專利名稱：一種水稻抗稻瘟病蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種水稻抗稻瘟病蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在生長發(fā)育過程中會(huì)受到各種病原微生物的侵襲，雖然植物不具備主動(dòng)“趨利避害”的能力，但在長期與各種病原微生物共進(jìn)化過程中，植物形成了對病原微生物精確的信號(hào)感知與防御系統(tǒng)。植物先天免疫主要包括三方面內(nèi)容基礎(chǔ)抗性、抗病基因介導(dǎo)的抗性以及系統(tǒng)獲得性抗性。其中抗病基因介導(dǎo)的抗性由于反應(yīng)時(shí)間快，抗病反應(yīng)強(qiáng)烈，常常伴 隨著病原菌侵染點(diǎn)的超敏反應(yīng)以及細(xì)胞程序化死亡，使其成為植物抗病的一個(gè)重要組成部分。Flor在研究亞麻銹病抗性基因遺傳時(shí)提出了“基因?qū)颉睂W(xué)說，其具體表述為病原菌不同的小種帶有不同的無毒基因，當(dāng)植物中的抗病基因能夠特異識(shí)別病原菌當(dāng)中的無毒基因時(shí)，就能通過信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)抗病反應(yīng)。因此對植物抗病基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析與研究，是了解植物抗病機(jī)制的基礎(chǔ)。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主要食物。稻瘟病是水稻最主要的病害之一,全球每年因稻瘟病造成的水稻減產(chǎn)達(dá)11% 30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)40% 50%，甚至顆粒無收。實(shí)踐證明，利用含有抗稻瘟病基因的水稻品種是應(yīng)對稻瘟病危害的有效辦法之一。到目前為止，在水稻中定位的抗稻瘟病基因有近百個(gè)，已經(jīng)克隆的有 21 個(gè)，它們分別是 Pib, Pi-ta、Pi9、Piz_t、Pi2、Pid2、Pi36、Pi37、Rbr2、Pik-m、Pi5、Pid3、pi21、Pit、Pbl、Pish、Pik-p、Pik、Pia、Pi54 和 Pi25，其中除了基因 Pid2 編碼一個(gè)絲蘇氨酸受體類似激酶以及隱性抗稻瘟病基因Pi21編碼一個(gè)富脯氨酸蛋白外，其他19個(gè)抗稻痕病基因全都屬于 Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat(NBS-LRR)S因家族。NBS-LRR基因由N端保守的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和C端富亮氨酸重復(fù)(LRR)區(qū)域構(gòu)成，在LRR區(qū)域，由數(shù)十個(gè)(一般15 40個(gè))不完全的LRR結(jié)構(gòu)構(gòu)成。盡管目前已經(jīng)克隆了 21個(gè)抗稻瘟病基因，但因?yàn)榈疚敛【》N眾多且變異速度快，所以，克隆更多的抗稻瘟病基因以應(yīng)對稻瘟病的危害就顯得尤為重要。NBS-LRR類基因在植物基因組中廣泛存在，在已經(jīng)測序的水稻和擬南芥中，NBS-LRR類基因均占了所有編碼基因數(shù)目的1%以上。對目前已經(jīng)克隆的抗稻瘟病基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，21個(gè)基因中有19個(gè)屬于NBS-LRR類基因家族，我們有理由相信，水稻中抗稻瘟病基因絕大多數(shù)應(yīng)該是屬于NBS-LRR類基因家族。更重要的是這19個(gè)NBS-LRR基因中有12個(gè)都是等位基因，其中Pi37/Pish位于第一號(hào)染色體上；Pib/Rbr2位于第二號(hào)染色體上；Piz-t/Pi2/Pi9位于第六號(hào)染色體上，距離不遠(yuǎn)的位置是Pid3/Pi25 ；Pik/Pik-p/Pik-m位于第十一號(hào)染色體上。那么我們也有理由相信，在鑒定出的將近一百個(gè)抗稻瘟病基因中，很多都應(yīng)該是互為等位的。目前，一般認(rèn)為變異較大的LRR結(jié)構(gòu)域決定了此類抗病基因?qū)Σ≡R(shí)別的專化性。目前，對抗稻瘟病基因的克隆還是主要依靠圖位克隆，雖然秈稻9311和粳稻日本晴都有了全基因組序列，為水稻基因的圖位克隆帶來了巨大方便，但對于抗稻瘟病基因的克隆來說，依然還存在很多困難。比如對精細(xì)定位群體內(nèi)各單株的稻瘟病抗性鑒定，不僅工作量巨大，而且田間稻瘟病發(fā)病情況還很容易受環(huán)境影響，造成性狀統(tǒng)計(jì)錯(cuò)誤，而不能準(zhǔn)確定位；另外，從已經(jīng)測序的9311和日本晴基因組序列來看，NBS-LRR基因大多都是成簇存在，即使能夠?qū)⒛繕?biāo)基因定位到某一區(qū)段，也很難判斷成簇基因中的哪一個(gè)才是真正的抗病基因；再者，目前利用的水稻品種遺傳背景狹窄，可利用的抗稻瘟病基因不多。然而在野生稻中卻蘊(yùn)藏豐富的抗病基因資源，由于目前對野生稻的研究還處于起步階段，沒有精細(xì)遺傳圖譜和物理圖譜，要利用圖位克隆其中抗稻瘟病基因顯然更是困難重重。因此，我們可以直接利用已經(jīng)克隆的NBS-LRR型基因序列信息，克隆其在野生稻或者其他對稻瘟病具有高抗效應(yīng)的水稻品種中的同源基因，直接轉(zhuǎn)化易感稻瘟病的水稻品種，從而篩選出具有更優(yōu)良抗性的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻抗稻瘟病蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為PID3-A4,來源于普通野生稻(Oryza. rufipogon)A4，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗稻瘟病相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列I所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變。其中，序列表中的序列2由924個(gè)氨基酸殘基組成。為了便于PID3-A4蛋白的純化，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。表標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個(gè))RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個(gè))HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
