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水稻OsICL蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):410756閱讀:317來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):水稻OsICL蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種水稻OsICL蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)
水稻是我國(guó)最主要的糧食作物之一,其播種面積、總產(chǎn)和單產(chǎn)均居糧食作物首位。水稻冷害是目前水稻育種和生產(chǎn)上的一個(gè)難題,苗期冷害導(dǎo)致秧苗黃葉、生長(zhǎng)遲鈍、卷葉,甚至死亡,不僅嚴(yán)重影響早稻的產(chǎn)量,還會(huì)影響晚稻的生產(chǎn)計(jì)劃(詹慶才等,水稻苗期耐冷性QTLs的分子定位.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,29: 7_11);我國(guó)東北和西南地區(qū),較大低溫災(zāi)害多數(shù)發(fā)生在水稻孕穗期和花期,導(dǎo)致不育率的急劇上升和產(chǎn)量的大幅度下降,對(duì)水稻生產(chǎn)帶來(lái)更大的損失(王連敏等,寒地水稻耐冷基礎(chǔ)的研究III花期低溫對(duì)水稻結(jié)實(shí)的 影響.中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,1997,18: 9-11);據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年因低溫冷害損失稻谷約50億公斤(陳大洲等,東鄉(xiāng)野生稻抗寒基因的利用與前景展望.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1998,10:65-68)。招毒是酸性土壤中限制植物生長(zhǎng)的最主要的限制因素(Kochian et al.,How do crop plants tolerate acid soils Mechanisms of aluminum tolerance andphosphorous efficiency. Annu Rev plant Biol. 2004, 55: 459—493 ;von Uexkull,Mutert, Global extent, development and economic impact of acid soils. In:Date RA, Grundon NJj Raymet GE,Probert ME, eds. Plant-Soil Interactions atLow pH: Principles and management. Dorrecht, The Neth: Kluwer Academic, 1995,pp. 5-19.)。全世界酸性土壤總面積達(dá)39. 5億hm2,占世界可耕地土壤的40%,主要分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)(Kochain, Cellular mechanisms of aluminum toxicity andresistance of wheat in plants. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995, 46:237-260)。更令人擔(dān)憂的是,日趨嚴(yán)重的酸沉降問(wèn)題還在不斷加劇土壤的酸化,以致其范圍和強(qiáng)度仍在增加(張健,鋁毒害與森林衰退研究評(píng)述.世界林業(yè)研究,1999,12(2):28-30 ;劉菊秀,酸沉降對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)影響的研究現(xiàn)狀及展望.生態(tài)學(xué)雜志,2003,22(5): 113-117)。因此,鋁毒和冷害已成為影響作物生產(chǎn)最為嚴(yán)重的問(wèn)題之一,水稻抗鋁和抗冷相關(guān)基因的克隆和研究,不但對(duì)闡明水稻抗鋁和抗冷機(jī)理具有重要的意義,同時(shí)對(duì)用于其它敏感作物的分子改良具有較高的應(yīng)用價(jià)值。一般認(rèn)為,水稻的耐冷性是由多基因控制的數(shù)量性狀,在多基因的調(diào)控下完成復(fù)雜的適應(yīng)性反應(yīng)。目前,已有部分水稻耐冷基因被克隆,如能抑制冰晶形成和生長(zhǎng)的抗凍蛋白 AFP (Wang et al. , The dual effect of antifreeze protein on cryopreservationof rice {Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells. Cryo letters, 2001, 22:175-182),胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白LEA(張妍等,轉(zhuǎn)LEA3基因水稻的抗性分析.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28: 33-36),冷相關(guān)蛋白和分子伴侶蛋白(Cui et al. , A proteomicanalysis of cold stress responses in rice seedlings. Proteomics, 2005, 5:3162-3172),這些基因表達(dá)產(chǎn)物均是與植物耐冷性直接相關(guān)的功能性蛋白;而另外一些耐冷基因如 CBF 轉(zhuǎn)錄因子(Lissarre et al. , Cold-responsive gene regulation duringcold acclimation in plants. Plant Signaling and Behavior, 2010,5: 948-952)、 丐依賴(lài)性蛋白激酶(Ludwig et al.,CDPK-mediated signalling pathways: specificityand cross-talk. J Exp Botj 2004,55: 181-188)、細(xì)胞分裂蛋白激活激酶(Jonak etal., Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling.Curr Opin Plant Biol. 2002,5: 415-424)等則為調(diào)控性蛋白,調(diào)控冷信號(hào)傳導(dǎo)、耐冷基因表達(dá)、相關(guān)蛋白和酶活性提高水稻的抗冷性。