專利名稱：檢測PJVK基因c.437G>A突變的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因檢測領域，具體涉及用于檢測PJVK基因突變基因的試劑盒；本發(fā)明還涉及PJVK突變基因及其在診斷和/或治療感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的應用。
背景技術：
聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙(Auditory Neuropathy SpectrumDisorders，ANSD)是一種耳蝸外毛細胞功能正常，但聲音信號不能同步地從內(nèi)耳傳輸?shù)酱竽X的聽覺障礙性疾病，系聽覺信息傳輸處理過程的異常。聽力學檢查表現(xiàn)為以低頻聽力減退為主的聽力損失，聽性腦干反應不能引出，耳蝸微音電位和耳聲發(fā)射多正常。該類疾病于上個世紀90年代被定義和命名，是一種新認識的聽力障礙性疾病，在高危嬰幼兒中的發(fā)病率約為0. 23%,在各種原因所致的ABR異常的聾病患兒中發(fā)病率則高達11%，是導致嬰幼兒 和青少年言語交流障礙的重要聽力障礙性疾病之一。然而，其病因、病變部位和發(fā)病機制尚不十分明確，導致藥物治療、佩戴助聽器及人工耳蝸植入術效果的預測和評估上存在難度。近幾年來，一系列感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關基因的發(fā)現(xiàn)，從分子水平揭示了聽神經(jīng)病譜系障礙的病理機制。根據(jù)不同基因?qū)е碌牟煌∽儾课粚β犐窠?jīng)病譜系障礙進行分型，可為聽神經(jīng)病譜系障礙的臨床治療提供理論依據(jù)。Starr教授等根據(jù)發(fā)病部位的不同將其分為TYPE I型(病變部位在聽神經(jīng))和TYPEII型(病變部位在內(nèi)毛細胞、末梢樹突及突觸)國內(nèi)外研究顯示攜帶OTOF基因突變的聽神經(jīng)病譜系障礙患者臨床多以TypeII型表現(xiàn)為主，適合于人工耳蝸植入并可取得較好效果。而攜帶PJVK基因突變的聽神經(jīng)病譜系障礙患者臨床多以TYPE I型為主，其病變部位在聽神經(jīng)，位置深在，人工耳蝸植入術效果欠佳。PJVK基因是與非綜合征型隱性遺傳性感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關的基因。由Del maghani等于2006年首次發(fā)現(xiàn)并命名，也稱為DFNB59基因，位于染色體2q31. I 2q31. 3區(qū)域，DNA序列全長9800bp，含有7個外顯子，其中第一個外顯子為非編碼外顯子。該基因的編碼區(qū)序列，含終止子如SEQ ID NO. I所示，編碼由352個氨基酸組成的蛋白pejvakin (如SEQ ID NO. 2所示)，其中第249 258位氨基酸形成核定位信號基序(nuclear localization signal, NLS),第305 331位氛基酸形成一種可以與DNA相互作用的鋅指結構(zinc-binding domains)。Pejvakin蛋白主要表達于耳蝸Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞以及前三級聽覺傳入通路(耳蝸核、上橄欖復合體、下丘)的神經(jīng)元細胞中，所致感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙的病變部位主要位于聽覺傳導通路，影響動作電位的傳導及細胞內(nèi)物質(zhì)交換。自2006年首次發(fā)現(xiàn)并報道PJVK基因至今，學者們分別在伊朗、摩洛哥、土耳其及荷蘭等患者中發(fā)現(xiàn)了該基因的10余種突變，但少見我國感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者該基因的突變報道。申請人所在課題組針對150名感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者率先開展了該基因的篩查，并發(fā)現(xiàn)我國人群特有的c. 437G>A突變，進而研發(fā)了檢測該基因c. 437G>A突變的試劑盒。該成果有助于快速、高效地在更大范圍的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙人群中進行突變位點的檢測，進而對其定位分型，為感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者開展臨床干預提供重要的指導意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供用于檢測PJVK突變c. 437G>A基因的試劑盒，其技術方案為一種用于檢測與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關的位于PJVK基因的c. 437G>A突變的試劑盒，所述試劑盒包括從待測樣品中提取DNA的試劑；用于擴增樣本DNA的PCR反應試劑；對PCR擴增產(chǎn)物進行測序的試劑； 其中，所述擴增樣本DNA的PCR反應試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴增的目標片段包含PJVK基因第437位堿基。具體地，上述PCR引物為選自PJVK-4F-1 (SEQ ID NO. 3) :5，-CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3，，PJVK-4R-1 (SEQIDN0. 4) :5’ -CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3’ ；PJVK-4F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -TGGCTCTACACACATTTGCT-3’，PJVK-4R-2 (SEQ ID NO. 6) :5’ -ACAAGCCTGACTAGAAATTCAA-3’ ；PJVK-4F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -TACTTTGGCTCTACACACAT-3’，PJVK-4R-3 (SEQ ID NO. 8) :5’ -GCCTGACTAGAAATTCAATAC-3’ ；PJVK-4F-4 (SEQ ID NO. 9) :5’ -GCCTTGATTTACTATTAGGTG-3’，PJVK-4R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-CTATACAACTGCAGCTCTTTC-3，；中的一對。