上述(a)中的PID3-A4蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的PID3-A4蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列I所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上上表所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述PID3-A4蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述PID3-A4蛋白的基因(名稱為Pid3-A4)，所述Pid3-A4基因?yàn)槿缦翴)-4)中任一所述的DNA分子I)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子； 2)序列表中序列I所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)所限定的DNA分子雜交且編碼所述PID3-A4蛋白的DNA分子；4)與I)或2)所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且編碼所述PID3-A4蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65° C下雜交，然后用2XSSC，0. 1%SDS 和 I X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。其中，序列I由2775個(gè)核苷酸組成，整個(gè)序列I即為所述Pid3_A4基因的編碼序列，編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)(所述PID3-A4蛋白)。含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在 植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以稻瘟病菌接種篩選轉(zhuǎn)化植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述Pid3_A4基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為35S啟動(dòng)子。更為具體的，所述重組表達(dá)載體為在PZHOl載體的多克隆位點(diǎn)處插入所述Pid3-A4基因得到的重組質(zhì)粒。所述多克隆位點(diǎn)具體為Xba I和Kpn I。所述PZHOl 載體在 Xiao, H.，Wang, Y.，Liu, D.，Wang, W.，Li, X.，Zhao, X.，Xu, J.，Zhai, ff. and Zhu, L. (2003)Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 byRNA interference. Plant Mol. Biol. 52, 957 - 966.中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述Pid3_A4基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述Pid3_A4基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。所述PID3-A4蛋白，或所述核酸分子，或所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在如下al)或a2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍 al)調(diào)控植物對稻瘟病的抗性；a2)選育抗稻瘟病植物品種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述調(diào)控植物對稻瘟病的抗性具體為提高植物對稻瘟病的抗性。所述選育抗稻瘟病植物品種的方法，具體可包括將所述PID3-A4蛋白表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗稻瘟病轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括如下步驟將編碼所述PID3-A4蛋白的基因?qū)肽康闹参镏?，獲得抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述基因；所述基因(即Pid3-A4基因)是如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)所限定的DNA分子雜交且編碼所述PID3-A4蛋白的DNA分子；4)與I)或2)所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且編碼所述PID3-A4蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65° C下雜交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。所述Pid3_A4基因具體可通過上述任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中，得到所述轉(zhuǎn)基因植物。具體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)等生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。所述稻痕病由下述稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小種中的至少一種引起JS2001-108-1、Zhongl0-8-14、97-27-2、03-10-66-l、07-31-l-2、03-10-76-3、10-25-1-1、10-32-2-1、03-1卜37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-1、07-26-22,09-87-2-1, Y34,99-26-2, CH706 和 99-20-2。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物如水稻。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具體為水稻品種TP309。