另外,近年已從植物中分離克隆到不少鋁毒響應(yīng)基因(楊志敏和汪瑾,植物耐鋁的生物化學(xué)與分子機(jī)理.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2003,29(5) : 361-366 ;劉強(qiáng)等,植物適應(yīng)鋁毒脅迫的生理及分子生物學(xué)機(jī)理.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2004,15(9) : 1641-1649 ;Mao et al.,Identification of aluminum-regulated genes by cDNA—AFLP in rice{Oryza sativa L.) : Aluminum-regulated genes for the metabolism of cell wallcomponents. J Exp Bot. 2004,55(394): 137-143 ;Zhang et al. , Identificationof aluminum-responsive genes in rice cultivars with different aluminum sensitivities. J Exp Bot. 2007,58(8) : 2269-2278),但抗鋁相關(guān)的基因很少,目前只確定從小麥、大麥和高粱中克隆到3個(gè)抗鋁基因,分別為1#77,執(zhí)4^77和姑紛招(Sasaki et al.,A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.Plant J. 2004, 37: 645-653 ;Furukawa et al. , An aluminum-activated citratetransporter in barley. Plant Cell Physiol. 2007,48(8): 1081-1091 ;Magalhaes etal., A gene in the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family confersaluminum tolerance in sorghum. Nature Genetics. 2007,39: 1156-1161),它們分別編碼蘋(píng)果酸和檸檬酸通道蛋白,通過(guò)增加蘋(píng)果酸和檸檬酸的分泌提高抗鋁的能力;在水稻中,STARl(sensitive to Al rhizotoxicity I)和 STAR2相互作用形成一個(gè)細(xì)菌型ABC通道蛋白復(fù)合體(ATP binding cassette transporter),該復(fù)合體可以特異運(yùn)輸尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)修飾細(xì)胞壁,通過(guò)掩蓋細(xì)胞壁上鋁結(jié)合位點(diǎn)提高水稻的抗鋁性(Huanget al.,A bacterial-type ABC transporter is involved in aluminum tolerance inrice. Plant Cell. 2009, 21: 655—667)。異梓檬酸裂解酶(isocitrate lyase, I CL)在植物、原生動(dòng)物、藻類(lèi)、真菌分布在乙醒酸循環(huán)體中,而在細(xì)菌中則存在于細(xì)胞質(zhì)中。Xu等(Xu et al.,Inducibleantisense suppression of glycolate oxidase reveals its strong regulation overphotosynthesis in rice. J Exp Bot, 2009,60(6): 1799-1809)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)光呼吸途徑的乙醇酸氧化酶活性供給不足時(shí),ICL受到顯著的誘導(dǎo),乙醛酸循環(huán)體可被激活,引起乙醛酸的含量以及下游基因和代謝物的變化,補(bǔ)充光呼吸中乙醛酸的不足,從而維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)。Appanna (Appanna et al.,The metabolism of aluminum citrate andbiosynthesis of oxalic acid in Pseudomonas uorescens. Current Microbiology.2003,47(1): 32-39)研究熒光假單胞菌在Al3+大量存在時(shí),ICL被大量誘導(dǎo),草酸等酸性物質(zhì)大量生成,以此緩解Al3+對(duì)菌株的毒害。已有的研究表明ICL參與植物或微生物對(duì)非生物脅迫的反應(yīng),通過(guò)提高ICL的酶活性或激起下游反應(yīng)增強(qiáng)對(duì)非生物逆境的抗性。目前,沒(méi)有報(bào)道OsICL與水稻抗冷和抗鋁性有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足,提供一種稻OsICL蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供上述稻OsICL蛋白的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供上述稻OsICL蛋白的編碼基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
水稻OsICL蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示,或該序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且功能與SEQ ID NO: I所示序列相同的序列。