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述試劑盒用于檢測位于PJVK基因的c. 437G>A突變的方法，包括以下步驟I)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA ；2)以該DNA為模板，以PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產(chǎn)物；其中，所述PCR引物擴增的目標片段包含PJVK基因第437位堿基；3)將得到的PCR反應產(chǎn)物進行直接測序，并將測序結果與PJVK正?；虻男蛄羞M行比較，確定是否存在PJVK基因的c. 437G>A突變位點。進一步地，上述檢測方法還包括以下步驟4)按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c. 437G>A突變使氨基酸序列自146位發(fā)生錯義突變，使精氨酸變成組氨酸(P. R146H)。本發(fā)明的又一個目的是提供上述試劑盒在用于檢測感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的用途，為在感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者中開展易感基因篩查提供方便確實的方法；同時可以指導臨床治療，并為將來利用這一突變作為靶點開展耳聾的基因治療提供堅實的基礎。使用本發(fā)明的試劑盒的檢測方法為通過檢測來自于患者的待測樣本中是否存在PJVK基因c. 437G>A突變，而判斷該患者感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生原因及類型。其中，PJVK基因的c. 437G>A堿基改變引起氨基酸編碼過程中在437位發(fā)生錯義改變，導致編碼的精氨酸變成組氨酸(P. R146H),進而影響pejvakin蛋白的正常功能。PJVK基因突變相關的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙以常染色體隱性遺傳的方式傳遞。發(fā)明人應用候選基因篩查的方法對150例非綜合征型感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者和99例聽力正常且無家族史的對照進行篩查，在一例聽神經(jīng)病譜系障礙患者發(fā)現(xiàn)PJVK基因的c. 437G>A突變，而這一突變位點高度保守且在99例正常人對照組中未發(fā)現(xiàn)該突變，目前國際上報道與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關的PJVK突變有10余種，尚無c. 437G>A突變的報道，該突變?yōu)橹袊巳盒掳l(fā)現(xiàn)的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙致病突變。圖I給出PJVK編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對照圖，并示出突變位點(方框標記處)，該突變使位于PJVK基因編碼區(qū)的第437位的G堿基變?yōu)锳堿基，使得146位的精氨酸變?yōu)榻M氨酸(P. R146H)，突變發(fā)生后影響基因表達蛋白的正常功能。檢測該突變可用本領域的任何檢測點突變的方法來進行，例如PCR (聚合酶鏈反應)一測序法、采用標記的PJVK基因DNA探針雜交法或用限制性片段長度多態(tài)性方法或序列特異性引物的方法等等。在本發(fā)明的一個實施方案中，采用PCR擴增-直接測序法來檢測樣本，具體包括下述步驟I)采集待測個體的樣本，例如血液、體液或組織，提取基因組DNA ；2)以該DNA為模板，以針對PJVK基因或PJVK編碼區(qū)第437位堿基附近設計的PCR引物進行PCR反應，得到PCR擴增產(chǎn)物；3)將得到的PCR產(chǎn)物進行直接測序分析，將所得到的序列與PJVK正常基因的序列進行比較，確定是否存在PJVK突變位點。4)根據(jù)以上結果判斷待測個體是否為PJVK基因突變c.437G>A導致的聽神經(jīng)病譜
系障礙。進一步的，該方法可以選擇性的包括如下步驟5)按正常閱讀框進行翻譯以確定第146位氨基酸是否存在精氨酸到組氨酸的錯義突變(p. R146H)。在發(fā)明人進行的實驗中，通過聾病門診及資源收集網(wǎng)絡收集各種感音神經(jīng)性耳聾患者，包括聽神經(jīng)病譜系障礙患者，建立資源庫。在患者自愿的前提下，簽署知情同意書后，留取5-10ml血樣，并建立門診病歷資料庫，詳細記錄患者病情、家系中的發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。然后，應用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA，定量后入庫，-20° C保存，每份DNA樣品均詳細對應于登記的患者臨床資料。然后，應用在線引物設計軟件Primerf設計引物，包含PJVK整個編碼區(qū)，應用PCR擴增。PCR產(chǎn)物直接測序測序引物與PCR擴增引物相同，正反向測序，應用ABI公司3700DNA測序儀。得到的序列與Genbank中的序列(登錄號NC_000002. 11)比較確定PJVK突變位點。按正常閱讀框進行翻譯以確定PJVK的突變位點。上述步驟2所得到的PCR反應產(chǎn)物還可以用雜交探針來檢測，所用的雜交探針可以是與正常的PJVK核苷酸序列雜交，或與突變的核苷酸序列雜交，或與它們的互補序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)標記，尤其是可利用等位基因特異探針，也可用限制性酶切的方法篩查是否存在已被確定的突變。
