專利名稱：單核細胞增生李斯特氏菌核酸標準樣品、其建立方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品檢測技術領域，具體涉及單核細胞增生李斯特氏菌核酸標準樣品制備、其建立方法及其在檢測單核細胞增生李斯特氏菌中的應用。
背景技術：
食品安全是重大公共衛(wèi)生問題，是制約我國經濟發(fā)展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我國食品安全中最突出的問題。近年來，隨著食品產業(yè)結構的調整、經濟全球化與國際貿易的迅速發(fā)展，我國食源性疾病的防控面臨一系列新問題和挑戰(zhàn)。
食品中微生物引起食源性疾病的預防與控制已引起了世界各國關注，食品中微生物的檢測技術是預防與控制的關健的技術環(huán)節(jié)。目前我國食品中微生物的檢測仍以傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)、血清抗體檢測、和生化特征比較水平為主，不能滿足日益發(fā)展的檢驗檢疫工作的需要。常規(guī)分離培養(yǎng)耗時長，靈敏度低，某些微生物的培養(yǎng)極為困難。隨著2007年《食品中致病菌檢測方法——實時PCR法》(SN/T1870-2007)和《食品中多種致病菌快速檢測方法——PCR法》(SN/T1869-2007)兩項檢驗檢疫行業(yè)標準的發(fā)布實施，以及即將發(fā)布實施的《食品中致病菌檢測方法一DHPLC法》等系列分子生物學檢測國家標準和行業(yè)標準。簡單快速，靈敏度高的PCR、實時熒光PCR技術，正在食品致病菌檢測領域開始發(fā)揮重要作用。由于食品中細菌的特殊性，人們很難獲得細菌分子生物學檢測陽性樣品，加之食品中致病菌分子生物學檢測技術的研究剛剛起步，而配套的標準樣品的研究工作則起步較晚，制備技術復雜，樣品定值和不確定度的評估存在很多困難，因而國內外食品致病菌核酸標準樣品(定量、定性測試)基本上是一片空白。目前國內外沒有適用于食品中致病菌分子生物學檢測用核酸標準樣品，僅有成套分子生物學檢測試劑盒中配備的陽性對照品，價格非常昂貴，也不具備核酸標準樣品的效能，不能適時地滿足檢驗檢疫工作的需要。研究制備新型的食品致病菌核酸標準樣品，對于保證靈敏、特異、快速檢測食品中致病菌，具有十分重要的意義。為了解決食品中致病菌核酸標準樣品目前國內外均處于空白狀況，本項目主要針對食品中致病菌核酸定性和定量檢測項目，研究制備食品中單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品。通過對致病菌核酸標準樣品的關鍵制備技術和保存技術的研究，并進行定值技術和定值方式的研究，開展均勻性和穩(wěn)定性研究，并對食品中致病菌核酸標準樣品的不確定度進行深入細致的研究，最終研制出具有較好的均勻性和穩(wěn)定性的單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品。開發(fā)處于世界領先水平，具有我國自主知識產權的食品中致病菌核酸標準樣品制備技術；滿足食品安全檢測的需求，滿足國內外食品微生物檢測實驗室的需求。

發(fā)明內容
鑒于食品中致病菌單核細胞增生李斯特氏菌核酸標準樣品緊缺的狀況，根據實際工作的需要和國內現狀開展了食品中致病菌核酸標準樣品的研制。本項標準樣品的制備完成，對全面深入的研究解決食品中致病菌核酸標準樣品的制備技術和穩(wěn)定性保證技術，積極開展我國食品中致病菌分子生物學檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義。加之人們對食品安全方面的關注和重視，以及開展食品中致病菌分子生物學檢測工作的日益擴展和重要性，標準樣品又是實驗室質量控制工作的重要環(huán)節(jié)，食品致病菌核酸標準樣品具有廣闊的市場，有較大的經濟效益和社會效益。本發(fā)明所采用的技術方案是單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) ATCC :7644的菌株培養(yǎng)、鑒定、核酸標準樣品的制備、核酸標準樣品的干燥、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、核酸標準樣品定值等項工作。取制備的核酸標準樣品，經采用實時PCR方法和PCR方法定性分析，確認所制備的核酸標準樣品為單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC :7644 核酸樣品。米用 PicoGreen DNA 分子突光定量方法及紫外分光光度法，隨機抽取樣品進行測試，數據進行T檢驗和F檢驗確認樣品均勻性。經Grubbs檢驗和Cochran檢驗,所有數據均可作為定值依據；經正態(tài)性檢驗,這些數據符合正態(tài)分布。制備的核酸樣品經過了四年的穩(wěn)定性測定，在避光、密封，_20°C以下溫度 貯存，四年內穩(wěn)定。本發(fā)明的一方面在于一種單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)標準樣品，其特征在于制備方法的具體步驟如下(一)基因組核酸的提取①單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644經菌株活化、增菌培養(yǎng)；②將步驟①獲得的增菌培養(yǎng)液于4000g，4°C離心15min ；③吸棄上清，取沉淀I 3mL，加pH8. 0的TE溶液IOmL懸浮，加0. 5mL濃度為IOOg/L SDS和50 ii L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ；④加2mL濃度為5mol/L NaCl，混勻，加I. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ；⑤取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ；其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 I ；⑥取上清，加與上清等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，氯仿-異戊醇混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 I ；⑦取上清，加上清0. 6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ；⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. 0的TE溶液溶解，獲得單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因組核酸溶液；⑨紫外分光光度計測步驟⑧所得產物的260nm和280nm處的光密度值，當OD26tl/OD280比值在I. 7 I. 9之間時，分裝核酸樣品并進行冷凍干燥；其中，上文所述pH8. 0的TE緩沖液組成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 pH8. 0 的 TE 緩沖液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. 0 和 Iml0. 5MEDTA PH=8. 0的溶液于500ml燒杯中，向燒杯中加入約400ml蒸餾水均勻混合；將溶液
