專利名稱：用于拮抗太子參根際土壤尖孢鐮刀菌的多粘類芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株用于拮抗太子參根際土壤尖孢錸刀菌的多粘類芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
太子參是ー種補(bǔ)益性中藥材，補(bǔ)益脾肺,益氣生津,治肺虛 咳嗽,脾虛食少,心悸，怔忡，水腫，消渴，精神疲乏。用于脾氣虛弱，胃陰不足，食少體倦，ロ渴舌干；肺虛燥咳，咽干痰粘；氣陰不足，心悸失眠。其藥性緩和，還適合病后虛弱者使用。太子參還作為中成藥健胃消食片的主要成分，乃至作為保健飲片出口東南亞等國。太子參用途廣泛，市場需求越來越大。但是，其連作障礙極其嚴(yán)重，即在同一塊地里連續(xù)種植太子參，即使在加強(qiáng)田間管理的情況下，其生長狀況變差，葉片光合作用速率顯著下降，最終導(dǎo)致其產(chǎn)量急劇降低到前茬的1/2至1/3以下、甚至絕收，其品質(zhì)變劣，多糖和總?cè)藚⒃碥蘸匡@著下降。申請人經(jīng)過研究證實(shí)種植太子參后，根際土壤中尖孢錸刀菌ip. oxyspormi)數(shù)量極顯著增加；將分離到的尖孢錸刀菌接種于種植太子參的健康土壤中，尖孢錸刀菌在健康土壌中大量増殖，且侵染太子參根部，引發(fā)太子參病害。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明從土壤中篩選到ー株高效拮抗太子參根際土壤尖孢錸刀菌的多粘類芽孢桿菌。本發(fā)明提供的一株用于拮抗太子參根際土壤尖孢錸刀菌的多粘類芽孢桿菌，為多粘類芽孢桿菌polymyxa)S960,已于2012年4月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6021。該菌可在在芽孢桿菌通用培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵。培養(yǎng)基為培養(yǎng)基成分葡萄糖O. 7% ;蛋白胨 O. 5% ;牛肉膏 O. 3% ；MgS04 · 7H20 O. 02% ；pH 7. 5-7. 6。該菌在改良高氏I號(hào)培養(yǎng)基(可溶性淀粉20. 0g, KNO3 I. 0g, K2HPO4 O. 5g，MgSO4 · 7H20 O. 5g, NaCl O. 5g, FeSO4 · 7H20 0. Olg，瓊脂 15g，蒸餾水 IOOOmL)上生長良好，菌落呈黃色，凸起，表面濕潤且光滑。其氣生菌絲生長旺盛，分枝多；基內(nèi)菌絲無橫隔、不斷裂(圖I)。在油鏡下(目鏡10X，物鏡100X)下觀察到的孢子絲細(xì)、長，孢子卵圓形。該菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)和16s RNA分子生物學(xué)鑒定，確定為多粘類芽孢桿菌。該菌株能較廣泛利用碳源，包括L_鼠李糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-甘露醇，但對部分碳源不利用，包括D-果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-肌醇、麥芽糖及纖維ニ糖，也能較廣泛利用氮源，可以使明膠液化、牛奶凝固及胨化，可產(chǎn)生硫化氫，但是對淀粉不水解，也不利用纖維素。本發(fā)明的多粘類芽孢桿菌polymyxa)S9Q0,可高效抑制太子參根際土壤的尖孢錸刀菌，在該領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。該菌株已于2012年4月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保蕆，其簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6021。


圖I為多粘類芽孢桿菌S960在高氏合成I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基生長圖。圖2為多粘類芽孢桿菌S960對尖孢錸刀菌的抑菌效果。
具體實(shí)施例方式I、多粘類芽孢桿菌S960的分離與純化
(I)制備土壤懸浮液取一定量種植過兩年太子參的土壌(福建省柘榮縣太子參GAP生產(chǎn)基地)，自然風(fēng)干后在研缽內(nèi)研磨，當(dāng)土壌顆粒較均一，無大顆粒時(shí)停止。稱取10 g研磨好的土壌，放入裝有90mL無菌水的三角瓶中充分振蕩，制成KT1的土壤稀釋液。從上述溶液中取出ImL加到9mL無菌水中充分振蕩制成10_2的稀釋液，以此類推，制成10_3、10_4、10_5倍的土壤溶液備用?！?br> ·
(2)平板接種分別取上述3個(gè)濃度土壤稀釋液50uL，加到已凝好的改良高氏I號(hào)平板培養(yǎng)基上(可溶性淀粉 20. 0g, KNO3 I. 0g, K2HPO4 O. 5g，MgSO4 · 7H20 O. 5g，NaCl O. 5g,FeSO4 ·7Η20 0. Olg，瓊脂15g，蒸餾水IOOOmL ;為了防止細(xì)菌和真菌污染，在培養(yǎng)基中加入重鉻酸鉀，濃度為200mg/L)，用滅菌的玻璃涂棒將稀釋液均勻的涂布開。放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3)純化隨時(shí)觀察并記錄菌株的原始培養(yǎng)結(jié)果。及時(shí)挑取單個(gè)菌落至改良高氏I號(hào)平板上，用劃線分離法純化，分離純化的菌株統(tǒng)ー編號(hào)。保存到改良高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基中。2、多粘類芽孢桿菌S960的篩選及其抑菌效果測定
