專利名稱：一種多菌種階段式乙醇發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種階段式乙醇發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵方式通常采用游離酵母間歇發(fā)酵法。為了提高酵母細(xì)胞的利用率，過去人們通常采用離心沉淀的方法將酵母回收再重復(fù)使用。該做法導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p傷酵母細(xì)胞，同時又容易污染雜菌，導(dǎo)致重復(fù)發(fā)酵強(qiáng)度不高，乙醇產(chǎn)率低，并降低了設(shè)備利用率。后改進(jìn)的連續(xù)發(fā)酵方式也是使用游離的酵母，由于酵母菌體積小，致使在發(fā)酵過程中不斷被成熟的發(fā)酵醪帶走，造成后續(xù)發(fā)酵液中的菌液濃度降低，使整個發(fā)酵過程延遲，生產(chǎn)效率降低。為了解決以上問題，現(xiàn)在研究者采用固定化酵母的方法，使酵母菌即不受損傷又不流 失，使整個連續(xù)發(fā)酵過程的菌種濃度幾乎是在同樣條件下進(jìn)行。而固定化后的酵母始終保留在發(fā)酵罐內(nèi)，并能持續(xù)不斷地進(jìn)行繁殖和代謝，從而提高發(fā)酵效率，但是固定化后的酵母細(xì)胞存活率存在下降的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有乙醇發(fā)酵過程中發(fā)酵強(qiáng)度不高，乙醇轉(zhuǎn)化率低的問題，而提供一種多菌種階段式乙醇發(fā)酵方法。本發(fā)明的多菌種階段式乙醇發(fā)酵方法是按照以下步驟進(jìn)行的一、將安琪釀酒酵母和南陽混合酵母分別活化培養(yǎng)，獲得安琪釀酒酵母菌液和南陽混合酵母菌液；二、將蔗糖質(zhì)量百分含量為109^15%的能源甜菜塊根壓榨汁與質(zhì)量百分含量為0. 4%的五氯苯酚鈉按體積比為100 I的比例加入到發(fā)酵罐中，然后升溫至45 55° C，以10(Tl50rpm的速度進(jìn)行攪拌殺菌0. 5 lh，得到發(fā)酵液；三、將步驟二的發(fā)酵罐溫度降至室溫后，將營養(yǎng)鹽與步驟二的發(fā)酵液按體積比I : 1(T20的比例攪拌混合均勻，再用質(zhì)量百分含量為45%的磷酸溶液調(diào)節(jié)PH至5. 0，得混合液；四、然后向步驟三得到的混合液中加入步驟一活化培養(yǎng)的安琪釀酒酵母菌液；然后在轉(zhuǎn)速為10(Tl50rpm，混合液pH為5. 0，發(fā)酵罐溫度為25 30° C的條件下，反應(yīng)5 10h，再將發(fā)酵罐溫度升至28 35° C，發(fā)酵2(T25h，最后加入步驟一活化培養(yǎng)獲得的南陽混合酵母菌液，繼續(xù)發(fā)酵2(T25h，即完成多菌種階段式乙醇發(fā)酵；其中，步驟四中所述的步驟三得到的混合液與安琪釀酒酵母菌液的體積比為15 25 I;步驟四中所述的步驟三得到的混合液與南陽混合酵母菌液的體積比為15 25 I。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明首次采用多菌種階段式新工藝技術(shù)，為發(fā)酵工藝技術(shù)創(chuàng)新提供一可行途徑，本發(fā)明在發(fā)酵前期，加入一定量繁殖迅速，前期發(fā)酵快的安琪釀酒酵母ADY菌種，后期再加入較耐乙醇度和發(fā)酵醪酸度的南陽混合酵母CICC1308菌種，再通過試驗(yàn)選擇篩選兩個菌種的添加量和交替時間，本發(fā)明的乙醇轉(zhuǎn)化率為98. 54%。較現(xiàn)有的采用游離酵母間歇發(fā)酵法的乙醇轉(zhuǎn)化率提高了 4.66%。本發(fā)明的發(fā)酵強(qiáng)度的優(yōu)點(diǎn)為充分發(fā)揮兩個菌種的特點(diǎn)并將二者有機(jī)銜接到一起。
本發(fā)明根據(jù)菌體生長規(guī)律和不同菌種的特點(diǎn)，從不同菌種發(fā)酵的時空方面進(jìn)行控制研究，在發(fā)酵前期，加入一定量繁殖迅速，前期發(fā)酵快的菌種，后期再加入較耐乙醇度和發(fā)酵醪酸度的菌種，再通過試驗(yàn)選擇篩選兩個菌種的添加量和交替時間，從而提高菌種的利用效率，進(jìn)而是乙醇轉(zhuǎn)化率提高。