上述水稻OsICL蛋白的編碼基因。該編碼基因的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID NO:2所示?;蛟趪?yán)格條件下可與SEQ ID NO: 2雜交并且編碼上述水稻OsICL蛋白的DNA分子,所述的嚴(yán)格條件可為在6XSSC,0.5%SDS的溶液中,在65°C下雜交,然后用2XSSC,0. 1% SDS和I X SSC, 0. 1% SDS各洗雜交膜一次?;蛘吲cSEQ ID NO: 2的序列有90%以上的同源性(優(yōu)選95%以上同源性),并且編碼上述水稻OsICL蛋白的DNA分子。上述水稻OsICL蛋白的編碼基因的啟動(dòng)子,序列如SEQ ID N0:3所示;或嚴(yán)格條件下可與SEQ ID N0:3所示的DNA分子雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子,上述的嚴(yán)格條件是:在 6XSSC,0. 5%SDS 的溶液中,在 65°C下雜交,然后用 2XSSC,0. 1% SDS和 1XSSC,0. 1%SDS各洗雜交膜一次。一種表達(dá)載體,是由上述水稻OsICL蛋白的編碼基因插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。作為一種優(yōu)選方案,該表達(dá)載體還包括啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子為增強(qiáng)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(Pubi)等,他們可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此外,使用本發(fā)明的的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí),還可以使用增強(qiáng)子,包括翻譯增強(qiáng)子或者轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子,這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或是鄰接區(qū)域起始密碼子等,但必需與編碼序列的閱讀框相同,以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和其實(shí)密碼子的來(lái)源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)區(qū)域。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選,可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工,如加入可在植物中表達(dá)可以產(chǎn)生顏色變化的酶或是發(fā)光化合物的基因(如GUS基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除秀劑基因)等。以上所述任意一種表達(dá)載體,所述的植物表達(dá)載體優(yōu)選為PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI 121,或其他衍生植物表達(dá)載體。所述水稻OsICL蛋白在制備提高植物抗鋁和抗冷性藥劑中的應(yīng)用。所述水稻OsICL蛋白的編碼基因在制備抗鋁和抗冷性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。攜帶有本發(fā)明的水稻OsICL蛋白的編碼基因的植物表達(dá)載體可以通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或是組織中。被轉(zhuǎn)化的宿主植物可以是水稻或其它作物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下有益效果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)OsICL基因植株表現(xiàn)對(duì)鋁毒和低溫的抗性明顯增強(qiáng),其蛋白質(zhì)和編碼基因?qū)λ究逛X和抗冷性的調(diào)控具有重要的實(shí)際意義,在實(shí)際應(yīng)用中可以將OsICL基因轉(zhuǎn)入不同的水稻品種中以培育更加理想的水稻栽培品種或者轉(zhuǎn)入到其他感鋁和感冷的作物提高抗性。OsICL蛋白及其編碼基因在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。


圖I.水稻OsICL的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果,泳道M為分子量標(biāo)記DL2000 (購(gòu)自TAKARA);泳道1-3為目的基因。圖2.重組OsICL的過(guò)量表達(dá)載體酶切鑒定電泳結(jié)果,泳道M為分子量標(biāo)記DL2000 (購(gòu)自TAKARA);泳道1,4和5為含OsICL的植物重組表達(dá)載體質(zhì)粒,泳道2和3為空載體質(zhì)粒。 圖3.重組OsICL的過(guò)量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果,泳道M為分子量標(biāo)記DL2000 (購(gòu)自TAKARA);泳道1_6為含OsICL的植物重組表達(dá)載體質(zhì)粒。圖4.經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)得到的轉(zhuǎn)化植株分化及生根,A :繼代培養(yǎng)中的愈傷組織,B 篩選中的愈傷組織,C :預(yù)分化中的抗性愈傷組織,D :預(yù)分化中的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)為綠點(diǎn),E :分化出幼苗,F(xiàn) :生根壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的幼苗。圖5.半定量RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中OsICL的表達(dá),WT為野生型植株中花11 ;3-1和3-2為OsICL過(guò)量表達(dá)植株。圖6. Western Blot分析轉(zhuǎn)基因植株中OsICL的表達(dá),WT為野生型植株中花11 ;3-1和3-2為OsICL過(guò)量表達(dá)植株。圖7.轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株中ICL的活性檢測(cè),WT為野生型植株中花11 ;3_1和
3-2為OsICL過(guò)量表達(dá)植株。圖8.轉(zhuǎn)基因植株的抗鋁性鑒定,WT為野生型植株中花11 ;3_1和3-2為OsICL過(guò)量表達(dá)植株,CK為對(duì)照處理;A1為lmmol/L AlCl3處理,A為lmmol/L AlCl3處理4天;B為Immol /T, AlCl3 處理 12 天。圖9.轉(zhuǎn)基因植株的抗冷性鑒定,WT為野生型植株中花11 ;3_1和3-2為OsICL過(guò)量表達(dá)植株,抗冷性鑒定轉(zhuǎn)基因植株發(fā)芽后木村B培養(yǎng)至4葉期,平均溫度12. 80C -18. 8°C,濕度約 80-90%, pH 為 4. 5-5. 0,冷處理 26 天。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明,實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所用引物合成及測(cè)序工作由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成.
