專利名稱：含hspa1a啟動子與報告基因的重組質粒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，更具體地說，涉及含有HSPAlA基因的啟動子和報告基因的重組質粒及其制備方法和應用。
背景技術：
當今世界，癌癥日益成為人類健康的一大威脅。據(jù)統(tǒng)計，目前世界每年癌癥死亡率呈持續(xù)上升之勢，成為威脅人類健康的頭號殺手。因此，腫瘤的防治一直是醫(yī)藥學工作者所 致力研究的一大難題。近年來光動力療法正越來越多地用于腫瘤的治療，成為有效治療腫瘤的新技術。光動力療法是一種依托腫瘤組織對光敏劑(通常指卟啉及卟啉類衍生物或擁有一定光物理活性的化合物)的選擇性吸收，通過采用適當波長的光源對腫瘤病灶進行照射，引發(fā)光化學反應，導致單線態(tài)氧(1O2)及其他活性氧自由基(ROS)的形成。光誘導形成的ROS能引起氧化應激反應從而導致光敏劑聚集位點的損傷乃至于腫瘤的摧毀。作為光動力學療法的主導，光敏劑對于TOT的應用和發(fā)展產(chǎn)生了至關重要的促進作用。光敏劑研制開發(fā)一直是相關領域研究者關注的焦點。臨床用于PDT治療的光敏劑通常與細胞膜、內質網(wǎng)、線粒體、溶酶體等細胞器膜或其中多個位點結合。由于細胞核不是光敏劑的首要分布位點，所以這種抗腫瘤療法與傳統(tǒng)的化療或放療相比，其基因毒性更小。PDT在體內的光損傷及細胞毒性程度，是多個因素決定的，它與使用的光敏劑、亞細胞定位、光敏劑與光照射的處理時間以及不同的光照條件有關。此外，腫瘤的類型及氧化水平也是決定因素之一。光動力療法(PDT)所引起的氧化應激能夠誘導應激蛋白編碼基因的表達，其中包括熱休克(hsp)家族蛋白。此類蛋白為高度保守的分子伴侶，在初期蛋白折疊、錯疊蛋白重折疊及降解方面起到重要的作用。目前已有大量文獻報道熱休克蛋白(HSP)基因表達量在細胞應激環(huán)境上調。其中HSPAlA基因編碼的HSP70蛋白被公認為氧化應激誘導性表達的主要熱休克蛋白亞型。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是，提供一種含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒；本發(fā)明的第二個目的是，提供所述重組質粒的制備方法；本發(fā)明的第三個目的是，提供所述重組質粒的一個新應用；本發(fā)明的第四個目的，提供一種光敏活性抗腫瘤物質的篩選方法。為了實現(xiàn)第一個目的，本發(fā)明提供的技術方案如下。提供一種含有HSPAlA基因核心啟動子和報告基因的重組質粒，所述報告基因為螢火蟲熒光素酶基因PGL3。為了實現(xiàn)第二個目的，本發(fā)明提供的技術方案如下。
一種含有HSPAlA基因核心啟動子和報告基因的重組質粒的制備方法，包括以下步驟
(1)用pGL3-basic質粒轉化常規(guī)制備的DH5α感受態(tài)細胞，進行擴增，堿裂解法制備pGL3-basic質粒，電泳檢測質粒的純度和含量，用Kpn I和HindIII對質粒進行雙酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產(chǎn)物；
(2)HSPAlA基因核心啟動子序列的克隆、酶切及純化，所用的引物為
引物 1: 5' -CGGGGTACCGCCTTTCAGGTTCACAATC-3'
引物 2: 5' -CCCAAGCTTCAATCAGCCGCTTCG-3'； 以基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應進行擴增，用試劑盒凝膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物用Kpn I和HindIII雙酶切；
(3)將上述獲得的pGL3-basic載體和HSPAlA基因核心啟動子片段進行連接反應；
(4)篩選重組子，將上述連接產(chǎn)物直接轉化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，從轉化子的平板上隨即挑取菌落，擴增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質粒備用，經(jīng)過酶切、PCR、測序鑒定。為了實現(xiàn)第三個目的，本發(fā)明提供的技術方案如下。一種含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒在篩選光敏活性抗腫瘤物質方面的應用。作為一個優(yōu)選方案，用pGL3-HSPAlA-promoter_basic質粒聯(lián)合海腎突光素酶PRL-SV40質粒共轉染耐藥型腫瘤細胞系，通過同時檢測兩種熒光素酶活性來反應光動力學療法在細胞內誘導的氧化應激反應程度，從而篩選光敏活性抗腫瘤物質。作為又一個優(yōu)選方案，所述腫瘤細胞系為宮頸癌細胞系MCF-7。為實現(xiàn)第四個目的，本發(fā)明提供的技術方案如下。利用所述含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒，即pGL3-HSPAlA-promoter-basic質粒聯(lián)合海腎熒光素酶pRL_SV40質粒共轉染耐藥型腫瘤細胞系，通過同時檢測兩種熒光素酶活性來反應光動力學療法在細胞內誘導的氧化應激反應程度，從而篩選光敏活性抗腫瘤物質。本發(fā)明的積極效果是通過同時檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性來反應光敏化合物的光動力活性，即光動力學療法在細胞內誘導的氧化應激反應，從而建立新型的光敏化合物的評價篩選方法。該方法在篩選光敏抗腫瘤活性物質、研究光敏劑誘導的光動力反應抗腫瘤作用機理以及體內外光動力療法條件優(yōu)化等方面有極佳的應用前景。