圖I菌種安琪釀酒酵母(ADY)和南陽混合酵母(CICC1308)生長曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的一種多菌種階段式乙醇發(fā)酵方法是按照以下步驟進(jìn)行的一、將安琪釀酒酵母和南陽混合酵母分別活化培養(yǎng)，獲得安琪釀酒酵母菌液和南陽混合酵母菌液；二、將蔗糖質(zhì)量百分含量為109^15%的能源甜菜塊根壓榨汁與質(zhì)量百分含量為0.4%的五氯苯酚鈉按體積比為100 I的比例加入到發(fā)酵罐中，然后升溫至45 55° C，以10(Tl50rpm的速度進(jìn)行攪拌殺菌0. 5 lh，得到發(fā)酵液；三、將步驟二的發(fā)酵罐溫度降至室溫后，將營養(yǎng)鹽與步驟二的發(fā)酵液按體積比I : 1(T20的比例攪拌混合均勻，再用質(zhì)量百分含量為45%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至5. 0，得混合液；四、然后向步驟三得到的混合液中加入步驟一活化培養(yǎng)的安琪釀酒酵母菌液；然后在轉(zhuǎn)速為10(Tl50rpm，混合液pH為5.0，發(fā)酵罐溫度為25 30° C的條件下，反應(yīng)5 10h，再將發(fā)酵罐溫度升至28 35° C，發(fā)酵2(T25h，最后加入步驟一活化培養(yǎng)獲得的南陽混合酵母菌液，繼續(xù)發(fā)酵2(T25h，即完成多菌種階段式乙醇發(fā)酵；其中，步驟四中所述的步驟三得到的混合液與安琪釀酒酵母菌液的體積比為15 25 I ;步驟四中所述的步驟三得到的混合液與南陽混合酵母菌液的體積比為15 25 I。本實(shí)施方式步驟一所述安琪釀酒酵母購買自上海生化試劑公司；南陽混合酵母為南陽混合酵母CICC1308菌種，購買自中國微生物菌種保藏中心，保藏編號為CICC1308。本實(shí)施方式的能源甜菜為能源甜菜NY0503，已經(jīng)在《能源甜菜發(fā)酵生產(chǎn)酒精的工藝研究》，作者史淑芝，程大友，馬鳳鳴，魯兆新，董愛軍，羅成飛。發(fā)表于《釀酒科技》期刊2009，179 (5) :17-21。并提供能源甜菜NY0503發(fā)放20年證明。本實(shí)施方式首次采用多菌種階段式新工藝技術(shù)，為發(fā)酵工藝技術(shù)創(chuàng)新提供一可行途徑，本實(shí)施方式在發(fā)酵前期，加入一定量繁殖迅速，前期發(fā)酵快的安琪釀酒酵母ADY菌種，后期再加入較耐乙醇度和發(fā)酵醪酸度的南陽混合酵母CICC1308菌種，再通過試驗(yàn)選擇篩選兩個菌種的添加量和交替時間，本實(shí)施方式的乙醇轉(zhuǎn)化率為98. 54%。較現(xiàn)有的采用游離酵母間歇發(fā)酵法的乙醇轉(zhuǎn)化率提高了 4.66%。本實(shí)施方式的發(fā)酵強(qiáng)度的優(yōu)點(diǎn)為充分發(fā)揮兩個菌種的特點(diǎn)并將二者有機(jī)銜接到一起。本實(shí)施方式根據(jù)菌體生長規(guī)律和不同菌種的特點(diǎn)，從不同菌種發(fā)酵的時空方面進(jìn)行控制研究，在發(fā)酵前期，加入一定量繁殖迅速，前期發(fā)酵快的菌種，后期再加入較耐乙醇度和發(fā)酵醪酸度的菌種，再通過試驗(yàn)選擇篩選兩個菌種的添加量和交替時間，從而提高菌種的利用效率，進(jìn)而是乙醇轉(zhuǎn)化率提高。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中所述的安琪釀酒酵母活化培養(yǎng)的具體操作為將的安琪釀酒酵母菌株放于15倍量的蔗糖質(zhì)量百分含量為2%的37° C水溶液中，復(fù)水活化15 20min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至二不同的是步驟一中所述的南陽混合酵母活化培養(yǎng)的具體操作為將南陽混合酵母菌株挑到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，然后在28° C搖床內(nèi)培養(yǎng)至菌液OD值為0. 8^1. 3的對數(shù)生長期。其它與具體實(shí)施方式