拮抗菌的初篩將上述純化的各菌株與尖孢錸刀菌以1:4對峙培養(yǎng)法進(jìn)行初篩取出上述純化的菌液200uL倒入改良高氏I號(hào)平板培養(yǎng)基上，用滅菌的玻璃涂棒將稀釋液均勻的涂布，28°C培養(yǎng)5d。在倒好PDA的平板培養(yǎng)基上用直徑5mm打孔器在直徑為9cm的平板培養(yǎng)基中心打孔，并將同樣大小的尖孢錸刀菌菌塊接入。在距離尖孢錸刀菌上下左右2cm的4個(gè)方向分別打孔，接種多粘類芽孢桿菌菌塊。只接種尖孢錸刀菌的PDA平板培養(yǎng)基為對照。28°C培養(yǎng)，至空白尖孢錸刀菌長滿整個(gè)平板時(shí)，選出有明顯抑菌圈的菌株，繼續(xù)用于1:1對峙培養(yǎng)。I: I對峙培養(yǎng)方法同1:4對峙培養(yǎng)，區(qū)別是在PDA平板培養(yǎng)基直徑上的兩個(gè)1/3等分處分別接種ー個(gè)5mm孔徑大小的待篩選菌株和尖孢錸刀菌。篩選抑菌圈最大的菌株對其進(jìn)行鑒定，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16sRNA分子生物學(xué)鑒定，確定為多粘類芽孢桿菌，命名為粘類芽孢V^^iPaenibacillus polymyxa ) S960。S960菌株經(jīng)種子罐發(fā)酵，至中試發(fā)酵罐進(jìn)一歩放大發(fā)酵后，在太子參種植后立即噴霧施用于土壤，或菌液發(fā)酵后，拌基肥施用于即將種植太子參的土壌。菌液噴霧施用或拌基肥施用，其施用濃度為107-108CFU/mL。施用后將顯著提高太子參產(chǎn)量和品質(zhì)。3、多粘類芽孢桿菌S960的抑菌效果測定
在實(shí)驗(yàn)室中，將多粘類芽孢桿菌S960涂布接種在PDA平板培養(yǎng)基上，同時(shí)用打孔器將尖孢錸刀菌的菌苔打成直徑為6mm的小菌塊并將其移入已在平板培養(yǎng)皿中心位置打好孔的孔內(nèi)。未涂布接種該菌的PDA平板培養(yǎng)基中心位置接入尖孢錸刀菌菌苔為空照。28°C恒溫培養(yǎng)5日，進(jìn)行菌落直徑大小測量及抑制率計(jì)算，確定菌株的拮抗性能。抑菌率計(jì)算公式抑菌率(%)=(對照的尖孢錸刀菌菌落直徑一涂布接種該菌的尖孢錸刀菌菌落直徑)/対照的尖孢錸刀菌菌落直徑X100%。結(jié)果，該菌株對尖孢錸刀菌5天抑菌率達(dá)到91. 8%，如圖2所示。4、多粘類芽孢桿菌S960的應(yīng)用前景
植物病害80%以上是由真菌引起的，控制真菌病害對于提高農(nóng)作物產(chǎn)量極其重要。尖孢錸刀菌是ー類典型的土傳病害真菌，在土壌和有機(jī)質(zhì)中數(shù)量多而活躍，其寄居范圍非常廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多種植物發(fā)生枯萎病，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中導(dǎo)致嚴(yán)重的作物減產(chǎn)，降低品質(zhì)，影響供應(yīng)和外銷，甚至引起人畜中毒，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。申請人經(jīng)過研究證實(shí)種植太子參后，根際土壤中尖孢錸刀菌數(shù)量極顯著増加；將分離到的尖孢錸刀菌接種于種植太子參的健康土壤中，尖孢錸刀菌在健康土壤中大量増殖，且侵染太子參根部，引發(fā)太子參病害。全國毎年太子參總栽培面積約5萬多畝，按目前市場價(jià)格估算，全國產(chǎn)值約50億多元人民幣，但是連作后太子參根際土壌中尖孢錸刀菌等致病菌 和病原菌增多，使得產(chǎn)量急劇下降為頭茬(對照)的1/3以下，產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是ー個(gè)急需解決的重要問題。多粘類芽孢桿菌S960可高效抑制太子參根際土壌的尖孢錸刀菌。在該領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
權(quán)利要求
1.一株用于拮抗太子參根際土壤尖孢鐮刀菌的多粘類芽孢桿菌，其特征在于所述多粘類芽孢桿菌為多粘類芽孢桿菌心/7(977^7似)3960，已于2012年4月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6021。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株用于拮抗太子參根際土壤尖孢鐮刀菌的多粘類芽孢桿菌。所述多粘類芽孢桿菌為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)S960,已于2012年4月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.6021。該菌株可高效抑制太子參根際土壤的尖孢鐮刀菌，在該領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102676435SQ20121016388
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者林茂茲, 金美芳 申請人:福建師范大學(xué)福清分校