專利名稱：玉竹微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技木，具體涉及ー種玉竹微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱作短串連重復(fù)(ShortTandem Repeats, STRs)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSRs)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)。是指一類遍布于生物基因組中的由幾個(gè)核苷酸對(duì)(稱為核心序列，一般為I 6bps)為重復(fù)單位組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)。其重復(fù)次數(shù)在同一物種不同的遺傳型間是高度可變的，但這段重復(fù)的兩端卻是相對(duì)保守的單拷貝序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，即可通過PCR技術(shù)分析核心序列重復(fù)次數(shù)的變異，在不同的遺傳型間檢測(cè)到多態(tài)。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成，微衛(wèi)星DNA序列被分為3種 類型單一型(pure),復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)。例如單ー型ATATATATATATATATATATATAT復(fù)合型ATATATCACACACACACACAC間斷型ATATATCAATATATCA ATATATA作為ー種分子標(biāo)記，微衛(wèi)星DNA具有以下特點(diǎn)廣泛分布于真核生物的基因組中，據(jù)估計(jì)每6 kb長(zhǎng)度中就有I個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)；核心序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性，多態(tài)性信息容量高呈共顯性，遵循盂德爾法則遺傳；選擇中性等等?；谝陨咸攸c(diǎn)，微衛(wèi)星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定和種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、輔助育種、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多祥性及物種進(jìn)化與親緣關(guān)系等方面的研究。玉竹又名尾參，玉參，鈴鋯菜，地管子和甜根草，隸屬于百合科(Liliaceae L.)黃精屬(Polygonatum Mill.),為多年生草本植物,喜陰生,廣泛分布于歐亞大陸溫帶地區(qū)。玉竹地下莖可入藥，在我國(guó)其藥用歷史已逾兩千多年。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為玉竹性甘、微寒、歸肺、胃經(jīng)、能養(yǎng)陰潤(rùn)肺，益胃生津用于燥熱傷陰，熱傷胃陰之癥?，F(xiàn)代研究證明玉竹含多糖和多種提取物，在延緩衰老，增強(qiáng)免疫力，抑制腫瘤，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化等方面具有一定效果。由于民間濫挖嚴(yán)重，加之野生藥材周期長(zhǎng)，玉竹野生資源日益枯竭。實(shí)際上，玉竹藥源較為復(fù)雜，微衛(wèi)星有助于鑒定玉竹品系，并區(qū)分出玉竹偽品。同時(shí)，玉竹在栽培馴化過程出現(xiàn)了一系列問題，如繁殖系數(shù)低，利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)玉竹分子育種的研究尚且很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題分離克隆玉竹的微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，建立玉竹衛(wèi)星DNA技術(shù)體系并用這些分子標(biāo)記進(jìn)行玉竹遺傳多祥性，黃精屬屬植物遺傳關(guān)系的研究，以及進(jìn)行黃精屬種質(zhì)鑒定。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案玉竹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，包括玉竹微衛(wèi)星(CT) η富集文庫的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽性克隆的篩選及測(cè)序，得到55個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆。得到9個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9 ；Pol為360個(gè)核苷酸，Po2為471個(gè)核苷酸，Po3為447個(gè)核苷酸，Po4為408個(gè)核苷酸，Po5為463個(gè)核苷酸，Po6為497個(gè)核苷酸，Po7為424個(gè)核苷酸，Po8為509個(gè)核苷酸，Po9為342個(gè)核苷酸。


圖I :Pol位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖2 Po2位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖3 Po3位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖4 Po4位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。
圖5 Po5位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖6 Po6位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖7 Po7位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖8 Po8位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。圖9 Po9位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)玉竹的DNA的銀染PAGE圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說明。實(shí)施例I :玉竹微衛(wèi)星DNA富集文庫的構(gòu)建I)基因組的提取與酶切用Doyle J 介紹的 CTAB 法(Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation [A]· In Hewitt GM, Johnston A (eds. ), Molecular Techniques inTaxonomy [M]. Berlin: Springer, 1991, 283-293)提取基因組。用限制性內(nèi)切酶 Sau3AI酶切基因組。2%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外光下切下300-900 bp的DNA片段。用膠回收試劑盒回收。