定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存。
(二)冷凍干燥①樣品預凍先把步驟I所得的核酸樣品溶液在_80°C低溫冷凍2h ；②冷凍過程置干燥室制冷，溫度降至_35°C時開啟冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C時，將預凍的核酸樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；待真空度降至0. 5Torr時，結束冷凍過程；③樣品干燥干燥室溫度設置為15°C，當真空度降至0. ITorr時，關閉真空泵，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋獲得單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC 7644基因組核酸標準樣品，置于_20°C中避光貯存。本發(fā)明的另一方面在于公開一種用于非疾病診斷目的的單核細胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR檢測試劑盒，其包括單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)檢測基因和陽性標準對照品， I.單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC :7644的檢測基因，
包括
單核細胞IfM :個斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的prfA基因PCR引物
—IKI“廠引物 SEQ ID NO I gatacagaaa catcggttgg c 反向 1JI +物 SEQ ID NO； 2 gtgtaatctt gatgccatca g
單核細胞梢4:今斯特氏菌(Ijsieria ntmmcytogenes)特異性實時PCR引物和探針 物 SEQ ID NO 3 ctgaatctca agcaaaacct ggt
反 l“j,j 幽 SEQ ID NO 4 cgcgaccgaa agccaacta
探計 SEQ ID NO 5 y,FAM
-atacgataac atccact.gct ctggctgg -TAMRA-3' |II.所述的陽性標準對照品是按照上述(一廣(二)所述的方法制備的單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的標準樣品。檢測試劑盒的使用方法是以待測樣品的基因組為模板，利用單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC :7644檢測基因，經過 Real-Time PCR反應，結束后確認Real-Time PCR的擴增曲線，先制作標準曲線，最后可以利用公式計算待測樣品中轉基因成分的含量，具體制作和檢測方法參照下述具體實施例，上文所描述的使用方法，是本領域技術人員常用的方式，以此為例，本領域技術人員可以通過結合現有技術的公知常識進行更多拓展。本發(fā)明中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據現有技術確定，并通過配置或商業(yè)途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是本發(fā)明解決了國內食品中致病菌核酸標準樣品緊缺的狀況，對解決食品中致病菌核酸標準樣品的制備技術和穩(wěn)定性保證技術，積極開展我國食品中致病菌分子生物學檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義，并對開展食品中致病菌分子生物學檢測工作，食品致病菌核酸標準樣品具有廣闊的市場，有較大的經濟效益和社會效益。


圖I.單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品制備工藝流程；圖2. PicoGreen染料進行熒光定量的熒光標準曲線。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。DNA提取、PCR反應試劑等基因工程實驗中所用試劑均購于寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司(貨號D9093)；TaqMan Universal Master Mix :購于 ABI 公司；引物和探針寶生物工程(大連)有限公司合成；實時熒光定量PCR儀ABI 7500型。實施例I菌株來源制備單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品所用標準菌株購自于美國標準菌種收藏所(American Type Culture Collection),單核 細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)標準菌株號ATCC :7644。圖I為單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品制備工藝流程圖。本文中，涉及基因工程操作方面的實驗步驟、實驗試劑配制等方法，如無特殊說明，均參考文獻《分子克隆實驗指南》。細菌基因組核酸的提取方法按照GB/T4789. 30-2008[1]進行菌株活化、增菌培養(yǎng)。提取增菌肉湯的DNA，制備核酸標準樣品。(I)取細菌增菌培養(yǎng)液IOOmL,加到500mL無菌離心管中，4000g,4°C離心15min ；(2)吸棄上清，取沉淀lmL，加TE溶液(pH8. 0) 10mL，懸浮，加0. 5mL 100g/L十二燒基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 u L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C溫浴Ih ；(3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混勻，加 I. 5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和0. 7mol/L NaCl)，混勻，65°C溫浴 20min ；(4)取上清，加等體積酚-氯仿-異戊醇混合液，(混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 1)，混勻，6000g離心IOmin ;(5)取上清，加等體積氯仿-異戊醇混合液(混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 1)，混勻，6000g 離心 IOmin ;(6)取上清，加0. 6倍體積異丙醇，輕輕混勻，13000g離心IOmin ；
