專利名稱：含有一個(gè)或幾個(gè)點(diǎn)突變的青霉素g?；傅闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)及其生產(chǎn)用酶，更具體涉及青霉素G?；讣捌湓讦?內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β -內(nèi)酰胺類抗生素是臨床應(yīng)用中最重要的一大類抗生素(包括青霉素和頭孢菌素等)，其分子中所含的青霉烷或頭孢烯能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用。天然存在的β_內(nèi)酰胺類抗生素具有抗菌譜窄、不耐酸、容易產(chǎn)生抗藥性和容易引起過(guò)敏反應(yīng)等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)促使了半合成青霉素和半合成頭孢菌素的研發(fā)。青霉素G ?；?penicillin G acylase, PGA, EC 3.5.1.11))可以水解青霉素G(penicillinG，PenG)獲得β -內(nèi)酰胺抗生素工業(yè)中的重要中間體6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid, 6-ΑΡΑ),同時(shí)又可以6-ΑΡΑ為原料合成其他多種合成或半合成β -內(nèi)酰胺類抗生素。因此，PGA是β -內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)中一種具有重要意義的生物催化劑。由于PGA的開發(fā)具有誘人前景，許多科研院所及制藥企業(yè)投入大量的研究，并有大量研究文獻(xiàn)與專利相繼報(bào)道。目前已經(jīng)從許多細(xì)菌中克隆并表達(dá)出編碼PGA的基因，如大腸桿菌(Escherichia co7i,Ec)、嗜朽1 檬酸克呂沃爾氏菌{Kluyvera citrophila’lc)、電氏普羅威登斯菌{Providencia reiigeri, Pr)、幾產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes faecal is, Af) >無(wú)色桿菌木糖氧化屬 iAchromobacter xylosoxidans, Αχ)、假單胞菌屬(Pseudomorms sp,Ps)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium, Bm)與粘節(jié)桿菌 iArthrobacterviscosus，Av)
坐寸ο周政(ActaBiochemica et Biophysica, 35 (6):573_579)、程天凡(2005,浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文)等利用PGA基因家族重排技術(shù)對(duì)PGA基因進(jìn)行改造，分別獲得了合成活性提高的重組體和合成/水解比率提高的重組體；Alkema等(Alkema WBL, 2002，Eur.J.Biochem，269:2093-2100)將a F146和β F24氨基酸殘基分別突變?yōu)榱涟彼?Leu)和丙氨酸(Ala)后，氨芐青霉素和頭孢氨芐的合成性能得到提高。此外，國(guó)際專利申請(qǐng)W096/05318通過(guò)突變底物結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)改變PGA的特異性及合成/水解比率；W098/20210報(bào)道了 EcPGA的α 142和α 146位氨基酸的突變和β24、β56或β 177位氨基酸的突變，特別是突變體i3F 24A突變體合成青霉素和頭孢菌素的產(chǎn)量具有顯著提高；而在W003/055998中，突變體a R145L、a R145C、a R145K雖然具有較高的合成/水解比 率，但合成活性卻大大降低，中國(guó)專利CN101177688所報(bào)道的BmPGA的突變體也顯示了相似的結(jié)果。雖然研究人員已經(jīng)分離純化并克隆表達(dá)出許多天然存在的PGA并進(jìn)行改造，但這些PGA仍有很多方面不盡如人意，如成熟為活性酶的效率不高、合成活性低或合成/水解(S/Η)比率低、生成的副產(chǎn)物多等不足。因此本領(lǐng)域存在對(duì)具有合成/水解比率高、合成活性高和副產(chǎn)物少的青霉素G?；傅男枰?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新的青霉素G?；竿蛔凅w，編碼所述突變體的核酸，相關(guān)表達(dá)載體和宿主細(xì)胞以及所述突變體合成阿莫西林的用途。本發(fā)明的青霉素G?；竿蛔凅w的合成活性和合成/水解比率相比野生型有了較大的提高，副產(chǎn)物降低，原料利用率有了很大提升，降低了成本，減少了能耗和環(huán)境污染。本發(fā)明還構(gòu)建了青霉素G酰化酶突變體的四倍體表達(dá)盒重組菌，使產(chǎn)酶量顯著提高，成本大大降低，節(jié)約了發(fā)酵產(chǎn)酶環(huán)節(jié)的原料、人員及時(shí)間成本。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌{Escherichia coli )ATCC11105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含選自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至八個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a NI IOQ氨基酸突變，以及選自 a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a D154E氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野 生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a N176Q氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a D154E、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a Q204N氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含β E85D氨基酸突變，以及選自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含β K95R氨基酸突變，以及選自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D, β Q233N、PD334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含β Q233N氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β D334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含β D334E氨基酸突變，以及選自 α NI 10Q、a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G酰化酶突變體，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含aQ204N、β E85D氨基酸突變，以及選自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至六個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含aQ204N、β K95R氨基酸突變，以及選自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、β E85D, β Q233N、PD334E 中的任意一至六個(gè)氨基酸突變。·在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a N110Q、a Q204N、β E85D氨基酸突變，以及選自a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E中的任意一至