擴(kuò)增所述PID3-A4基因的全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的PID3-A4蛋白及其編碼基因可用于培育抗稻瘟病植物新品種，特別是對由下述稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小種中的至少一種弓I起的稻痕病表現(xiàn)出抗性JS2001-108-l、Zhongl0-8-14、97-27-2、03-10-66-l、07-31-l-2、03-10-76-3、10-25-卜I、10-32-2-1、03-1卜37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-l、07-26-22、09-87-2-l、Y34、99-26-2、CH706 和 99-20-2。這將有利于對水稻品種的改良，對擴(kuò)大作物種植范圍，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。


圖I為抗稻瘟病基因Pid3_A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。其中，泳道I為Pid3_A4基因的PCR產(chǎn)物；泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2為重組表達(dá)載體PZH01-Pid3_A4的質(zhì)粒圖譜。 圖3為Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系分子鑒定結(jié)果。其中，HPT為針對潮霉素抗性基因的PCR檢測結(jié)果；CAPS為針對Pid3-A4基因的PCR擴(kuò)增-BamH I酶切檢測結(jié)果。圖4為Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系中Pid3_A4基因過表達(dá)分析及其對稻瘟病菌zhong-10-8-14的抗性表型。圖5為轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系中Pid3_A4基因的表達(dá)和對稻瘟病抗性之間相關(guān)性的分析。其中，Hpt為針對潮霉素抗性基因的PCR檢測結(jié)果；CAPS為針對Pid3-A4基因的PCR擴(kuò)增-BamH I酶切檢測結(jié)果。圖6為轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系中Pid3_A4基因表達(dá)的特性分析結(jié)果。其中，A為接囷組；B為接水組。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、抗稻瘟病基因Pid3_A4的獲得本實(shí)施例利用從水稻地方栽培種地谷中克隆的抗稻瘟病基因Pid3序列信息分離克隆普通野生稻(Oryza. rufipogon) A4中的抗稻痕病同源基因。I、水稻抗稻瘟病基因Pid3序列信息的獲得抗稻瘟病基因Pdi3是從水稻地方栽培種地谷中克隆得到的，它對粳稻區(qū)稻瘟病菌小種具有較好的抗性，其中用來定位克隆的鑒別小種為粳稻區(qū)稻瘟病菌小種zhong-10-8-14。從 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上獲得地谷中抗稻痕病基因Pid3全基因序列(GenBank: FJ745364. I的第3010-5784位)，Pid3基因全長2775bp，不含有內(nèi)含子，編碼一個(gè) N 端 non-TIR、non-CC 的含一段保守 motif RSLALSIEDVVD (78_89aa)的NBS-LRR蛋白。NBS結(jié)構(gòu)域由第158位到466位氨基酸編碼，在565位到924位氨基酸間有13個(gè)不完整的LRR。2、利用地谷Pid3基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增野生稻A4中Pid3的同源基因Pid3_A4I)引物設(shè)計(jì)根據(jù)地谷中Pid3基因序列(GenBank:FJ745364. I的第3010-5784位)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增野生稻 A4 (Shang, J. J. et al. , 2009Identification of a New Rice BlastResistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-Rich Repeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Geneticsl82:1303-1311)中的同源基因。所設(shè)計(jì)的引物如下d3F :5’ -atggcggagggtgttgtgggctc-3，(序列 I 的前 23 位)d3R :5’ _ttattgaatcctttctgcagcc_3’(序列 I 的后 22 位的反向互補(bǔ)序列)為了便于后續(xù)將所擴(kuò)增的Pid3同源基因連入表達(dá)載體的試驗(yàn)，在此上下游引物中分別加入含有保護(hù)堿基的Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)序列，得到引物如下Pid3F :5’-TTTCTAGAatggcggagggtgttgtgggctc_3’ (下劃線處為 Xba I 的識(shí)別序列) Pid3R :5’ _CTGGTACCttattgaatcctttctgcagcc_3，(下劃線處為 Kpn I 的識(shí)別序列)2)抗稻瘟病基因Pid3_A4的獲得以野生稻A4的葉片基因組DNA為模板，用引物Pid3F和Pid3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25iiI) :10XPCR 緩沖液 2. I ;dNTP Mixture (2. 5mM) 2. 5 u I ；KOD 酶(5U/ii I) 0. I ;引物 Pid3F 和 Pid3R (均 IOmM)各 0. 