實(shí)施例IOsICL基因的獲得
根據(jù)NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)提供的關(guān)于該基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物,引物序列如下(46-1852bp)
OsICLFl: tcttggttatcatgtcct (SEQ ID NO:4);
OsICLRl: gctccttggctgaagtcc (SEQ ID NO:5)。以粳稻品種中花11號(hào)(購(gòu)自廣東省農(nóng)科院)2周的幼苗淹水2天的水稻葉片cDNA為模版,以O(shè)sICLFI和OsICLRl為引物,常規(guī)PCR擴(kuò)增OsICL基因。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,擴(kuò)增片段大約1800bp,回收并純化該DNA片段,克隆到PMD18-T載體(購(gòu)自TAKARA公司)上,獲得pMD18-T_0sICL載體,送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,該DNA片段的序列如SEQ ID N0:2所示。根據(jù)實(shí)施例I所得OsICL基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物對(duì)0sICLF2和0sICLR2,并在引物兩端分別引入限制性?xún)?nèi)切酶//hdIII和分el識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿基,引物序列如下
0sICLF2: ggccgaagctttcttggttatcatgtcct (SEQ ID NO:6,下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶Hindlll識(shí)別位點(diǎn));
0sICLR2: tatatactagtgctccttggctgaagtcc (SEQ ID NO: 7,下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶Spel識(shí)別位點(diǎn))o以pMD18-T-0sICL載體DNA為模版,在引物0sICLF2和0sICLR2的引導(dǎo)下,用常規(guī) PCR方法擴(kuò)增OsICL基因。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,回收并純化大約1800bp左右的DNA片段,將該片段克隆到pMD18-T載體(購(gòu)自TAKARA公司)上,獲得新的重組載體命名為pMD18-T-0sICL-E,送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,該DNA片段的序列如SEQ ID N0:2所示,在其DNA兩端引入了合適的酶切位點(diǎn)。實(shí)施例2遺傳轉(zhuǎn)化鑒定目標(biāo)基因的功能
將OsICL基因克隆入植物過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA1380 (購(gòu)自澳大利亞CAMBIA公司)多克隆位點(diǎn)的VifldIII和分el酶切位點(diǎn)之間,得到含有OsICL基因的植物表達(dá)載體,然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化粳稻品種中花11號(hào)的成熟胚的愈傷組織,方法如下述文獻(xiàn)描述(Hiei et al, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T—DNA, Plant J.1994,6: 271-282),經(jīng)過(guò)預(yù)分化、分化,得到12株轉(zhuǎn)化植株,經(jīng)過(guò)PCR鑒定,全部為陽(yáng)性,PCR引物序列如下
引物 I : 5,- CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC -3’ (SEQ ID N0:8);
引物 2 :5,- TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA -3,(SEQ ID NO:9);
PCR 擴(kuò)增條件為94 0C 2 min ;94°C 30 sec, 58 °C 30 sec, 72°C I min,35 個(gè)循環(huán);72 °C 5 min。經(jīng)過(guò)PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株后,提取Tl代轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA進(jìn)行Southern Blot檢測(cè)插入基因的拷貝數(shù),選擇單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株分單株收取種子,然后取100粒以上種子發(fā)芽后利用潮霉素進(jìn)行篩選,若沒(méi)有死亡則表明種子已經(jīng)純合;選擇已經(jīng)純合的轉(zhuǎn)基因種子和野生型水稻中花11種子萌發(fā)后,利用木村B營(yíng)養(yǎng)液(調(diào)pH為4. 8)培養(yǎng)水稻至4葉期,然后提取水稻RNA,檢測(cè)總RNA濃度和完整度后再合成cDNA第一鏈,以水稻Jdi/ 作為內(nèi)參基因,加入等量的cDNA模板,擴(kuò)增Jdi/ 和tts/a,等體積PCR產(chǎn)物上樣后檢測(cè)OsICL的表達(dá),從圖5可以看出,在轉(zhuǎn)基因植株根和葉片中As/a的表達(dá)都得到較大的提高;所用PCR引物序列如下
Actin-F: 5’ - GACATTCAGCGTTCCAGCCATGTAT-3’ (SEQ ID NO:10);
Actin-R: 5’ - TGGAGCTTCCATGCCGATGAGAGAA-3’ (SEQ ID NO:11);
ICL-F: 5’ - GGTGGGGAACGGACAGGT-3’ (SEQ ID NO:12);