一至二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟三中所述的營養(yǎng)鹽為是由 lg/L 的(NH4)2S04、10g/L 的 MgS04、10g/L 的 KH2P04、10g/L 的 CaCL 和 IOg/ L的過磷酸鈣組成的。其它與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟三中所述的營養(yǎng)鹽與步驟二的發(fā)酵液按體積比I : 15。其它與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟四中所述的在發(fā)酵罐溫度為25 30° C的條件下，反應(yīng)8h。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟四中所述的再將發(fā)酵罐溫度升至28 35° C，發(fā)酵22h。其它與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至七之一不同的是步驟四中所述的最后加入步驟一活化培養(yǎng)的南陽混合酵母，繼續(xù)發(fā)酵22h。其它與具體實(shí)施方式
一至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟四中所述的步驟三得到的混合液與安琪釀酒酵母菌液的體積比為20 I。其它與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至九之一不同的是步驟四中所述的步驟三得到的混合液與南陽混合酵母的體積比為20 I。其它與具體實(shí)施方式
一至九之一相同。通過以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果試驗(yàn)條件安琪釀酒酵母ADY菌種(購買自上海生化試劑公司)；南陽混合酵母CICC1308菌種(購買自中國微生物菌種保藏中心，CICC1308為保藏編號)試驗(yàn)組采用ADY和CICC1308菌種階段式進(jìn)行乙醇發(fā)酵；對照組I :單獨(dú)使用ADY菌種進(jìn)行乙醇發(fā)酵；對照組2 :單獨(dú)使用CICC1308菌種進(jìn)行乙醇發(fā)酵；具體方法如下試驗(yàn)組本試驗(yàn)的多菌種階段式乙醇發(fā)酵方法是按以下步驟進(jìn)行的一、將安琪釀酒酵母ADY和南陽混合酵母CICC1308菌種活化培養(yǎng)好，待用；二、取3L蔗糖質(zhì)量百分含量為12%的能源甜菜NY0503甜菜汁放入發(fā)酵罐中，然后加入30mL的質(zhì)量百分含量為0. 4%的五氯苯酚鈉，并將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至50° C，進(jìn)行攪拌殺菌0.5h，然后降至室溫，將營養(yǎng)鹽與發(fā)酵液按體積比為I : 15的比例加入發(fā)酵液中，并攪拌混勻；三、使用質(zhì)量百分含量為45%的磷酸調(diào)節(jié)步驟二的發(fā)酵液PH至5.0，混合均勻，得混合液；四、然后向步驟三得到的混合液中加A 150mL復(fù)水活化好的安琪釀酒酵母ADY菌液，設(shè)置發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為130rpm，溫度為28°C，發(fā)酵液pH為5. O的條件下反應(yīng)8h，再將溫度調(diào)至31° C，發(fā)酵22h后，再加入150mL的南陽混合酵母CICC1308，繼續(xù)發(fā)酵22h。本試驗(yàn)的營養(yǎng)鹽是由lg/L 的(NH4) 2S04、10g/L 的 MgS04、10g/L 的 KH2P04、10g/L 的CaCL和10g/L的過磷酸鈣組成的。將本試驗(yàn)得到的成熟發(fā)酵醪進(jìn)行蒸餾，然后進(jìn)行乙醇轉(zhuǎn)化率計算(具體方法參見文獻(xiàn)史淑芝，程大友，徐德昌，馬鳳鳴，魯兆新，董愛軍，代翠紅，羅成飛.能源甜菜酒精發(fā)酵的工藝優(yōu)化及數(shù)學(xué)模型[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009，25 (6) =214-218.)。本試驗(yàn)的乙醇轉(zhuǎn)化率為98. 54%。對照組I本試驗(yàn)的單菌種乙醇發(fā)酵方法是按以下步驟進(jìn)行的一、將安琪釀酒酵母ADY菌種活化培養(yǎng)好，待用；二、取3L蔗糖質(zhì)量百分含量為12%的能源甜菜NY0503甜菜汁放入發(fā)酵罐中，然后加入30mL的質(zhì)量百分含量為0. 