圖I為HSPAlA基因啟動子序列的克隆，其中Marker為DL2000，I和2為HSPAlA基因啟動子片段(1132bp)。圖2 為 pGL3_HSPAlA promoter-basic 重組質粒的 Kpn I 和 Hind III雙酶切檢測，其中 Marker 為 DL2000,1 和 2 為 pGL3_HSPAlA promoter-basic/ Kpn I + Hind III(4818bp+1132bp)。圖3 為運用 pGL3_HSPAlA promoter-basic/ Kpn I +Hind III質粒在經(jīng)金絲桃素誘導的光動力療法處理后MCF-7細胞中熒光素酶活性的增長倍數(shù)，金絲桃素濃度范圍為O—O.125 μ Μ,以每個濃度組非光照條件細胞熒光活性為對照。圖4為檢驗經(jīng)金絲桃素誘導的光動力療法處理后MCF-7細胞中HSPAlA的蛋白表達水平，金絲桃素濃度范圍為O. 015625— O. 125 μ Μ，β-acitin作為上樣內參。圖5為陽性藥亞甲基藍介導的光動力療法(Me-PDT)處理后MCF-7細胞中熒光素酶活性的增長倍數(shù)，亞甲基藍濃度為O—5 μ Μ,以每個濃度組非光照條件細胞熒光活性為對照。圖6為陽性藥酞菁鋅介導的光動力療法(ZnPc-PDT)處理后MCF-7細胞中熒光素酶活性的增長倍數(shù)，酞菁鋅濃度為(Γ40μΜ，以每個濃度組非光照條件細胞熒光活性為對照。
具體實施方式

下面結合附圖給出本發(fā)明所述的含HSPAlA啟動子與報告基因的重組質粒及其制備方法和應用的具體實施方式
，本發(fā)明提供了 2個實施例，但是，本發(fā)明的實施不限于以下的實施例。實施例I
HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因重組質粒的制備。一、試驗材料
I、菌株、質粒
Cl)菌株大腸桿菌Ε. coliDH5a ,MCF-7購于中科院細胞所。(2)質粒pGL3-basic和pRL_SV40為本實驗室保存。2、生化試劑
(1)ExTaq酶，限制性內切酶HindIII，KpnI 和 DNA Ligation Kit 購自 TaKaRa 公司。DL2000 marker 購自上海 MajorBio 公司。PRMI 1640 培養(yǎng)液(Hyclone) ; LipofectTransfection Reagent (TIANGEN, Beijing)；
(2)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自VigOTous公司。質?；厥赵噭┖泻虳NA片段回收試劑盒購自Tiangen公司；
(3)小牛血清購自民海生物公司。BSA,NaCl,NaF,Tris,EDTA, Trytone, Yeast Extract,PMSF, PAGE, SDS, Tween-20，G250，硼酸，甘氨酸，亮肽，蛋白顯影液等試劑購自上海MajorBio公司。HSPA1A, β-actin抗體購買于protein tech公司。3、主要試劑的配制
100mg/mL 牛血清白蛋白(BSA):稱取 BSA O. Ig 溶于 ImL O. 15 M NaCl，一 20°C保存。制作蛋白標準曲線時，用O. 15M NaCl進行100倍稀釋成lmg/mL，一 20°C保存。蛋白電泳緩沖液(5X):稱取Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g溶于IL超純水，室溫保存。蛋白轉移緩沖液(5X ):稱取Tris 29g，甘氨酸14. 5g,SDS I. 85g溶于IL超純水，室溫保存。臨用前稀釋為IX，每升加入甲醇200 mL。I. 5 M Tris · HCl (pH 8.8):稱取 Tris 45. 43g 溶于 200mL，濃鹽酸調 pH 至 8. 8，超純水定容至250 mL，4°C保存。O. 5 M Tris · HCl (pH 6. 8):稱取 Tris 15. 14g 溶于 200mL，濃鹽酸調 pH 至 6. 8，超純水定容至250 mL，4°C保存。30%丙烯酰胺稱取丙烯酰胺29g，甲叉雙丙烯酰胺Ig溶于100 mL，濾紙過濾于棕色瓶中4°C保存。TBS緩沖液(5X ):稱取Tris 24. 2g，NaCl 80g溶于IL超純水，室溫保存。TBST 緩沖液(含 O . 1% Tween-20 的 TBS 緩沖液):量取 Tween-20 ImL 溶于 IL TBS,即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)稱取脫脂奶粉5g溶于IOOmL TBST，溶解后4 C保存。