專利名稱：一株發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株內(nèi)生真菌。
背景技術(shù)：
刺五加為五加科植物刺五加(Acanthopanaxsenticosus (rupr. et Maxim.)Harms)的干燥根及根莖或莖，是既食又藥功能性保健食品。刺五加的活性成分主要有異秦皮唳、紫丁香苷、多糖等，具有抗疲勞，抗炎，抗氧化、免疫調(diào)節(jié)，降壓，降血糖等作用，現(xiàn)廣 泛用于醫(yī)藥和食品行業(yè)。由于刺五加需求量上漲，森林面積逐漸減少以及盲目的采挖，使刺五加資源面臨考驗(yàn)，目前刺五加是國家ニ類重點(diǎn)保護(hù)的瀕危藥用植物。發(fā)酵技術(shù)可以使食品的某些活性成分發(fā)生增減變化，保護(hù)食品中某些活性成分，節(jié)省資源，為食品、藥品活性成分的獲得提供新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌。本發(fā)明發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，它為赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo M 2012042，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為3 5cm，稍有放射狀溝紋，具同心環(huán)紋，菌絲體白色，分生孢子面赭黃色，質(zhì)地絲絨狀，具少量無色滲出液，反面黃褐色，分生孢子頭球形，分生孢梗莖壁粗糙，頂囊球形，直徑25 45 μ m,表面全部可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；笮? 10 μ mX 3 4 μ m,瓶梗大小為8 11 μ mX 3 4 μ m ;分生孢子球形，直徑2. 5 3. 5 μ m。本發(fā)明發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，它為赭曲霉(Aspergillus ochraceus) AJ14,其ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁,通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，AJ14菌株的ITS序列與赭曲霉屬菌菌株的相似性都達(dá)到了 98%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定AJ14菌株為赭曲霉(Aspergillus ochraceus)。本發(fā)明發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，它為赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo M 2012042，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明采用分離自刺五加的內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵刺五加，以刺五加中主要活性成分異秦皮啶為指標(biāo)，比較其發(fā)酵前后異秦皮啶含量的動態(tài)變化，g在提高主要活性成分異秦皮啶的含量，為高效利用刺五加，節(jié)省藥源、開發(fā)新型功能性保健食品提供依據(jù)。關(guān)于采用內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵刺五加的相關(guān)研究目前未見報(bào)道。本發(fā)明刺五加內(nèi)生真菌AJ14分離自健康的野生刺五加的莖。該菌株有孢子，其直徑為25 μ m,通過形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列分析鑒定為赭曲霉(Aspergillusochraceus)，它能使刺五加中異秦皮啶含量顯著提高，因此在以獲得異秦皮啶為目的的原料生產(chǎn)中可以選擇刺五加內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵刺五加以提高得率，節(jié)省藥源。本發(fā)明發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，它為赭曲霉(Aspergillus ochraceus) AJ14,采用AJ14對刺五加進(jìn)行發(fā)酵，HPLC法測定刺五加發(fā)酵前后刺五加主要活性成分異嗪吡啶的含量,其結(jié)果顯示,刺五加內(nèi)生真菌AJ14能使刺五加主要活性成分異嗪吡啶在一定程度上得以顯著提高，說明本發(fā)明對采用內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵刺五加高效生產(chǎn)刺五加中的異秦皮啶成分、節(jié)省藥源具有指導(dǎo)意義。


圖I為具體實(shí)施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14的菌落形態(tài)圖；圖2為具體實(shí)施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14的孢子顯微結(jié)構(gòu)圖；圖3為具體實(shí)施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14基因組DNA的電泳圖，其中M泳道表示Marker ；圖4為具體實(shí)施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖5為具體實(shí)施方式
一中異嗪吡啶對照品的HPLC色譜圖，其中I表示異嗪吡啶；圖6為具體實(shí)施方式