因此，檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑選自測序檢測試劑、限制性內(nèi)切酶酶切檢測試劑、限制性長度多態(tài)性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑和探針雜交檢測試劑。在上述方法中使用的PCR引物可以依據(jù)已知的核苷酸序列設計，通常為15 30個堿基，GC含量為45 50%左右，在適當?shù)臏囟认屡c末端特異性結合，其可以利用專門的計算機程序設計。在本發(fā)明的一個具體實施例中，應用在線引物設計軟件primer 3. 0設計了一對PCR引物，其序列為上游引物PJVK-4F-1:5’-CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3’(nt4328_nt4349)下游引物PJVK-4R-1:5’-CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3，(nt4942_nt4963)
PJVK正?；虻臉藴市蛄锌梢詤⒖祭鏕enbank NC_000002. 11。用于檢測PJVK基因c. 437G>A突變的試劑盒中可以包含以下試劑用于擴增樣本DNA中PJVK基因或PJVK基因編碼區(qū)第437位堿基附近的PCR引物；以及以下一種或幾種試劑的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；PCR反應試劑；對PCR擴增產(chǎn)物進行直接測序的試劑。例如，本發(fā)明的一個實施方案中提供一個檢測PJVK基因c. 437G>A突變的試劑盒，容器內(nèi)裝有用以檢測PJVK基因c. 437G>A突變的成分，與之同時提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機構審核的、有關藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如，采用PCR擴增后，直接檢測樣品中PJVK基因c. 437G>A突變位點的試劑盒，可含有擴增引物、dNTPs、用于PCR反應的DNA聚合酶及其緩沖液、或測序反應所需試劑等的一種或多種。本領域技術人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一對PJVK-4F-1和PJVK-4R-1弓丨物，所述用于PCR反應的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(I)提取待測血樣的DNA，利用上述的一對PJVK-4F-1和PJVK-4R-1引物，進行PCR反應，得到PCR反應產(chǎn)物；(2)PCR反應產(chǎn)物純化后直接測序，將所得的序列與Genbank中的標準序列比較確定突變位點的存在；所述步驟還可進一步包括(3)按正常閱讀框進行翻譯以確定第146位氨基酸是否存在精氨酸到組氨酸的錯義突變(P. R146H)。該試劑盒可簡便快捷地檢測PJVK突變位點，從而應用于感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關基因的檢測及其診斷或治療方法中。本發(fā)明也提供了 PJVK突變基因在診斷或治療人類感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的應用。通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在PJVK基因c. 437G>A突變而判斷該患者的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生原因及類型，進而為臨床診斷和治療提供依據(jù)；此外，在進一步的臨床治療方面，在檢測為發(fā)生了 PJVK基因c. 437G>A突變之后，可以將正常基因?qū)霐y帶突變基因的細胞并在其中表達，它可與內(nèi)源性突變基因發(fā)生重組，從而可以進行基因治療。本發(fā)明提出了通過檢測患者中是否存在PJVK基因新的突變而診斷感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生的原因和類型的檢測方法，這將有利于為不同類型感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者確定個體化治療方案。下面結合附圖，通過對本發(fā)明較佳實施方式的說明，詳細描述但不限制本發(fā)明。


圖I為PJVK基因編碼區(qū)核苷酸與氨基酸的對照突變位于PJVK基因第437位中的G堿基，用方框圈起來的是突變的堿基和對應的氨基酸，突變后的堿基序列使第146位氨基酸發(fā)生精氨酸到組氨酸的錯義突變(P. R146H)。圖2為本發(fā)明方法中PCR反應過程示意圖，示出了反應溫度和時間，其中*表示每個循環(huán)降低0.5°C。圖3為本發(fā)明方法中，對PCR產(chǎn)物進行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置。 圖4為本發(fā)明方法中PJVK基因測序結果的局部圖，方框示感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者突變位點位置；其中圖4A是PJVK基因雜合突變測序結果；圖4B是野生型PJVK基因測序結果。
具體實施例方式本發(fā)明所用試驗材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。實施例I待測血樣提取與PJVK基因編碼區(qū)的PCR擴增一、待測對象血樣DNA的制備I、研究對象對150例散發(fā)非綜合征型感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者和99名無家族史的聽力正常對照按照下述方法進行PJVK基因的篩查。150例患者中，I例患者表現(xiàn)為典型的聽神經(jīng)病譜系障礙異常聽功能特征，經(jīng)過的臨床觀察和系統(tǒng)的聽功能檢查后確診為非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙。對這例聽神經(jīng)病譜系障礙患者的PJVK基因檢測發(fā)現(xiàn)患者為雜合的c. 437G>A突變。對99名聽力正常者的篩查中未發(fā)現(xiàn)c. 437G>A突變者。