(7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL TE溶液(pH8. 0)溶解，此即為細菌基因組核酸溶液。其中，上文所述pH8. 0的TE緩沖液組成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 pH8. 0 的 TE 緩沖液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. 0 和 Iml0. 5MEDTA PH=8. 0的溶液于500ml燒杯中，向燒杯中加入約400ml蒸餾水均勻混合；將溶液
定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存。細菌基因組DNA的質量檢查[2](I)直接法——DNA完整性確認用提取的DNA直接電泳檢查，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查結果表明電泳條帶清晰明亮，條帶單一，無雜帶，無RNA，說明提取的DNA質量很好，核酸具有完整性和高分子量?！?2)紫外分光光度計法用紫外分光光度計來檢測提取DNA的0D23(I、OD260, OD280光吸收值。取5 ii L DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值。當0D26Q/0D28Q比值在I. 7 I. 9之間時，適宜于PCR擴增。測試結果表明0D23(l/0D■值小于0. 7，0D26(I/0D■值為I. 9，結果表明所提取的核酸標準樣品DNA質量很好。單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品的分裝及干燥分裝根據所提取的核酸樣品初定值濃度，計算每管分裝體積，分裝樣品；每管單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸樣品含量約為5 U g，將獲得的核酸標準樣品分裝于內置微量管的樣品套管中，分裝400管。冷凍干燥程序( I)樣品預凍先把核酸樣品溶液在_80°C低溫冷凍2h。(2)冷凍過程關好冰凍干燥機的干燥室門，開始干燥室制冷；干燥室溫度降至_35°C時，開始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至_40°C時，將預凍的標準樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空，真空表顯示值開始下降；待真空度降至0. 5Torr時，結束冷凍過程。(3)樣品干燥對干燥室加熱，提高樣品干燥速度；干燥室的溫度設置為15°C。當真空度降至0. ITorr或更低時,表示樣品已干燥好。(4)關閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。核酸樣品按以上冷凍干燥程序制成凍干粉，即單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品；分裝后的樣品加貼唯一丨丨生標識，放置于-20°C中避光貯存。實施例2一定性檢定IPCR 分析
a.儀器PE2400，美國PE公司b.測定取制備的核酸標準樣品，經PCR分析測定
單核細胞增牛.個斯特氏菌(Listeria monocytogenes )的prfA基W PCR rH'Wj: Jl:向 ‘j|物 SEQID NO； I gatacagaaa catcggttgg cJxfiiJ1Jjtt SEQID NO: 2 gtgtaatctt gatgccatca g反應條件預變性94°C,3min ;進入循環(huán)94°C變性60s，60°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環(huán)；
終止延伸72°C，7min;擴增產物長度為210bp，擴增出單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)特異性基因片段,測序后結果證實為單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)。2實時熒光PCR分析a.儀器ABI 7500型實時熒光定量PCR分析儀b.測定取制備的核酸標準樣品，應用單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)特異性引物和探針,經實時突光定量PCR分析測定
1丫核細胞增I':個斯恃氏1 ' (JJs/erki matwcylogcncs)特汁性實時PCR <j|物和探針I(yè)
if; ('1J1JI ft SEQID NO 3 ctgaatctca agcaaaacct ggt反丨“j 引物丨 SEQ ID NO: 4 cgcgaccgaa agccaacta
探針 j SEQ ID NO 5 5'-FAM- atacgataac atccacggct ctggctgg -TAMRA-3'_|其中FAM 為 6-carboxyfluorescein, TAMRA 為6-carboxytetramethyIrhodamine ；PCR所用試劑購于寶生物，使用寶生物Premix Ex Taq試劑盒，貨號DRR039S。FAM (羧基熒光素)吸收波長492nm，發(fā)射波長518nm。反應條件37°C，5min ;95°C預變性3min ;95°C變性5s;60°C退火延伸40s，同時收
集FAM熒光，進行40個循環(huán)。4°C保存反應產物。經ABI 7500型實時熒光定量PCR分析儀檢測，結果證實為單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes):陰性對照檢測結果顯不，FAM通道無突光信號檢出，說明反應結果正常，反應體系無污染；陽性對照檢測結果顯示，FAM通道有熒光信號檢出，反應結果正常根據以上PCR和實時熒光PCR分析的結果，可得出如下結論定性分析結果表明所制備獲得的DNA核酸標準樣品為單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品。二定值方法采用PicoGreen DNA分子熒光定量方法[3 5]測定單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品,進行標準樣品定值。