一中刺五加莖的HPLC色譜圖，其中I表示異嗪吡啶；圖7為具體實(shí)施方式
一中刺五加莖經(jīng)ム]14發(fā)酵后的HPLC色譜圖,其中I表不異嗪吡啶。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真 菌，它為赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號為CCTCC No M 2012042，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本實(shí)施方式中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為3 5cm，稍有放射狀溝紋，具同心環(huán)紋，菌絲體白色，分生孢子面赭黃色，質(zhì)地絲絨狀，具少量無色滲出液，反面黃褐色，分生孢子頭球形，分生孢梗莖壁粗糙，頂囊球形，直徑25 45 μ m,表面全部可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；笮? 10μπιΧ3 4μπι，瓶梗大小為8 11 μ mX 3 4 μ m ;分生孢子球形，直徑2. 5 3. 5 μ m。本實(shí)施方式中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,其生長溫度為28°C,生長PH值為自然。本實(shí)施方式中發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，它為赭曲霉 (Aspergillus ochraceus) AJ14,該菌株分離自健康的野生刺五加的莖，采自黑龍江省帽兒山地區(qū),植株年齡3年,植株健壯,無病蟲害。樣品現(xiàn)存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)室；它按以下步驟進(jìn)行分離培養(yǎng)選取健康的野生刺五加的莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成
0.5cm小段，于無菌超凈臺內(nèi)將刺五加的莖按下述方法進(jìn)行表面消毒75%酒精浸泡3 5min-2%次氯酸鈉浸泡15min_無菌水沖洗4次。用無菌手術(shù)刀將樣品從中間切開，分別置于馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基和馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)箱和搖床中培養(yǎng)，待其邊緣及頂端長出菌絲后，及時(shí)挑取菌落轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的培養(yǎng)基中；取最后一次沖洗刺五加莖的無菌水涂布培養(yǎng)平板或取適量此沖洗液倒入馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基內(nèi)作對照，另將消毒后的實(shí)驗(yàn)材料在培養(yǎng)平板上滾動一周作對照，于相同的條件下培養(yǎng)。其中馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，pH值為7. O 7. 2，121 °C下高壓滅菌30min ；馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖和余量的蒸餾水組成，pH值為7.0 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；斜面固體培養(yǎng)基為取5mL馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結(jié)果從野生刺五加莖中分離出內(nèi)生真菌AJ14，并且陰性對照中對照平板和對照液體培養(yǎng)基內(nèi)均無任何菌長出，多次重復(fù)均如此，證明所分到的菌是植物內(nèi)生真菌，而不是表面的附生菌。篩選出的內(nèi)生真菌根據(jù)《真菌分類學(xué)》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，菌株的菌落特征和孢子形態(tài)與赭曲霉屬菌特征極為相近，菌落形態(tài)如圖I所示，孢子顯微結(jié)構(gòu)如圖2所示；分子鑒定內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵液抽濾得菌絲體用25%こ醇漂洗2次，滅菌的去離子水沖洗2次，離心去上清液，然后采用上海生エUNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒提取基因組DNA,然后進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增(凝膠成像結(jié)果如圖3所示)，在500bp (堿基序列見SEQID NO I)附近得到一擴(kuò)增片段，證明已成功從AJ14菌株中提取出其基因組DNA;將含有目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行再一次的點(diǎn)樣，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下用解剖刀將目的條帶切下，用DNA膠回收試劑盒回收，制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接后，連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。挑取單菌落進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR檢測，證明目的片段已成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中后，將克隆陽性菌株送上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。