4%的五氯苯酚鈉，并將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至50° C，進(jìn)行攪拌殺菌0.5h，然后降至室溫，將營養(yǎng)鹽與發(fā)酵液按體積比為I : 15的比例加入發(fā)酵液中，并攪拌混勻；三、使用質(zhì)量百分含量為45%的磷酸調(diào)節(jié)步驟二的發(fā)酵液pH至5. 0，混合均勻，得混合液；四、然后向步驟三得到的混合液中加入300mL復(fù)水活化好的安琪釀酒酵母ADY菌液，設(shè)置發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為130rpm，溫度為28° C，并保持發(fā)酵液pH為5. 0，然后反應(yīng)8h，再將溫度調(diào)至31°C，發(fā)酵44h至結(jié)束。本試驗(yàn)的營養(yǎng)鹽是由lg/L 的(NH4) 2S04、10g/L 的 MgS04、10g/L 的 KH2P04、10g/L 的CaCL和10g/L的過磷酸鈣組成的。本試驗(yàn)的乙醇轉(zhuǎn)化率為95. 48%。對照組2本試驗(yàn)的單菌種乙醇發(fā)酵方法是按以下步驟進(jìn)行的一、將南陽混合酵母CICC1308菌種活化培養(yǎng)好，待用；二、取3L蔗糖質(zhì)量百分含量為12%的能源甜菜NY0503甜菜汁放入發(fā)酵罐中，然后加入30mL的質(zhì)量百分含量為0. 4%的五氯苯酚鈉，并將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至50° C，進(jìn)行攪拌殺菌0.5h，然后降至室溫，將營養(yǎng)鹽與發(fā)酵液按體積比為I : 15的比例加入發(fā)酵液中，并攪拌混勻；三、使用質(zhì)量百分含量為45%的磷酸調(diào)節(jié)步驟二的發(fā)酵液pH至5. 0，混合均勻，得混合液；四、然后向步驟三得到的混合液中加入300mL培養(yǎng)好的南陽混合酵母CICC1308菌液，設(shè)置發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為130rpm，溫度為28°C，并保持發(fā)酵液pH為 5. 0，然后反應(yīng)8h，再將溫度調(diào)至31° C，發(fā)酵56h至結(jié)束。本試驗(yàn)的營養(yǎng)鹽是由lg/L 的(NH4) 2S04、10g/L 的 MgS04、10g/L 的 KH2P04、10g/L 的CaCL和10g/L的過磷酸鈣組成的。本試驗(yàn)的乙醇轉(zhuǎn)化率為96. 37%。綜上所述，結(jié)合試驗(yàn)組與對照組I和2可知，本發(fā)明的方法制備的乙醇轉(zhuǎn)化率是98. 54%，與單菌種ADY和CICC1308單獨(dú)使用時，其乙醇轉(zhuǎn)化率分別提高3. 06%和2. 17%?？梢?，通過采用兩菌種階段式新工藝試驗(yàn)，確實(shí)提高了發(fā)酵的乙醇轉(zhuǎn)化率。另外，通過對本發(fā)明的菌種ADY和CICC1308進(jìn)行復(fù)活搖菌培養(yǎng)達(dá)對數(shù)生長期時，將其加入到發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如圖I所示。由圖I可知，在同樣的發(fā)酵醪中，菌種ADY前期生長較快，繁殖量較大，穩(wěn)定期長，但其后期衰亡快；而CICC1308前期菌種繁殖較慢，致使對數(shù)增長期和穩(wěn)定期相應(yīng)延后，但該菌種后期衰亡慢，利于在階段式發(fā)酵 工藝過程中后期菌種的利用，以發(fā)揮其特殊效果。
權(quán)利要求
1.一種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法是按照以下步驟進(jìn)行的一、將安琪釀酒酵母和南陽混合酵母分別活化培養(yǎng)，獲得安琪釀酒酵母菌液和南陽混合酵母菌液；ニ、將蔗糖質(zhì)量百分含量為1(Γ15%的能源甜菜塊根壓榨汁與質(zhì)量百分含量為O. 4%的五氯苯酚鈉按體積比為100 I的比例加入到發(fā)酵罐中，然后升溫至.45 55° C，以10(Tl50rpm的速度進(jìn)行攪拌殺菌O. 5 lh，得到發(fā)酵液；三、將步驟ニ的發(fā)酵罐溫度降至室溫后，將營養(yǎng)鹽與步驟ニ的發(fā)酵液按體積比I : 1(Γ20的比例攪拌混合均勻，再用質(zhì)量百分含量為45%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至5. 