25 y I ;模板(DNA) I u I ；MgSO4 (25mM) I. 6u I ；DMS0 I. 6u I ;ddH20 補(bǔ)充至 25u I0反應(yīng)條件先94°C預(yù)變性4min ;然后94°C變性30S，58°C退火30S，68°C延伸3min，共30個(gè)循環(huán)；最后68°C延伸5min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增得到大小約為3000bp的目的條帶(圖I)。切下該目的條帶，純化回收后將PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子搖菌并提取質(zhì)粒，送樣測序。測序表明該P(yáng)CR產(chǎn)物含有序列表中序列I所示的核苷酸序列，其序列具體為TTTCTAGA+序列1+GGTACCAG (下劃線部分分別為Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)的識(shí)別序列)。其中，序列I由2775個(gè)核苷酸組成，整個(gè)序列I為一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由924個(gè)氣基酸殘基組成。將序列I所不基因命名為Pid3-A4，將該基因編碼的蛋白質(zhì)命名為PID3-A4。3、對獲得的同源基因Pid3_A4序列進(jìn)行分析利用DNAMAN 軟件對地谷中 Pid3 基因(GenBank:FJ745364. I 的第 3010-5784 位)和野生稻A4中Pid3-A4基因(序列I)序列相似性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，地谷中Pid3基因和野生稻M中的Pid3-A4基因相似度很高，達(dá)到了 99. 5%，一共只有14個(gè)堿基差異。利用在線基因預(yù)測軟件(http://linuxl. softberry. com)對序列I進(jìn)行基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)序列I只含有一個(gè)0RF，沒有內(nèi)含子存在，這與地谷中Pid3基因結(jié)構(gòu)特征一致。將野生稻A4中Pid3-A4基因編碼的氨基酸序列(序列2)利用在線軟件(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)分析發(fā)現(xiàn)，它也編碼一個(gè)NBS-LRR蛋白，并且保守區(qū)域NBS的位置和地谷中Pid3的位置一樣，都由第158-466位的氨基酸編碼，并且二者間只存在9個(gè)氨基酸的差異，其中6個(gè)位于LRR區(qū)域，一個(gè)位于NBS區(qū)域，其他兩個(gè)在N末端。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)Pid3_A4基因水稻的獲得及其功能研究一、轉(zhuǎn)Pid3_A4基因水稻的獲得
I、重組表達(dá)載體PZH01-pid3_A4的構(gòu)建將實(shí)施例I得到的PCR產(chǎn)物(TTTCTAGA+序列1+GGTACCAG)經(jīng)討Xba I和Kpn I酶切，得到的片段與經(jīng)過同樣酶切植物雙元表達(dá)載體PZHOl (Xiao, H.，Wang, Y.，Liu, D.，Wang, ff. , Li, X. , Zhao, X. , Xu, J. , Zhai, ff. and Zhu, L. (2003) Functional analysis of therice AP3 homologue 0sMADS16 by RNA interference. Plant Mol. Biol. 52, 957-966.公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)的載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子搖菌并提取質(zhì)粒，送樣測序。將經(jīng)測序表明在PZH01載體的Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)之間插入序列表中序列I所示的Pid3_A4基因的重組質(zhì)粒命名為PZH01-Pid3-A4，該質(zhì)粒即為重組表達(dá)載體，其質(zhì)粒圖譜如圖2所示。2、轉(zhuǎn)Pid3_A4基因水稻的獲得
將步驟I構(gòu)建的重組表達(dá)載體PZH01-pid3_A4通過電擊轉(zhuǎn)化方法(Hiei，Y.，S.Ohta, T. Komari and T. Kumashiro, 1994 Efficient transformation of rice (Oryzasativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA. Plant J. 6:271-282.)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404(Chen, X.，et al., (2006) A B-Iectinreceptor kinase gene conferring rice blast resistance. Plant J. 46:794 - 804.公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)中得到轉(zhuǎn)化子。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)入PZH01空載體的對照。將轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體PZH01-pid3-A4的農(nóng)桿菌LBA4404命名為LBA4404/PZH01-pid3-A4 ;將轉(zhuǎn)入 PZH01 空載體的農(nóng)桿菌 LBA4404 命名為 LBA4404/PZH01。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻成熟種子愈傷組織的方法(Hiei, Y.，S. Ohta, T. Komariand T. Kumashiro, 1994 Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. )mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. PlantJ. 6:271-282.)