I.試劑、耗材、主要儀器Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits invitrogen 公司，包括Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent、20 X TE、ADNA 標準樣品；黑色平底96孔板Greiner公司。多功能酶標儀TECANGENios PLUS2. DNA標準曲線繪制(a) DNA標準樣品稀釋、檢測 ①100ug/mL的入DNA標準樣品，用TE稀釋成2ug/mL DNA貯存液。②2ug/mL的X DNA標準樣品貯存液按表I進行稀釋。③每個反應孔按表I所示，再加入ImL Quant-iTTM PicoGreen試劑,混勻,在室溫避光孵育2-5min。④多功能酶標儀檢測。表IDNA標準曲線配制
權利要求
1.一種單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)標準樣品,其特征在于制備方法的具體步驟如下 I 基因組核酸的提取 ①單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC :7644,經菌株活化、增菌培養(yǎng)； ②將步驟①獲得的增菌培養(yǎng)液于4000g，4°C離心15min； ③吸棄上清，取沉淀I 3mL，加pH8.0的TE溶液IOmL懸浮，加0. 5mL濃度為100g/L SDS和50 ii L濃度為20mg/mL的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ； ④加2mL濃度為5mol/LNaCl，混勻，加I.5mLCTAB-NaCl混合溶液，混勻，65 °C溫浴20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ； ⑤取上清，加與上清等體積的酹-氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin;其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 I ； ⑥取上清，加與上清等體積的氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin;其中，氯仿-異戊醇混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 : I ; ⑦取上清，加上清0.6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ； ⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. 0的TE溶液溶解，獲得單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因組核酸溶液； ⑨紫外分光光度計測步驟⑧所得產物的260nm和280nm處的光密度值，當0D26(l/0D28(l比值在I. 7 I. 9之間時，分裝核酸樣品并進行冷凍干燥； II 冷凍干燥 ①樣品預凍先把步驟I所得的核酸樣品在_80°C低溫冷凍2h； ②冷凍過程置干燥室制冷，溫度降至_35°C時開啟冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C時，將預凍的核酸樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；待真空度降至0. 5Torr時，結束冷凍過程； ③樣品干燥干燥室溫度設置為15°C，當真空度降至0.ITorr時，關閉真空泵，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋獲得單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因組核酸標準樣品，置于_20°C中避光貯存。
2.一種用于非疾病診斷目的的單核細胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)檢測基因和陽性標準對照品， I.單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的檢測基因,包括 單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的prfA基因PCR引物 正向引物 SEQIDN0:1 反向引物 SEQ ID NO :2 單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)特異性實時PCR引物和探針 正向引物 SEQ ID NO :3 反向引物 SEQ ID NO :4 探針SEQ ID NO 5 II 所述的陽性標準對照品是權利要求I所述的單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) ATCC :7644 的標準樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開一種單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品、其建立方法及應用，其通過菌株培養(yǎng)、鑒定、核酸標準樣品的制備、核酸標準樣品的干燥、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、核酸標準樣品定值等項工作,獲得一種單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸標準樣品。本發(fā)明解決了國內食品中致病菌核酸標準樣品緊缺的狀況，對解決食品中致病菌核酸標準樣品的制備技術和穩(wěn)定性保證技術，積極開展我國食品中致病菌分子生物學檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義，并對開展食品中致病菌分子生物學檢測工作，食品致病菌核酸標準樣品具有廣闊的市場，有較大的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12N15/10GK102676506SQ201210172208
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權日2012年5月30日
發(fā)明者于兵, 徐君怡, 曹際娟, 趙昕 申請人:于兵, 徐君怡, 曹際娟, 趙昕