 6 μ L, Pca8/ITS4 (濃度為 5mmol/L)
I.5 μ L，10 X PCR buffer (含 Mg2+) 2 μ L, dNTP (lOmmol/L) 0· 5 μ L，Taq 酶(5U/ μ L) O. 4 μ L，稀釋后的PCR產(chǎn)物I μ L，雙蒸水補(bǔ)足20 μ L，混勻。所述的第二輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件優(yōu)選為94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。當(dāng)引物退火溫度為60°C，引物的特異性最好。步驟(4)中，所述的凝膠電泳可以采用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，對擴(kuò)增產(chǎn)物的分離效果較好；所述的染色可以采用EB染色。根據(jù)擴(kuò)增條帶判定待測菌的種類時(shí)，具體可以通過如下方法四種菌的標(biāo)準(zhǔn)菌和待測菌同時(shí)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，將待測菌的擴(kuò)增條帶與標(biāo)準(zhǔn)菌的擴(kuò)增條帶比較，根據(jù)條帶大小及位置判定待測菌的種類。本發(fā)明采用的巢式PCR法為巢式多重PCR法，即第二輪PCR擴(kuò)增體系中加入四對引物(針對基因組的不同位點(diǎn))，各引物對能獨(dú)立地?cái)U(kuò)增出種的特異性產(chǎn)物。該方法操作快捷、簡單，可避免倒換樣品時(shí)造成的模板污染和時(shí)間浪費(fèi)，更利于實(shí)際檢驗(yàn)。本發(fā)明根據(jù)柑橘上四種葉點(diǎn)霉屬真菌的ITSl及18S區(qū)域序列的差異，設(shè)計(jì)了針對每個(gè)種的特異性上游引物，結(jié)合共同的下游引物ITS4，獲得了四對特異性引物。利用這四對特異性引物結(jié)合真菌通用引物，通過果皮病斑總DNA提取方法和PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，獲得了一種能在同一個(gè)反應(yīng)管里、5小時(shí)內(nèi)對果面疑似黑斑病病斑或培養(yǎng)菌落菌種種類進(jìn)行判定的巢式PCR檢測鑒定技術(shù)。本發(fā)明的各對引物特異性高，利用該引物組在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中即可檢測出來自柑橘的葉點(diǎn)霉屬真菌的種類；與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、快速便捷、易于操作等特點(diǎn)，適合于進(jìn)出口檢疫部門、出口企業(yè)和科研單位的使用。采用本發(fā)明方法，能有效提高歐盟等國家對攜帶柑橘葉點(diǎn)霉菌果實(shí)的檢疫效率，縮短貨物在港口停留時(shí)間，并降低由于長時(shí)間滯留、待檢而造成的損失，同時(shí)還能根據(jù)疑似培養(yǎng)物或病斑的葉點(diǎn)霉屬真菌種類進(jìn)行后續(xù)防疫。


圖I為本發(fā)明弓丨物序列設(shè)計(jì)圖。圖2為本發(fā)明柑橘葉點(diǎn)霉菌引物(Pcl/ITS4)特異性驗(yàn)證試驗(yàn)的凝膠電泳圖；其中，M IOObp Plus II DNALadder ； 1-4 :柑橘葉點(diǎn)霉菌;5_8 :P. capitalensis ;9_12 :亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌；13-16 :中國柑橘葉點(diǎn)霉菌。圖3為本發(fā)明P. capitalensis引物(Pct4/ITS4)特異性驗(yàn)證試驗(yàn)的凝膠電泳圖；其中，M IOObp Plus II DNALadder ； 1-4 :Ρ· capitalensis ;5_8 :柑橘葉點(diǎn)霉菌;9_12 :亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌；13-16 :中國柑橘葉點(diǎn)霉菌。圖4為本發(fā)明中國柑橘葉點(diǎn)霉菌引物(Pccl/ITS4)特異性驗(yàn)證試驗(yàn)的凝膠電泳圖；其中，M:100bp Plus II DNA Ladder ; 1-4 :中國柑橘葉點(diǎn)霉菌；5-8 :Ρ· capitalensis ;9-12 :亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌；13-16 :柑橘葉點(diǎn)霉菌。圖5為本發(fā)明巢式PCR檢測柑橘四種葉點(diǎn)霉菌的電泳圖譜；其中，M 100bp Plus
IIDNA Ladder ；1 :四種標(biāo)準(zhǔn)菌同時(shí)存在；2_5 :分別為四種標(biāo)準(zhǔn)菌；6_12 :待測樣品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、菌株類型柑橘上四種葉點(diǎn)霉屬真菌柑橘葉點(diǎn)霉菌(P. citricarpa)、葉點(diǎn)霉屬內(nèi)生菌P. capitalensis、亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌(P. citriasiana)和中國柑橘葉點(diǎn)霉菌(P. citrichinaensis)的菌株均經(jīng)過形態(tài)學(xué)和測序證實(shí)。保藏于浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所李紅葉教授實(shí)驗(yàn)室和中國科學(xué)研究院微生物研究所菌種保存中心，菌種向公眾開放。且上述菌株均為實(shí)驗(yàn)材料，無特異性要求。2、待測樣品及DNA提取用刀片切下待測病果的病斑2-3個(gè)(6_8mg)(盡量除去健康的白皮層)，刮取從發(fā)病果實(shí)分離獲得的純培養(yǎng)物的菌絲，提取DNA，具體方法如下 A.將上述獲得的病斑或菌絲(約50-200mg)置于2mL Eppendorf管中，力口800yLSLS 裂解液(200mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, 200mmol/L NaCl, 2g/100mlN-月桂酰肌氨酸鈉，pH 8.0)，用無菌牙簽充分?jǐn)嚢璺稚⒕z，病斑加液氮研磨，55°C水浴10_30min,其間振蕩混勻 2-3 次，13200r/min 離心 IOmin ；B.