將上述制備的重組農(nóng)桿菌 LBA4404/PZH01-pid3-A4 (或 LBA4404/PZH01)導(dǎo)入到水稻品種 TP309 (Junjun Shang. , et al. Identification of a New Rice BlastResistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-RichRepeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Genetics, 2009 年，182:1303-1311,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)中，獲得了 21個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體PZH01-pid3-A4的轉(zhuǎn)Pid3-A4基因株系和8株轉(zhuǎn)入PZH01空載體的對照株。3、分子檢測(I)對 Pid3_A4 基因的 PCR 檢測利用CAPS標(biāo)記對上述步驟2獲得的轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系和轉(zhuǎn)入PZH01空載體的對照株進(jìn)行DNA水平上的分子檢測，具體如下分別以上述步驟2獲得的Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系和轉(zhuǎn)入PZH01空載體的對照株的基因組DNA為模板，以Pid3JF和Pid3JR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻作為對照。Pid3JF :5' -TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC-3'(序列 I 的第 2057-2080 位)Pid3JR :5' -ACGTCACAAATCATTCGCTC-3'(對應(yīng)于序列 I 的第 2695-2714 位)上述引物不僅可以擴(kuò)增外源Pid3_A4基因的一段658bp的片段(序列I的第2057-2714位)，還可以擴(kuò)增TP309水稻內(nèi)源Pid3_tp309基因(Pid3的同源基因)的一段658bp的片段(GenBank FJ745366. I的第2071-2728位)，但由于來自Pid3_A4基因的片段含有一個(gè)BamH I酶切位點(diǎn)(序列I的第2204位)，而Pid3_tp309基因由于此處一個(gè)堿基的差異沒有這個(gè)酶切位點(diǎn)，所以可以通過用限制性內(nèi)切酶BamH I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，從而檢測TP309中是否成功轉(zhuǎn)入了 Pid3-A4基因。沒有轉(zhuǎn)入Pid3-A4基因的TP309經(jīng)PCR擴(kuò)增-BamH I酶切后得到的一個(gè)目的條帶，大小為658bp ;而成功轉(zhuǎn)入了 Pid3_A4基因的TP309經(jīng)PCR擴(kuò)增-BamH I酶切后得到兩個(gè)目的條帶，大小分別為5IObp和148bp。
對上述步驟2獲得的6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系(Iinel、line2、line3、line4、line7和line9)和未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻進(jìn)行上述PCR擴(kuò)增，然后用BamH I酶切，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系(linel、line2、line3、line4、line7和line9)經(jīng)PCR擴(kuò)增-BamH I酶切后得到兩個(gè)目的條帶，而未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻經(jīng)PCR擴(kuò)增-BamH I酶切后得到的一個(gè)目的條帶，且條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符。這一結(jié)果表明6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3-A4基因株系均為Pid3-A4基因陽性植株。另外，對轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的對照株的鑒定結(jié)果與未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻相一致。 (2)對潮霉素抗性基因的PCR檢測分別以上述步驟2獲得的6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系和轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的對照株的基因組DNA為模板，以HYGF和HYGR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻作為對照。沒有轉(zhuǎn)入潮霉素抗性基因的TP309經(jīng)PCR擴(kuò)增后無目的條帶；而成功轉(zhuǎn)入了潮霉素抗性基因的TP309經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到大小約為500bp)的目的條帶。HYGF :5' -GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-3'HYGR 5' -ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3'對上述步驟2獲得的6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系(Iinel、line2、line3、line4、line7和line9)和未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻進(jìn)行上述PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，6 個(gè) Ttl 代轉(zhuǎn) Pid3-A4 基因株系(Iinel、line2、line3、line4、line7 和 line9)經(jīng) PCR擴(kuò)增后得到大小約為500bp的目的條帶；而未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻經(jīng)PCR擴(kuò)增后后無目的條帶。這一結(jié)果表明6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3-A4基因株系均為潮霉素抗性基因陽性植株。