ICL-F: 5,- TTGCGGTCGTGGTAGAGC-3’ (SEQ ID NO:13);PCR 擴(kuò)增條件為94 °C 2 min ;94°C 30 sec, 56 V 30 sec, 72°C I min,25 個(gè)循環(huán);72 °C 5 min。木村B 營(yíng)養(yǎng)液具體配方為(NH4) 2S04 (0 . 36 5mM),KH2PO4 (0. 182 mM),KNO3(0.183 mM), K2SO4 (0.086 mM), Ca (NO3) 2 (0.366 mM), MgSO4 (0.548 mM), EDTA-Fem(0. 020 mM), MnCl2-4H20 (0.091 X 10_3 mM), ZnSO4 7H20 (0.77 X 10_3 mM), CuSO4 5H20(0. 32X10-3 mM), H3BO3 (0. 0462 mM), (NH4) 6Mo7024 4H20 (0. 145 X 1(T3 mM)。利用上述培養(yǎng)至4葉期的水稻根和葉片提取總蛋白,定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,利用OsICL多克隆抗體進(jìn)行Western Blot分析,結(jié)果如圖6所示,轉(zhuǎn)基因植株根和葉片中ICL在蛋白水平與野生型相比均有較大的上調(diào),并且野生型植株均檢測(cè)不到OsICL的表達(dá)。進(jìn)一步測(cè)定水稻總蛋白中ICL的酶活性,轉(zhuǎn)基因植株根和葉中ICL的酶活性也提高40倍和25倍(圖7)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了 OsICL不論是在核酸和蛋白表達(dá)水平,還是在酶活性 上轉(zhuǎn)基因植株均較野生型有較大提高。為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因純合植株對(duì)鋁毒和冷害的抗性,我們進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因純合植株進(jìn)行抗鋁和抗冷性鑒定,抗鋁性鑒定方法如下述文獻(xiàn)描述(Xuet al, Differential resistance of two subtropical rice cultivars to aluminumtoxicity. J Plant Nutrition, 2004, 27,1601-1609),具體如下轉(zhuǎn)基因純合植株和野生型水稻植株中花11發(fā)芽后木村B培養(yǎng)液培養(yǎng)至4葉期,然后在人工氣候箱中設(shè)置光照培養(yǎng)14小時(shí)(30°C):暗培養(yǎng)10小時(shí)(25°C)、濕度約60-80%,鋁毒(ImM AlCl3)處理12天,pH為4. 2,每3天換一次營(yíng)養(yǎng)液;抗冷性鑒定方法如下轉(zhuǎn)基因純合植株和野生型水稻植株中花11發(fā)芽后木村B培養(yǎng)液培養(yǎng)至4葉期,然后在人工氣候箱中以平均溫度12. 80C -18. 8°C、濕度約80-90%、pH為4. 5-5. 0冷處理26天,每3天換一次營(yíng)養(yǎng)液。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的抗鋁和抗冷性明顯增強(qiáng)。轉(zhuǎn)化植株與對(duì)照植株相比,鋁處理下轉(zhuǎn)基因植株根的生長(zhǎng)速率和相對(duì)生長(zhǎng)量均較對(duì)照植株高(圖8);冷處理后轉(zhuǎn)基因植株根和地上部的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)量均較對(duì)照植株聞(圖9)。
權(quán)利要求
1.水稻OsICL蛋白,其特征在于氨基酸序列如SEQID NO: I所示。
2.權(quán)利要求I所述水稻OsICL蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述水稻OsICL蛋白的編碼基因,其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
4.權(quán)利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的編碼基因的啟動(dòng)子,其特征在于核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 所示。
5.一種表達(dá)載體,其特征在于由權(quán)利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的編碼基因插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述表達(dá)載體,其特征在于該表達(dá)載體還包括啟動(dòng)子,其特征在于啟動(dòng)子為增強(qiáng)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述表達(dá)載體,其特征在于所述植物表達(dá)載體為PCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或pBI121。
8.權(quán)利要求I所述水稻OsICL蛋白在制備提高植物抗鋁和抗冷性藥劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述水稻OsICL蛋白的編碼基因在制備抗鋁和抗冷性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了水稻OsICL蛋白及其編碼基因和應(yīng)用,屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的水稻OsICL蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示,該蛋白的一種編碼基因核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明的水稻OsICL蛋白的編碼基因可以插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)制備成重組表達(dá)載體,進(jìn)一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物,研究發(fā)現(xiàn),導(dǎo)入該基因的水稻在抗冷和抗鋁性能方面都有明顯提高。本發(fā)明的OsICL蛋白及其編碼基因有助于研究水稻抗鋁和抗冷的分子機(jī)制,對(duì)生產(chǎn)上培育具有耐鋁和抗冷的水稻品種,或是通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法改良其他對(duì)鋁和冷敏感作物的抗性具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102766618SQ20121016390
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者張嬋, 張建軍, 彭新湘, 楊國(guó)珍, 陳燕 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
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