所測定的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用BLAST分析進(jìn)行同源性比較，井根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)研究的基本原理選擇相應(yīng)種屬代表菌株的18S rDNA序列應(yīng)用軟件MEGA5. 03構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定目標(biāo)菌株的分類地位。測得的ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖4所示)，AJ14菌株的ITS序列與赭曲霉屬菌菌株的相似性都達(dá)到了 98%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定AJ14菌株為赭曲霉(Aspergillus ochraceus)。HPLC法測定內(nèi)生真菌AJ14對刺五加發(fā)酵前后異秦皮啶的動態(tài)變化I供試品及對照品溶液的制備(I)色譜條件色譜柱VenusiLXBP-C18 柱(4. 6mm X 250mm, 5 μ m)；流動相0. 1%磷酸-こ腈(80 20)；流速ImL· mirf1 ；檢測波長343nm；柱溫25°C;進(jìn)樣量10 μし (2)對照品溶液的制備
精密稱取異秦皮啶標(biāo)準(zhǔn)品各適量，以甲醇為溶劑分別制成質(zhì)量濃度為I. Omg/mL的對照品儲備液。精確量取對照品儲備液lmL，制成質(zhì)量濃度為O. 25mg/mL的對照品溶液。(3)供試品溶液制備發(fā)酵樣品的制備取干燥的刺五加粉碎，過60目篩。精確稱取粉碎后的刺五加15g，置于三角燒瓶中，按照I : 5的料液比加水，密封后，于121°C高壓滅菌30min，取出，作為底物。將內(nèi)生真菌AJ14在PDA培養(yǎng)基中活化，在已活化好的內(nèi)生真菌AJ14中加入一定量的無菌水，制成I X 107CFU/mL的菌懸液。將5mL菌懸液加入到滅菌后的底物中；另取底物加入5mL無菌水作為空白對照樣品，平行樣品各10份，將所有樣品放入搖床于37°C，培養(yǎng)15天,取出，凍干，備用。生藥對照品溶液的制備取干燥的刺五加莖，粉碎，過40目篩。精密稱取3份刺五加粉末各l.Og，精確加入IOmL甲醇，稱重，超聲提取60min，取出，放冷，以甲醇補(bǔ)足減失的溶剤，以O(shè). 45 μ m微孔濾膜過濾后作為對照品溶液。發(fā)酵樣品供試品溶液的制備精密稱取經(jīng)內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵后的刺五加莖樣品I. Og,精密加入IOmL甲醇，超聲提取60min，取出，放冷，以甲醇補(bǔ)足減失的溶劑，用O. 45 μ m微孔濾膜過濾，即刺五加發(fā)酵樣品供試品溶液?？瞻讓φ掌啡芤旱闹苽淙】瞻讓φ諛悠稩. Og,精密加入IOmL甲醇，超聲提取60min，取出，放冷，以甲醇補(bǔ)足減失的溶剤，用O. 45 μ m微孔濾膜過濾，即為空白對照品溶液。發(fā)酵液對照品溶液的制備精密量取刺五加內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵液各IOOmL,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10mL，以0. 45 μ m微孔濾膜過濾，即為發(fā)酵液對照品溶液。(3)樣品測定在“(I)”色譜條件下，分別精密吸取10 μ L(三次平行)對照品溶液和各供試品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。2檢測結(jié)果在色譜條件下，供試品溶液與異秦皮啶對照品相應(yīng)位置的色譜峰一致，而且色譜峰經(jīng)過對照品加入法得到了較好的確認(rèn)，結(jié)果見圖5，圖6，圖7和表1，實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵后，刺五加莖中異嗪吡啶的含量有極顯著的提高。表I刺五加莖中異嗪吡啶的含量測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，其特征在于它為赭曲霉(Aspergillus ochraceus) AJ14,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo M 2012042，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，它涉及一株內(nèi)生真菌。發(fā)酵刺五加提高刺五加中異秦皮啶含量的內(nèi)生真菌，它為赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NoM 2012042，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明中赭曲霉AJ14對刺五加進(jìn)行發(fā)酵，HPLC法測定刺五加發(fā)酵前后刺五加主要活性成分異嗪吡啶的含量，刺五加內(nèi)生真菌AJ14能使刺五加主要活性成分異嗪吡啶在一定程度上得以顯著提高，說明本發(fā)明對采用內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵刺五加高效生產(chǎn)刺五加中的異秦皮啶成分、節(jié)省藥源具有指導(dǎo)意義。
文檔編號C12R1/66GK102676404SQ201210171139
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者崔宇, 徐翠, 鄭春英 申請人:黑龍江大學(xué)