另外，轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的對照株的鑒定結(jié)果也為陽性。4、Pid3-A4基因過表達(dá)分析為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因情況，本發(fā)明又對上述步驟2獲得的6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系(linel、line2、line3、line4、line7和line9)和轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的對照株進(jìn)行了 Pid3-A4的過表達(dá)分析,具體如下以上述步驟2獲得的6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系和轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的對照株為實(shí)驗(yàn)材料，提取其葉片總RNA，并利用DNAse I處理除去殘留DNA，利用oligdT將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板，用引物Pid3JF和Pid3JR擴(kuò)增大小均為658bp的轉(zhuǎn)入的Pid3-A4基因以及TP309水稻內(nèi)源的Pid3_tp309基因(Pid3的同源基因)。同時(shí)以Actin為檢測內(nèi)參，所用引物為ActinF和ActinR。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻作為對照。在以Actin為內(nèi)參，進(jìn)行半定量檢測的情況下，如果待檢測株系擴(kuò)增得到的大小為658bp的目的條帶的亮度明顯強(qiáng)于作為對照的未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻，則判定該待檢測株系為表達(dá)Pid3-A4基因的轉(zhuǎn)基因株系。ActinF :5' -AGCAACTGGGATGATATGGA-3'
ActinR :5' -CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3'結(jié)果如圖4所示,在其中的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(linel, line2, line3和line4)中檢測到了 Pid3-A4基因的表達(dá)(目的條帶亮度強(qiáng)于作為對照的未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻)，而另外2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(line7和line9)與轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的對照株檢測結(jié)果一致，均沒有能夠檢測到Pid3-A4基因的表達(dá)(目的條帶亮度與作為對照的未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻一致)。分析其原因，這可能是由于Pid3-A4基因在轉(zhuǎn)基因株系line7和line9中的插入位置造成轉(zhuǎn)入的Pid3-A4基因不能表達(dá)。二、轉(zhuǎn)Pid3_A4基因水稻對稻瘟病的抗性檢測I、對稻瘟病抗性的初步檢測對上述步驟一 2中獲得的6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3-A4基因株系和轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的對照株進(jìn)行抗稻痕病菌鑒定，所用稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小種為 zhong-10-8-14 (Shang,J. J. , et al.,2009 Identification of a New Rice BlastResistance Gene,Pid3，by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-Rich Repeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Genetics 182:1303-1311，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)。具體如下在大田中，將上述步驟一 2中獲得的6個(gè)Ttl代轉(zhuǎn)Pid3_A4基因株系(linel、line2、line3、line4、line7和line9)和轉(zhuǎn)入PZH01空載體的對照株植株進(jìn)行移栽，均在移栽后一個(gè)月左右(未孕穗前)利用注射器分別進(jìn)行注射接菌，具體為用無菌水將稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)小種zhong-10-8-14配置成5X IO4孢子/毫升的孢子懸浮液,用普通醫(yī)用注射器從水稻莖桿基部將Iml孢子懸浮液注入直至懸浮液從水稻莖桿頂部溢出。一周后調(diào)查發(fā)病情況(評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)見表I)。同時(shí)設(shè)置未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的TP309水稻作為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。表I水稻植株發(fā)病情況評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)
fil級(jí)別發(fā)病情況
抗(R)0 無任何病斑
抗(R)I 直徑小于0. 5mm的褐點(diǎn)病斑
中抗(mR)2 直徑約為0. 5-Imm的褐點(diǎn)病斑
中感(mS)3 直徑l-3mm的橢圓形病斑,邊緣褐色，中央灰白色
感(S)4 典型的紡錘形病斑,直徑3mm或更長,病斑稍有融合或無融合