G250考馬斯亮藍溶液(測蛋白含量專用)稱取G250 lOOmg，溶于50mL 95%乙醇，量取IOOmL磷酸，超純水定容至1L，濾紙過濾，4°C保存。I M Tris · HCl (pH 7. 5):稱取 Tris 30. 29g 溶于 200mL 超純水，濃鹽酸調 pH 至8. 8，超純水定容至250 mL，4°C保存。I M DTT :稱取 DTT 3. 085g 溶于 20mL O. OlM 乙酸鈉溶液，_20°C保存。20mg/mL PMSF :稱取 PMSF O. 2g 溶于 IOmL 異丙醇，-20°C保存。細胞總蛋白提取液稱取NaCl O. 73g，NaF O. 524g，EDTA O. 931g，SDS O. 25g，去氧膽酸鈉 2. 5g，量取 Triton-100 2. 5mL, I M Tris · HCl (pH 7.5) 2. 5mL，超純水定容至250mL，4°C保存。用時每毫升提取液中加I μ L DTT(lM)、5yL PMSF (20mg/mL)、10 μ L亮肽(2. 5mg/mL)即可。SDS-聚丙烯酰胺分離膠(5mL)
權利要求
1.一種含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒，其特征在于，所述報告基因為螢火蟲熒光素酶基因PGL3。
2.一種根據(jù)權利要求I所述的含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)用pGL3_basic質粒轉化常規(guī)制備的DH5a感受態(tài)細胞，進行擴增，堿裂解法制備pGL3-basic質粒，電泳檢測質粒的純度和含量，用Kpn I和HindIII對質粒進行雙酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產(chǎn)物； (2)HSPAlA基因核心啟動子序列的克隆、酶切及純化，所用的引物為引物 I: 5' - CGGGGTACCGCCTTTCAGGTTCACAATC-3' 引物 2: 5' -CCCAAGCTTCAATCAGCCGCTTCG-3'； 以人基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應進行擴增，用試劑盒凝膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物用Kpn I和HindIII雙酶切； (3)將上述獲得的pGL3-basic載體和HSPAlA基因核心啟動子片段進行連接反應； (4)篩選重組子，將上述連接產(chǎn)物直接轉化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，從轉化子的平板上隨即挑取菌落，擴增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質粒備用，經(jīng)過酶切、PCR、測序鑒定。
3.一種根據(jù)權利要求I所述的含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒在篩選光敏活性抗腫瘤物質方面的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒在篩選光敏活性抗腫瘤物質方面的應用，其特征在于，用pGL3-HSPAlA-promoter-basic質粒聯(lián)合海腎熒光素酶PRL-SV40質粒共轉染耐藥型腫瘤細胞系，通過同時檢測兩種熒光素酶活性來反映光動力學療法在細胞內誘導的氧化應激反應程度，從而篩選光敏活性抗腫瘤物質。
5.根據(jù)權利要求4所述的含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒在篩選光敏活性抗腫瘤物質方面的應用，其特征在于，所述腫瘤細胞系為宮頸癌細胞系MCF-7。
6.一種光敏活性抗腫瘤物質的篩選方法，其特征在于，利用權利要求I所述的含有HSPAlA基因核心啟動子序列和報告基因的重組質粒，即pGL3-HSPAlA-promoter-basic質粒聯(lián)合海腎熒光素酶PRL-SV40質粒共轉染耐藥型腫瘤細胞系，通過同時檢測兩種熒光素酶活性來反應光動力學療法在細胞內誘導的氧化應激反應程度，從而篩選光敏活性抗腫瘤物質。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有HSPA1A啟動子序列和報告基因的重組質粒及其制備方法和應用，將構建的HSPA1A啟動子序列報告基因載體與pRL-SV40載體共轉染到目標細胞系中，處以光敏劑介導的光動力療法，通過同時檢測螢火蟲和海腎熒光素酶的活性來反映光動力療法在細胞內誘導的氧化應激反應程度，從而建立光敏劑篩選新方法。該方法在篩選光敏抗腫瘤活性物質、研究光敏劑誘導的光動力反應抗腫瘤作用機理以及體內外光動力療法條件優(yōu)化等方面有極佳的應用前景。
文檔編號C12N15/66GK102703484SQ201210163119
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權日2012年5月24日
發(fā)明者劉建文, 梁倩男, 江林, 沈克, 王傲雪, 程卓安, 謝晟, 趙宇俠, 鄭媛虹 申請人:華東理工大學