五個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a D154E、a Q204N、β E85D氨基酸突變，以及選自a NI 10Q、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E中的任意一至
五個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G酰化酶突變體，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a Q204N、β E85D,β Q233N氨基酸突變，以及選自a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β D334E中的任意一至
五個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a Q204N、β E85D,β D334E氨基酸突變，以及選自a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N中的任意一至
五個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a N110Q、a Q204N、β K95R氨基酸突變，以及選自a D154E、a N176Q、β E85D, β Q233N、β D334E中的任意一至
五個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a Q204N、β K95R、β Q233N氨基酸突變，以及選自a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β D334E中的任意一至
五個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a D154E、a Q204N、3E85D、PQ233N氨基酸突變，以及選自aNllOQ、a N176Q、β K95R、PD334E中的任意一至四個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a N110Q、a Q204N和i3K95R氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a D154E、a Q204N和3Q233N氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G酰化酶突變體，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a N176Q、a Q204N和3D334E氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G酰化酶突變體，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a N110Q、a Q204N、3K95R和PQ233N氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G酰化酶突變體，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含a N110Q、a Q204N、βΕ8 和PD334E氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a D154E、a Q204N、βΕ8 和PQ233N氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G酰化酶突變體，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a N110Q、a Q204N、3E85D、PK95R和PD334E氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了青霉素G酰化酶突變體，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上包含a D154E、a Q204N、β E85D、β Q233N 和 β D334E 氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本文所述的青霉素G?；竿蛔凅w的核酸，且所述核酸包括根據(jù)簡(jiǎn)并性編碼本文所述的青霉素G?；竿蛔凅w的核酸。編碼SEQID N0.1所述的青霉素G?；敢吧偷囊环N形式的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本文所述的青霉素G?；竿蛔凅w的核酸的表達(dá)載體?？梢圆捎玫谋磉_(dá)載體包括所有含有必須表達(dá)元件的載體，如Novagen公司的原核表達(dá)ρΕΤ系列的卡那霉素抗性載體及Invitrogen公司的酵母表達(dá)載體ρΑ0815、PPIC3.5等。本發(fā)明所要保護(hù)的突變PGA基因的可采用載體不僅限于舉例載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本文所述的青霉素G?；竿蛔凅w的核酸的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體具有多于一個(gè)拷貝的表達(dá)盒，例如具有二、三或四個(gè)拷貝的表達(dá)盒，優(yōu)選具有四個(gè)拷貝的表達(dá)盒。多拷貝表達(dá)盒的使用可在一定程度上提高酶活。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其包含編碼本文所述的青霉素G?；竿蛔凅w的核酸的表達(dá)載體。 宿主細(xì)胞可以為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核細(xì)胞優(yōu)選選自細(xì)菌、放線菌等，更優(yōu)選大腸桿菌{Escherichia coli),更進(jìn)一步優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。真核細(xì)胞優(yōu)選選自酵母細(xì)胞，更優(yōu)選巴斯德畢赤酵母(Pichia,更進(jìn)一步優(yōu)選巴
斯德畢赤酵母GS115。所述表達(dá)載體可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或侵染等本領(lǐng)域公知方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的青霉素G酰化酶突變體用于催化6-APA和對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(HPGM.HCl)反應(yīng)合成阿莫西林的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了合成阿莫西林的方法，其采用本文所述的青霉素G酰化酶突變體催化6-APA和HPGM.HCl反應(yīng)合成阿莫西林。除非本文另有定義，本發(fā)明使用的相關(guān)科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。而且，除非上下文有其它規(guī)定，單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，而復(fù)數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。通常，與本文所述的分子生物學(xué)、酶學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)使用的命名以及技術(shù)，是本領(lǐng)域眾所周知且普遍使用的那些。除非另有說(shuō)明，下面的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解為具有下述含義:
如本文所用，“青霉素G?；敢吧汀敝赴ＯＪ洗竽c桿菌coli)ATCCl1105的青霉素G酰化酶野`生型，其α、β鏈定義如下:從N端起始依次為:信號(hào)肽:26個(gè)氨基酸；α鏈:209個(gè)氨基酸；連接肽:54個(gè)氨基酸；β鏈:557個(gè)氨基酸。信號(hào)肽及連接肽在翻譯后切除，由α鏈和β鏈組成有活性的青霉素G酰化酶。青霉素G酰化酶野生型的氨基酸序列如SEQ ID N0.1中所述，其一種形式的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所述，且包括根據(jù)簡(jiǎn)并性編碼SEQ ID N0.1所述的青霉素G?；敢吧偷暮塑账嵝蛄小Ｈ绫疚乃茫扒嗝顾谿?；竿蛔凅w”包含野生型多肽內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失和/或添加，和/或野生型多肽中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換。本文所用的“野生型”氨基酸序列包含自然出現(xiàn)的氨基酸序列。本文所用的“青霉素G酰化酶突變體”的具體突變的含義如下:aNllOQ為α鏈上第110位氨基酸N突變?yōu)镼、a D154E為α鏈上第154位氨基酸D突變?yōu)镋、a N176Q為α鏈上第176位氨基酸N突變?yōu)镼、a Q204N為α鏈上第204位氨基酸Q突變?yōu)镹、β E85D為β鏈上第85位氨基酸E突變?yōu)镈、0K95R為β鏈上第95位氨基酸K突變?yōu)镽、β Q233N為β鏈上第233位氨基酸Q突變?yōu)镹、β D334E為β鏈上第334位氨基酸D突變?yōu)镋 (氨基酸名稱和縮寫見表I)。表1:氨基酸名稱和縮寫
名稱I英文名稱I三字母縮寫I單字母縮f
甘氨酸Glycine_Gly_G_
丙氨酸AlanineAlaA
繳氨酸ValineValV
亮氨酸LeucineLeuL
異亮氨酸IsoleucineHeI
腦氨酸ProlineProP
苯丙氨酸PhenylalaninePheF
酪氨酸TyrosineTyrY
色氨酸TryptophanTrpW
絲氨酸SerineSerS
蘇氨酸ThreonineThrT
半胱氨酸Cysteine_Cys_C_
蛋氨酸MethionineMetM
天冬醜胺AsparagineAsnN
權(quán)利要求
1.一種青霉素G酰化酶突變體，其特征在于，所述突變體在SEQ ID N0.1的埃希氏大腸桿菌(Mscherichia coli )ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎(chǔ)上包含選自aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至八個(gè)氨基酸突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G酰化酶突變體，其特征在于,所述突變體包含aQ204N氨基酸突變，以及選自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七個(gè)氨基酸突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于,所述突變體包含aQ204N、β E85D 氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至六個(gè)氨基酸突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G酰化酶突變體，其特征在于,所述突變體包含aQ204N、β K95R 氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β Q233N、β D334E 中的任意一至六個(gè)氨基酸突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aNllOQ、a Q204N、β E85D 氨基酸突變，以及選自 a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至五個(gè)氨基酸突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于,所述突變體包含aD154E、a Q204N、β E85D 氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至五個(gè)氨基酸突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于,所述突變體包含aQ204N、3E85D、PQ233N 氨基酸突 變，以及選自 aNllOQ、a D154E、a N176Q、β K95R、β D334E 中的任意一至五個(gè)氨基酸突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于,所述突變體包含aQ204N、β E85D、β D334E 氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N 中的任意一至五個(gè)氨基酸突變。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G酰化酶突變體，其特征在于，所述突變體包含aNllOQ、a Q204N、β K95R 氨基酸突變，以及選自 a D154E、a N176Q、β E85D、β Q233N、β D334E 中的任意一至五個(gè)氨基酸突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aQ204N、β K95R, PQ233N 氨基酸突變，以及選自 aNllOQ、a D154E、a N176Q、β E85D、β D334E 中的任意一至五個(gè)氨基酸突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aD154E、a Q204N、β E85D、β Q233N 氨基酸突變，以及選自 a NI 10Q、a N176Q、β K95R、β D334E 中的任意一至四個(gè)氨基酸突變。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aN110Q、aQ204N和0K95R氨基酸突變。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aD154E、aQ204N和PQ233N氨基酸突變。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aN176Q、aQ204N和PD334E氨基酸突變。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aN110Q、a Q204N、β K95R和β Q233N的氨基酸突變。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aN110Q、a Q204N、β E85D和β D334E的氨基酸突變。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G酰化酶突變體，其特征在于，所述突變體包含aD154E、a Q204N、β E85D和β Q233N的氨基酸突變。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，所述突變體包含aD154E、a Q204N、β E85D、β Q233N 和 β D334E 的氨基酸突變。
19.一種編碼權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)青霉素G酰化酶突變體的核酸。
20.—種包含權(quán)利要求19的核酸的表達(dá)載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)載體,其特征在于,所述表達(dá)載體具有多于一個(gè)拷貝的表達(dá)盒。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體具有四個(gè)拷貝的表達(dá)盒。
23.—種包含權(quán)利要求20的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
24.權(quán)利要求1-18中 任一項(xiàng)的青霉素G酰化酶突變體用于催化6-ΑΡΑ和HPGM.HCl反應(yīng)合成阿莫西林的用途。
25.一種合成阿莫西林的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的青霉素G?；竿蛔凅w催化6-ΑΡΑ和HPGM.HCl反應(yīng)合成阿莫西林。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的青霉素G?；竿蛔凅w，編碼所述突變體的核酸，相關(guān)表達(dá)載體和宿主細(xì)胞以及所述突變體合成阿莫西林的用途。
文檔編號(hào)C12N5/10GK103074320SQ20121016543
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者余允東, 王曉霞, ?？? 楊曉鵬, 吳清云, 吳會(huì)廣, 馬春艷 申請(qǐng)人:石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司