感(S)5 典型的紡錘形病斑，由于病斑融合，葉片上半部枯死結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中只有檢測到了 Pid3_A4表達(dá)的4個(gè)株系(linel、line2、line3和line4)表現(xiàn)為對稻痕病菌zhong-10-8-14的抗性(圖4),而其他兩個(gè)未能檢測到Pid3-A4表達(dá)的株系(line7和line9)與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的TP309水稻和轉(zhuǎn)入PZH01空載體的對照株相同，均表現(xiàn)為感病。為了進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)入的Pid3_A4基因和抗病的相關(guān)性，對Ttl代中有抗病表現(xiàn)的I個(gè)株系(linel)的T1代分尚植株(16株)進(jìn)行分子檢測和抗稻痕病(稻痕病菌zhong-10-8-14)性狀分析，其中，抗稻瘟病性狀分析步驟同上所述，分子檢測步驟見步驟一3中的(I)和(2)。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)基因的TP309水稻作為抗稻瘟病陰性對照，設(shè)置野生稻A4作為抗稻瘟病陽性對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)Pid3-A4基因株系Iinel的T1代分離植株中各植株的抗稻瘟病性狀與Pid3-A4基因的表達(dá)與否是一一對應(yīng)的。這一結(jié)果說明本實(shí)例從普通野生稻A4中分離的Pid3-A4基因是一個(gè)有功能的抗稻瘟病基因。2、Pid3-A4基因表達(dá)特性分析利用RT-PCR對Pid3_A4基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，具體如下在大田中，用注射器將抗稻瘟病菌zhong-10-8-14的野生稻A4進(jìn)行注射接菌，具體為用無菌水將稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小種zhong-10-8-14配置成5X IO4孢子/毫升的孢子懸浮液，用普通醫(yī)用注射器從水稻莖桿基部將Iml孢子懸浮液注入直至懸浮 液從水稻莖桿頂部溢出。同時(shí)設(shè)置接水對照。在接菌或接水后不同的時(shí)間點(diǎn)(0h、3h、6h、12h、24h、48h和72h)采集葉鞘和葉片并提取其總RNA，利用DNAse I處理除去殘留DNAjlJ用oligdT將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板，用引物Pid3JF和Pid3JR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以Actin為檢測內(nèi)參,所用引物為ActinF和ActinR。結(jié)果如圖6所示，接菌組和接水對照組中，Pid3_A4基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的表達(dá)量基本一致。這一結(jié)果表明Pid3-A4基因在野生稻A4中表現(xiàn)為組成型表達(dá)，并且不受稻瘟病菌小種zhong-10-8-14所誘導(dǎo)。3、Pid3_A4基因?qū)Φ疚敛【棺V的測定盡管Pid3-A4基因與Pid3基因在序列上差異很小，但一般認(rèn)為NBS-LRR類基因的LRR結(jié)構(gòu)域決定了此類基因?qū)Φ疚敛【》N的特異識(shí)別，而Pid3-A4基因和Pid3基因在LRR區(qū)域有6個(gè)氨基酸的差異，因此本發(fā)明對具有相同轉(zhuǎn)基因受體TP309，并都在CAMV35S啟動(dòng)子控制下的Pid3-A4轉(zhuǎn)基因植株T2代Iinel株系和Pid3轉(zhuǎn)基因植株(Shang，J. J.，etal.，2009，Identification of a New Rice Blast Resistance Gene, Pid3, by GenomewideComparison of Paired Nucleotide-Binding Site-Leucine-Rich Repeat Genes andTheir Pseudogene Alleles Between the Two Sequenced Rice Genomes. Genetics182:1303-1311，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)進(jìn)行了稻瘟病菌抗譜測定，所用稻瘟病菌小種共30個(gè)，其中12個(gè)為原來測定Pid3抗譜的12個(gè)稻瘟病菌小種(表 2 中編號(hào) 19-30) (Shang, J. J. , et al. , 2009Identification of a New Rice BlastResistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-BindingSite-Leucine-Rich Repeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the TwoSequenced Rice Genomes. Genetics 182:1303-1311,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，另外18個(gè)是從四川省稻瘟病菌多發(fā)區(qū)域收集的稻瘟病菌小種(表2中編號(hào)1-18)(參考文獻(xiàn)張雪梅.四川省水稻主栽品種抗瘟性評(píng)價(jià)和內(nèi)恢99-14抗瘟性遺傳分析[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007年.白玉連.四川稻瘟病菌對雜交稻毒性的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008年.由四川省農(nóng)科院植保所彭云良研究員在四川地區(qū)收集提供，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)。分別將上述30個(gè)稻瘟病菌小種(表2中所示)接種到Pid3-A4轉(zhuǎn)基因植株T2代Iinel株系和Pid3轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行稻瘟病抗譜測定，具體接種方法如下分別用無菌水將不同小種配置5X IO4孢子/毫升的孢子懸浮液，用普通醫(yī)用注射器從水稻莖桿基部將Iml孢子懸浮液注入直至懸浮液從水稻莖桿頂部溢出，每個(gè)菌接三株，每株接三個(gè)分蘗。