取上清液750 μ L于I. 5mL Eppendorf管中，加入等體積氯仿和異戍醇(體積比24:1)的混合溶劑抽提DNA, 13200r/min離心IOmin ；C.取上清液于新的I. 5mL Eppendorf管中，加2倍體積無水乙醇混合混勻，_2(TC靜置 IOmin 后，于 4°C，13200r/min 離心 4min,沉淀 DNA ；D.用70%無水乙醇洗滌沉淀，沉淀于室溫放置自然干燥5-10min，溶于40 μ L TE溶液(pH 8.0)，-20°C保存?zhèn)溆谩?、引物設(shè)計(jì)通過比較柑橘上四種葉點(diǎn)霉屬真菌代表菌株的ITSl和18S區(qū)域序列，設(shè)計(jì)出針對柑橘葉點(diǎn)霉菌、中國柑橘葉點(diǎn)霉菌和內(nèi)生菌P. capitalensis的特異性上游引物Pel，Pccl和Pct4,并利用軟件Primer Premier 5. O檢驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物，同時(shí)獲得引物的退火溫度。設(shè)計(jì)圖見圖I。然后結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的針對亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的特異性上游引物Pca8(Wanget al.，2011)，以及真菌的通用下游引物ITS4(White et al.，1990)，獲得針對柑橘葉點(diǎn)霉菌、中國柑橘葉點(diǎn)霉菌、內(nèi)生菌P. capitalensis和亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的引物對Pcl/ITS4，Pccl/ITS4, Pct4/ITS4和Pca8/ITS4，具體引物序列見表I。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小見表I。表I檢測柑橘葉點(diǎn)霉菌、中國柑橘葉點(diǎn)霉菌、P. capitalensis和亞洲柑橘葉點(diǎn)霉
菌的引物
權(quán)利要求
1.一種巢式PCR法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的引物組，其特征在于，包括四對引物 第一對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物的堿基序列如SEQ IDNO. 5所示； 第二對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 2所示，下游引物的堿基序列如SEQ IDNO. 5所示； 第三對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物的堿基序列如SEQ IDNO. 5所示； 第四對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物的堿基序列如SEQ IDNO. 5所示。
2.一種巢式PCR法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的方法，包括 (1)提取待測菌的DNA; (2)以提取的DNA為模板，利用真菌通用引物ITS4/ITS5進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增； (3)將第一輪PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物稀釋50-100倍，以稀釋后的產(chǎn)物為模板，利用權(quán)利要求I所述的四對引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增； (4)將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離、染色，根據(jù)擴(kuò)增條帶判定待測菌的種類。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度為0. 2-0. 3mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度為0. 25mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的四對引物在第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度分別為第一對引物 0.1-0.2 mmol/L;第二對引物 0.1 -0.2 mmol/L;第三對引物0.1 -0.2 mmol/L;第四對引物 0.3-0.4 mmol/L
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的四對引物在第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度分別為第一對引物 0.15 mmol/L;第二對引物 0.15 mmol/L;第三對引物 0.15 mmol/L;第四對引物 0.375 mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的第二輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巢式PCR法檢測葉點(diǎn)霉屬真菌的引物組及方法，該引物組包括四對引物，其中，第一對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO.5所示；第二對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO.5所示；第三對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO.5所示；第四對引物上游引物的堿基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID NO.5所示。采用本發(fā)明的引物組通過巢式PCR法檢測柑橘黑斑病相關(guān)的葉點(diǎn)霉屬真菌，特異性好，可實(shí)現(xiàn)四種葉點(diǎn)霉屬真菌的同時(shí)檢測，具有準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、快速簡便的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK102649980SQ20121015739
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者侯欣, 李紅葉, 王興紅, 黃峰 申請人:浙江大學(xué)