2)加接頭將膠回收純化后的產(chǎn)物加入接頭oligo A(5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)oligo B (5， -P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3，)，在T4 DNA Ligase作用下于16°C水浴連接過夜。3 ) PCR檢測(cè)接頭連接以oligo A為引物，以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(50 μ I反應(yīng)體系如下25μ I GoTaq Green Master Mix, 5 μ I 引物 oligo A, 5 μ I 連接產(chǎn)物，加水補(bǔ)至 50 μ I。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性50秒，56°C退火一分鐘，72°C延伸2分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后72°C充分延伸10分鐘。在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化。4)磁珠富集將純化后的DNA片段變性形成單鏈之后與含生物素的微衛(wèi)星探針雜交，形成“微衛(wèi)星探針包含微衛(wèi)星的基因組DNA單鏈”復(fù)合體。將雜交液加入已處理好的磁珠，室溫靜置30分鐘。將離心管放在磁力架上，吸去上清，依次用6 X SSC, 2 X SSC, I X SSC在60°C下洗兩次，最后用O. I X SSC室溫下洗一次。加入TE緩沖液，在PCR儀上95°C變性15分鐘，收集上清。重復(fù)兩次。5) PCR 富集以磁珠富集產(chǎn)物為模板，oligo A為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μ I反應(yīng)體系如下，12. 5 μ I GoTaq Green Master Mix, I. 5 μ I 引物oligo A, 2. 5 μ I 富集后的DNA,カロ水補(bǔ)至25 μ I。PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性35秒，60°C退火性35秒，72°C延伸I分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后72°C充分延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用純化試劑盒進(jìn)行純化。6)感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑取平板上E. coli DH-5a單菌落，接種于5 ml的不含Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取I ml培養(yǎng)液于50 ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，2 4 h至對(duì)數(shù)期。測(cè)OD (0. 2 0. 6)。將培養(yǎng)液分裝至EP管中(每管I. 5 ml菌液)，水浴10 15min。在4°C離心,4000 rpm, 10 min (先降溫后再離心)棄上清。棄上清后三管并一管，冰浴30 min (第一管加入0. I mol/L, I ml事先冰中預(yù)冷的CaC12，混勻，吸出至第二管，如此將三管并一管)。取出后梯度離心，4°C，4000 rpm，5 8 min。棄上清。加入200 μ I預(yù)冷甘油(15%) /CaCl2 (0. I Μ)混勻，_80°C保存。7)連接轉(zhuǎn)化取PCR富集后的純化產(chǎn)物連接入TA克隆載體(pMD19-T Simple Vector)，16°C水浴連接2-3小吋。取出凍存管，冰上復(fù)蘇10 min ;將10 μ I的連接產(chǎn)物加入200 μ I感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30 min ;42°C水浴熱休克90 s ;冰浴2 min，加入600 μ I LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)I. 5 h ;取70 μ I培養(yǎng)液，滴入LB/Amp/X-gal/IPTG平板上并涂布均勻(X-Gal需避光)；將平板37°C正向放置培養(yǎng)0. 5h，然后于37°C烘箱中倒置培養(yǎng)過夜。經(jīng)過12 h的培養(yǎng)，待平板上的菌落大小適中，取出平板于4°C放置使藍(lán)斑充分顯現(xiàn)。用滅過菌的牙簽挑取平板上白色單克隆菌落，置于96深孔板中(深孔板事先加入了 400 μ I的含Amp抗性的LB/Amp培養(yǎng)基)。當(dāng)白色單菌落挑取結(jié)束后，用不干膠將孔板蓋好后于37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)4 h08)陽性克隆的篩選以連接轉(zhuǎn)化所得的菌液為模板，利用引物oligo A和引物(CT)12-行PCR擴(kuò)增。15 μ I PCR 反應(yīng)體系包括rTaq 酶 0. 375 U, 10X Buffer I. 5 μ I, dNTP 0.2 μ M, MgCl21.5 μ Μ，引物0.4 μ M (oligo Α，(CT)12),水，模板。反應(yīng)程序94 °C預(yù)變性3分鐘，94 °C變性50秒，56°C退火35秒，72°C延伸I分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)30次。最后72°C充分延伸12分鐘。I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。9)陽性克隆測(cè)序及引物設(shè)計(jì)選取擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度在300-900 bp含陽性克隆的菌液，送生エ生物(上海)有限公司測(cè)序，共得到51條含有微衛(wèi)星DNA的序列。利用軟件Primer Premier 5. O根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的序列來設(shè)計(jì)引物。10)篩選有多態(tài)性的引物
用上述的CTAB法提取玉竹的基因組。用設(shè)計(jì)好的引物(表I)擴(kuò)增基因組。反應(yīng)程序94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性45秒，相應(yīng)的退火溫度30秒，72°C延伸35秒，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)35次。最后72°C充分延伸8分鐘。I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物用PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)。共得到9個(gè)有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9 ；Pol為360個(gè)核苷酸，Po2為471個(gè)核苷酸，Po3為447個(gè)核苷酸，Po4為408個(gè)核苷酸，Po5為463個(gè)核苷酸，Po6為497個(gè)核苷酸，Po7為424個(gè)核苷酸，Po8為509個(gè)核苷酸，Po9為342個(gè)核苷酸。11)結(jié)果分析使用Cervus3. O軟件計(jì)算期望雜合度和觀察雜合度。使用Genepop3. 4軟件計(jì)算哈代-溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來描述9個(gè)玉竹微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點(diǎn)的特征。由附圖1-12可看出，本發(fā)明的9個(gè)微衛(wèi)星序列的長(zhǎng)度在供試的21個(gè)玉竹中都出現(xiàn)的多祥性，由此可見，本發(fā)明的這9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記能用于研究玉竹的遺傳多祥性，黃精屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系，具有很高的重復(fù)性，是ー種可靠有效的分子標(biāo)記。表I引物特性表 位點(diǎn)基序弓}物序列退火溫度(gC) _