0，得混合液；四、然后向步驟三得到的混合液中加入步驟ー活化培養(yǎng)的安琪釀酒酵母菌液；然后在轉(zhuǎn)速為10(Tl50rpm，混合液pH為.5.0，發(fā)酵罐溫度為25 30° C的條件下，反應(yīng)5 10h，再將發(fā)酵罐溫度升至28 35° C，發(fā)酵.2(T25h，最后加入步驟ー活化培養(yǎng)獲得的南陽混合酵母菌液，繼續(xù)發(fā)酵2(T25h，即完成多菌種階段式こ醇發(fā)酵；其中，步驟四中所述的步驟三得到的混合液與安琪釀酒酵母菌液的體積比為15 25 I ;步驟四中所述的步驟三得到的混合液與南陽混合酵母菌液的體積比為.15 25 I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟一中所述的安琪釀酒酵母活化培養(yǎng)的具體操作為將安琪釀酒酵母菌株放于15倍量的蔗糖質(zhì)量百分含量為2%的37° C水溶液中，復(fù)水活化15 20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟一中所述的南陽混合酵母活化培養(yǎng)的具體操作為將南陽混合酵母菌株挑到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，然后在28° C搖床內(nèi)培養(yǎng)至菌液OD值為O. 8^1. 3的對數(shù)生長期。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟三中所述的營養(yǎng)鹽為是由 lg/L 的(NH4) 2S04、10g/L 的 MgS04、10g/L 的 KH2P04、10g/L 的 CaCL 和 10g/L的過磷酸鈣組成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟三中所述的營養(yǎng)鹽與步驟ニ的發(fā)酵液按體積比I : 15。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟四中所述的在發(fā)酵罐溫度為25 30° C的條件下，反應(yīng)8h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟四中所述的再將發(fā)酵罐溫度升至28 35° C，發(fā)酵22h。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟四中所述的最后加入步驟ー活化培養(yǎng)的南陽混合酵母，繼續(xù)發(fā)酵22h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟四中所述的步驟三得到的混合液與安琪釀酒酵母菌液的體積比為20 I。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的ー種多菌種階段式こ醇發(fā)酵方法，其特征在于步驟四中所述的步驟三得到的混合液與南陽混合酵母的體積比為20 I。
全文摘要
一種多菌種階段式乙醇發(fā)酵方法，它涉及一種階段式乙醇發(fā)酵方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有乙醇發(fā)酵過程中發(fā)酵強(qiáng)度不高，乙醇轉(zhuǎn)化率低的問題。本發(fā)明方法為一、將安琪釀酒酵母和南陽混合酵母菌種活化培養(yǎng)；二、將能源甜菜塊根壓榨汁與0.4%的五氯苯酚鈉加入發(fā)酵罐中殺菌；三、將營養(yǎng)鹽加至步驟二發(fā)酵液調(diào)pH至5.0；四、加入活化的安琪釀酒酵母，25~30°C反應(yīng)5~10h，28~35°C發(fā)酵20~25h，再加入活化的南陽混合酵母，繼續(xù)發(fā)酵20~25h，即完成反應(yīng)。本發(fā)明首次采用多菌種階段式新工藝技術(shù)，本發(fā)明的乙醇轉(zhuǎn)化率為98.54%。較現(xiàn)有的采用游離酵母間歇發(fā)酵法的乙醇轉(zhuǎn)化率提高了4.66%。本發(fā)明應(yīng)用于乙醇發(fā)酵領(lǐng)域。
文檔編號C12P7/14GK102660590SQ20121016155
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者代翠紅, 劉巧紅, 史淑芝, 崔杰, 徐德昌, 程大友, 羅成飛, 董愛軍, 魯兆新 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)