一周后調(diào)查發(fā)病情況(評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)見表I)。同時(shí)設(shè)置未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的TP309水稻和轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的水稻作為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如表2所示，未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的TP309水稻和轉(zhuǎn)入PZHOl空載體的水稻對檢測的所有稻瘟病菌小種均無抗性；Pid3-A4轉(zhuǎn)基因植株所抗稻瘟病菌小種比Pid3轉(zhuǎn)基因植株更多，主要體現(xiàn)為對四川收集的稻瘟病菌小種(表2中編號(hào)1-18)的抗性更強(qiáng)，具體為Pid3-A4轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟病菌小種10-25-1-1、03-11-37-1、10-120-21-2和10-62-2-1表現(xiàn)出抗性，而Pid3轉(zhuǎn)基因植株未表現(xiàn)出抗性。因此，Pid3-A4基因?qū)τ谠谒拇ǖ目沟疚敛∮N中可能會(huì)具有更好的利用價(jià)值。表2Pid3_A4轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟病菌的抗譜
______福號(hào)■稻邊齒爾小利丨■TP309—琢空涵秘Pi,_____
^I^03-10-66-1SSRI
207-31-1-2SSRR
303-10-76-3SSRR
404-8-2-1SSSS
510-25-1-1SSRS
610-32-2-1SSIiiRmR
I10-62-3-1SSmSS
8IO-II7-17-1 SSSS
903-11-37-1SSRS
1007-55-1-1SSRR
II1047-9-2SSER
1210-120-21-2 SSRS
1307-21 冬 ISSRR
1410-62-2-1SSRS
1507-24-1-1SSmSS
1610-31-24SSSS
1707-26-2-2SSRR
1809-87-2-1SSRR
1991-65-1SSSS
20Sichuati26SSSS
21Y34SSRR
2299-26-2SSmRmR
23CH706SSRS
24ZIiong-10-8-14 SSER
25ZB15SSSS
2697-27-2SSRR
27CH45SSSS
28JS2001-108-1 SSRR
2999-20-2SSER
3099-26-1_SSSS
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗稻瘟病相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子為編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因，所述基因?yàn)槿缦翴)-4)中任一所述的DNA分子 1)編碼序列為序列表中序列I所示的DNA分子； 2)序列表中序列I所不的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)所限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 4)與I)或2)所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述的核酸分子，或權(quán)利要求4或5或6所述的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在如下al)或a2)中的應(yīng)用 al)調(diào)控植物對稻瘟病的抗性； a2)選育抗稻瘟病植物品種。
8.一種培育抗稻瘟病轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟將編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因?qū)肽康闹参铮@得抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述稻痕病由下述稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)小種中的至少一種引起JS2001-108_1、Zhongl0-8-14、97-27-2、03-10-66-l、07-31-1-2、03-10-76-3、10-25-卜I、10-32-2-1、03-1卜37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-1、07-26-22、09-87-2-1、Y34、99-26-2、CH706 和 99-20-2。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻抗稻瘟病蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗稻瘟病相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的PID3-A4蛋白及其編碼基因可用于培育抗稻瘟病植物新品種，特別是對由下述稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)小種中的至少一種引起的稻瘟病表現(xiàn)出抗性JS2001-108-1、Zhong10-8-14、97-27-2、03-10-66-1、07-31-1-2、03-10-76-3、10-25-1-1、10-32-2-1、03-11-37-1、07-55-1-1、10-47-9-2、10-120-21-2、07-21-1-1、10-62-2-1、07-26-22、09-87-2-1、Y34、99-26-2、CH706和99-20-2。這將有利于對水稻品種的改良，對擴(kuò)大作物種植范圍，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102702337SQ20121015892
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者呂啟明, 徐吉臣, 徐筱, 朱立煌, 李仕貴, 李曉兵, 江光懷 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所