Fol (GA).,Pol-F CM CTA AGG AM GTG CTC TTC TM C56
Pol R CTC TAC CTA TGA GTG GTG CTA AAC Po2 (TCCh(TC) lb Po2-F TTG AGA TTA GAC TTT At TGG GTG57
Po2 R TGA ATA (11 GCC TTA GM ATG CG Po3 (GA)bPo3 F CTT CM CGT GM GTG AGG GTG63
Po) Ii CIG (TA TTT ΓΓΤ CkT ATC TGT AT Pol (Cd)..PoJ I- \W iTT GGA ΛΤ(； ΛΤ
權(quán)利要求
1. 一種玉竹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，其特征在于所述微衛(wèi)星標(biāo)記的標(biāo)號(hào)分別為Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9 ； 其核苷酸序列分別為 Pol gatcacatgc cgatagttcc tcggtcacct agcatattta gtgtcagtct tctagctggc60gaataaaaac actaagtcga aatgaactaa ggaaagtgct cttctaactg tgagagagag120agagagagag agagagagag agagagagag agatgttggt ccatccctca tggtgtactg180tggatttcat tttgcgctct ctagctaatt ggattttagt cagatttttc tagttagttt240agcaccactc ataggtagag ctgtaaaatg aactgagttt tggagtgttt gtgttcgttc300aataatttac acgagtttaa atttagctga ttctatatga acccaaacaa atactcaatt360Po2 gatcacagat catgatctgg tcaaccagaa acccccgtgt ctgaccctga ggatacagat60accctctgcc tggtcacagg acctgggttg gttggccaga cagtgcccag gtcgaccccg120acctattttg ggctgttatt ggttttcttt ggtgttagta ggttttgttg gtttcttatt180gggtttttga cttatataac tataacctac ttcatctaag gtttagattt gttttgtttt240attttggatg gttgagatta gactttaggt gggtgtttcc ctatatatac catctccaaa300ccctagaacc cattcctcct cctcctcctc tctctctctc tctctctctc tctctctctt360gagcaactct ctttaagagc tagggcagag aatttagggg aagatttggg atttttgctg420 aggttttctt cgtggatttg caagcttcgc atttctaagg caagtattca t471 Po3 gatcatgcat atttgtttat agctagcttc ccatcaacgt acgtccgttg catttgattt60gattttcaaa gtattaggac ttgaacgtga agtgagggtg ggaactggga actaggactc120ggatgagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga tatgctgcag 180gaacttgtgg ataaatagag atatgtgtgg cactctctca ttgattatac ttagttcact240ctctcgaaac gccacagaga tagacaaagg cttgattgtt agatcagcat acagatggca300agaaatggca gcggttatgc ttgctagttt ggtgagtggt gagacatttt gtcctctctg360gccgtcgtac ttgctataaa gacgacgtgg aaaggcccga ccacgagaat gccgaccgca 420 tcgtttttcg acgataatgt tgttttt447 Po4 gatcacgaac ttggaagctt cgactttggt gattgttgga gtgagctaca aattgaagag60ggtgggtttg cttgagctca tgaataagag gaagggagga gcttggcttt ctcttgaaaa120aggaatgaga atgaaaagag agagaggggg aggaattgtt tttatcaagg gggcatggtg180cattaaatgc ttggaatgat ggagtgctgg gtattaaatg gaggagggag agagagagag240agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagtg atgggacttt 300tctcatccat gaatgagaca aagttaacaa gagggatgtt aacaattcaa actggtaaaa360 cacatgagtg aaccaaacca gtccacgaat cgcagtaatt cgactgtg408 Po5 gatcttgtgc caacctcgct attaaactcc ttctttagct cgtaacaaca ccattgctct60tccactactc aatctacgcc ttcactgtgt ccctactttc tagcctcacc ttctctctct120ctctctctcc ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcttc cgttcgcctc180cgggcatttc tttagccacc cggcctccct ttccgccttc cgggctactc tttacctccg240agctatggtt acttcttaca agctggcttt cgggccctcg tttagcactt ttagtgcttt300tagccttcag gcttagcttc ggttactttc acgagttgac tctcgggtcc tcgtttagca360cttttagtgc ttttagcatt cgtacttgct ttccagcctc gcaagagcaa aggaggtgct420 gccaaatttt ctgctgatac tagactgcag cctaactaca atg463Po6 gatcaacatc tccctcacct ttttgcagtg gtttccaagg gcctaaggcc caatctttcg60ctggctcagt