對所有參加者詳細調(diào)查其病史以及家族史，并對其進行體格檢查，耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學評估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5 10ml。2、基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18° C 28° C)，上面鋪一層I倍體積已稀釋的血液，室溫，IOOOXg,離心20分鐘。3)吸棄上清液，小心吸出中間有核細胞層，轉(zhuǎn)入5ml Ep管中，5000 Xg,離心10分鐘，然后用PBS洗一次。5000Xg,離心10分鐘。4)將細胞懸于 2ml TE 緩沖液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，pH8. 0)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至終濃度 0.5% (100 iil)，蛋白激酶 k 100 200 ii g/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小時。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，5000Xg，離心10分鐘。
6)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。7)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。9)加入2. 5倍體積的無水乙醇。10)-20。C 沉淀 DNA 過夜。第二天11)高速離心，10000Xg，10 分鐘，4。C。12)棄上清液，加入75%乙醇2ml，高速離心10000 X g，5分鐘13)棄上清液,吹干。14)用 TE 緩沖液溶解(200 ii I TE/5ml 全血，400TE/10ml 全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計定量。二、PJVK基因編碼區(qū)的PCR擴增I、引物序列上游引物PJVK-4F-1:5，-CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3’(nt4328_nt4349)下游引物PJVK-4R-1:5’-CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3’(nt4942_nt4963)注PJVK基因序列檢索號NC_000002. 112、PCR反應體系的建立(表I)表IPJVK基因的PCR反應體系
權利要求
1.一種用于檢測與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關的位于PJVK基因的c. 437G>A突變的試劑盒，所述試劑盒包括 從待測樣品中提取DNA的試劑； 用于擴增樣本DNA的PCR反應試劑； 對PCR擴增產(chǎn)物進行測序的試劑； 其中，所述擴增樣本DNA的PCR反應試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴增的目標片段包含PJVK基因第437位堿基。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其中所述PCR引物為選自下述引物中的一對 PJVK-4F-1:5’ -CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3’，PJVK-4R-1:5’ -CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3’ ；PJVK-4F-2:5，-TGGCTCTACACACATTTGCT-3，,PJVK-4R-2:5> -ACAAGCCTGACTAGAAATTCAA-3’ ；PJVK-4F-3:5， -TACTTTGGCTCTACACACAT-3，,PJVK-4R-3:5’ -GCCTGACTAGAAATTCAATAC-3’ ；PJVK-4F-4:5， -GCCTTGATTTACTATTAGGTG-3，,PJVK-4R-4:5， -CTATACAACTGCAGCTCTTTC-3，。
3.如權利要求I或2所述試劑盒，所述試劑盒用于檢測位于PJVK基因的c.437G>A突變的方法，包括以下步驟 1)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA； 2)以該DNA為模板，以PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產(chǎn)物； 其中，所述PCR引物擴增的目標片段包含PJVK基因第437位堿基； 3)將得到的PCR反應產(chǎn)物進行直接測序，并將測序結果與PJVK正常基因的序列進行比較，確定是否存在PJVK基因的c. 437G>A突變位點。
4.如權利要求3所述試劑盒，其中所述方法進一步包括下述步驟 4)按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c.437G>A突變使氨基酸序列自146位發(fā)生錯義突變，使精氨酸變成組氨酸(P. R146H)。
5.如權利要求I所述的試劑盒在用于檢測感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測PJVK基因c.437G>A突變的試劑盒，通過檢測患者中是否存在該突變基因而診斷感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生的原因和類型。該突變基因和檢測方法將有利于臨床上開展感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者的PJVK突變篩查工作，為感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者的診斷和治療提供依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102732614SQ20121017175
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權日2012年5月29日
發(fā)明者王秋菊 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院, 王秋菊