gaagttaagc ccaagcttgt ctttttgcag tggtttccat atgtgaagtt120aagcccaagc ttgtcaacat ctccctaata tatatagccc aatctatgta ggcctgccta180gtgggctgaa ttatcctacc acattactcg ctcatattcc accaattccg tatgtggact240gattcagcac cacccaaaac ccgacacgcc tccttcgctt ctccaccaca tccacctcca300cgtgtcggtt tcccccctcc cttctctgtt tcaatattaa ctcctttttc tgtccgaaac360aaaacccatc tcttttctct ctctctctct ctctgtgtgt gttcagtgtt caaggtctca420acaaagagag tagcaatggc gacttcttct tcttcttctt cgactagtcc gctgctgaag480tacgagctgg atatcgt497Po7 gatcatcggc atcgtcgtca agagggatgg agagcgtctc tctcgccttc ggacgctgat60agcagagaga cccatcgatg gagcaacaaa ggaaaacaac caacaaaatc acaacgaaac120 gaagattact tgcttcttcc atcatgaatg agtatgaagt ttaatgtgga atactgtgag180agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggaga240gataatggag gctgcaggca caatttataa tgtggtattt acaaagaaag aaagaaatta300gattttttga gcgtttgatt tgaaaaaaat tgcaacactc tctccttcta tctcttccta360catttgcatg cccatttagt tttcggtttg ggacacgagg gggccttcat aagttgactc420gtgt424Po8 gatcatccgg aatcctgcta gttggccttg gattggaccg gtgtccgtta ccggatccaa60tattgatatc tgtacccgtt tctgtgttta atatagtgga ttgttaattt gaactgtgtt120aatacagttt cctcttgtct ttgatggcat ggcaagagcc ccaccttcct ttgtctaatc180aaagccccat ccccttgcat ttaatacttg ttattcactc tctctctctc tctctctctc240tctctctctc ccatttttta cctcctccct tcccttctct ctttctcttc tcatcttcaa300agagcaacct aagggaagca agagaacacc accacaccaa gagctcttcc aagcctcccc360ttgctccggt gaacactccg gtaagctccg gccgagctcc gacgaactta ggcgagtgcc420atgctttcct tagcctacgg actgtaaatt gtgagctcac gagttcaaga aatctctctt480taaaagagaa gccttaaggg ctattaatt509Po9 cccttaagcc ctcattgctg cccctgacca agccctcgtc tcgccggccg accggtcagc60tgagtaatgg ccaacctggt tagtcgaccg acctcctgct cccaatagag cgccgcctct120ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctcttttcaa atttccccac actccgctta180attcttctcc taactccctg tcactcccta actctcccta attcccaccc taactccctc240tatctctctc actttctctc ctaactctct cgatctcgcc tctaacctat ctgagctccg300gacaactggc atctccacca tattctcttt cactcctcca tt342。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種玉竹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，其特征在于所述的Pol、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9九個(gè)位點(diǎn)的引物序列為Pol-F GAA CTA AGG AAA GTG CTC TTC TAA CPol-R CTC TAC CTA TGA GTG GTG CTA AACPo2-F TTG AGA TTA GAC TTT AGG TGG GTGPo2-R TGA ATA CTT GCC TTA GAA ATG CGPo3-F CTT GAA CGT GAA GTG AGG GTGPo3-R CTG CCA TTT CTT GCC ATC TGT ATPo4-F ATG CTT GGA ATG ATG GAG TGC TPo4-R GAT TCG TGG ACT GGT TTG GTT CPo5-F CTA CGC CTT CAC TGT GTC CCTPo5-R CTC GGA GGT AAA GAG TAG CCP06-FGCT TCT CCA CCA CAT CCA CCTP06-R GTC GCC ATT GCT ACT CTC TTT GTPo7-FGAG CAA CAA AGG AAA ACA ACC AACPo7-R GTG TCC CAA ACC GAA AAC TAA ATGP08-F AGT TTC CTC TTG TCT TTG ATG GP08-R GCA CTC GCC TAA GTT CGT CPo9-F GCA CTC GCC TAA GTT CGT CPo9-R CAG ATA GGT TAG AGG CGA GAT。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玉竹微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，包括玉竹微衛(wèi)星(CT)n富集文庫的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽性克隆的篩選及測(cè)序，得到55個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆，篩選得到了9個(gè)高多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Po1、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9。本發(fā)明可用于研究玉竹的遺傳多樣性，黃精屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系，重復(fù)性好，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102703444SQ20121016528
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者唐王剛, 朱國(guó)萍, 李雪, 王文才, 王暉, 趙曉宇, 鄭基陽, 高鵬 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)