專利名稱：一種利用蝦殼制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽，尤其涉及ー種以蝦殼為原料，利用酶解反應(yīng)制備蝦殼血管 緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的方法。
背景技術(shù)：
高血壓是對人類健康危害極大的ー種疾病，可以誘發(fā)一系列心腦血管疾病，并導(dǎo)致人的死亡。據(jù)國家心血管病中心頒布的《中國高血壓防治指南2010修訂版》估計，我國高血壓患病率呈增長態(tài)勢，每5個成人中就有I個患高血壓，我國高血壓患者至少已達2億。控制高血壓已成為我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的ー項刻不容緩的任務(wù)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)普遍存在哺乳動物組織中，是造成人體內(nèi)血壓升高的一大因素。ACE抑制劑能夠抑制ACE的活性，達到降低血壓的目的?，F(xiàn)在的高血壓患者大多數(shù)使用合成ACE抑制劑來控制血壓的升高，合成ACE抑制劑具有作用強、見效快等特點，但對人體正常的腎功能有一定的副作用。從動植物資源中分離的ACE抑制肽，因其對正常血壓沒有影響，沒有毒副作用的特點，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。天然的ACE抑制肽是在1965年從南美茅頭蝮蛇毒液中發(fā)現(xiàn)的，隨后對于其生理功能及開發(fā)應(yīng)用的研究迅速開展起來。現(xiàn)今ACE抑制肽主要由蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解產(chǎn)生，采用的蛋白質(zhì)種類很多，其中主要是陸地蛋白質(zhì)資源，如大豆蛋白，乳清蛋白，玉米蛋白，汗麻籽蛋白等。此外，從海洋生物中提取蛋白制備ACE抑制肽也越來越受到人們的關(guān)注。以食品蛋白質(zhì)為原料制備ACE抑制肽的エ藝原理基本相同，但隨原料的不同其加エエ藝略有差異。一般制備エ藝流程如下原料-蛋白提取-酶解-滅酶-脫苦、脫色-離心超濾分離-離子交換層析分離凝膠色譜層析分離-冷凍干燥-檢驗-成品(梁漢營，劉成梅，劉偉.食源性ACE抑制肽的研究進展.食品研究與開發(fā)，2007，156-158)。申請?zhí)枮椤?00910248611. V，的中國專利申請公開了血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制寡肽的制備方法，以新鮮豬血為原料，通過提取珠蛋白粉末并對蛋白粉末酶解以及對珠蛋白可溶蛋白酶解液進ー步分離、純化得到氨基酸序列為Thr Lys Thr Tyr Phe Pro HisPhe的寡肽。申請?zhí)枮椤?00910220756. 6”的中國專利申請也公開了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的制備方法，以牡蠣漿液為原料，通過對牡蠣漿液酶解所產(chǎn)生的牡蠣蛋白酶解液的進ー步分離、純化得到氨基酸序列為Vel Tyr Pro Trp Thr GlnArg Phe的新肽。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，到2010年，我國對蝦總產(chǎn)量已突破350萬噸。由于蝦類消費而產(chǎn)生的蝦殼和蝦頭等副產(chǎn)物也逐年增多，它們大多被丟棄或是加工成附加值很低的飼料，不但極大地浪費了資源，而且還有可能對環(huán)境造成破壞。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蝦殼中富含甲殼素、蛋白質(zhì)、蝦青素和各種礦物質(zhì)，均可再利用。為了更好地利用蝦殼資源，同時避免其對環(huán)境的污染，近幾年食品科學(xué)研究者關(guān)于蝦殼的利用展開了深入的研究。國內(nèi)關(guān)于利用蛋白酶水解蝦殼制取ACE抑制肽的研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了ー種利用蝦殼制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的方法，解決了蝦類產(chǎn)品加工副產(chǎn)物蝦殼造成的環(huán)境污染的問題，實現(xiàn)了對蝦殼中蛋白質(zhì)的再利用，制得的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽安全性高、無毒副作用，能夠?qū)Ω哐獕夯颊哐獕航档推鸬椒e極的促進作用。 ー種利用蝦殼制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的方法，包括如下步驟a、將蝦殼清洗后烘干、粉碎，制得蝦殼粉，加水配置得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 5%的蝦殼粉溶液；b、調(diào)節(jié)蝦殼粉溶液的pH值為4. 0 10· 0，加入蛋白酶1000 5000U/g蝦殼粉溶液，在攪拌條件下，于20 70°C酶解反應(yīng)I 4小時，得到蝦殼蛋白水解液；C、將蝦殼蛋白水解液滅酶后離心，取上清液，采用截留分子量< IOOOODa的超濾膜進行超濾，得到蝦殼多肽超濾液；d、將蝦殼多肽超濾液濃縮、冷凍干燥，制得血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。烘干可以使蝦殼脫水，便于后續(xù)的粉碎，而且可以使蝦殼中的各種酶失活，阻止蝦殼蛋白質(zhì)的水解、破壞。在4(T60°C下進行烘干，可以有效使各種酶失活，而且不會破壞蛋白質(zhì)的ー級結(jié)構(gòu)，使抑制肽產(chǎn)品具有較高的活性和得率。烘干溫度和時間決定了蝦殼粉中的含水量，一般情況下，烘干時間為12 36小吋，該條件下，蝦殼含水量低，較容易粉碎，蝦殼粉不粘結(jié)，易分散。在酶與底物的反應(yīng)中，底物顆粒體積越小，比表面積越大，與酶接觸的幾率越大，酶促反應(yīng)進行越徹底，但細度過大，有可能破壞內(nèi)部蛋白分子結(jié)構(gòu)，造成產(chǎn)品活性較低，優(yōu)選的，所述蝦殼粉的細度為4(Γ80目，更優(yōu)選有60目。酶解反應(yīng)的溫度和pH值對最終的抑制肽產(chǎn)品活性具有一定影響，而反應(yīng)的溫度和PH值也會影響蛋白酶的活性，因此最好選擇最適溫度和pH值對產(chǎn)品影響較小的蛋白酶，本發(fā)明優(yōu)選為中性蛋白酶，中性蛋白酶的酶解溫度為35 55°C，pH值6. (Γ7. 5，該反應(yīng)條件溫和，對產(chǎn)品活性影響較小。酶的添加量、底物濃度、溫度、pH值和反應(yīng)時間是影響酶促反應(yīng)的主要因素，當(dāng)蝦殼粉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2. 5%，中性蛋白酶添加量為2000U/g蝦殼粉溶液，酶解反應(yīng)的溫度為50°C，時間為2小吋，pH值為7時，酶解反應(yīng)效率較高，反應(yīng)較為徹底，產(chǎn)品得率較高。酶解液中殘留蛋白酶和未分解的蝦殼粉，它們作為雜質(zhì)存在，需要通過離心分離去除，離心的轉(zhuǎn)速和時間對產(chǎn)品的純度有一定影響，本發(fā)明優(yōu)選離心轉(zhuǎn)速為300(Γ5000轉(zhuǎn)/min,時間為l(T20min，在該條件下，雜質(zhì)去除率和產(chǎn)品的得率均較為理想。為了徹底除雜，需對離心獲得的上清液進ー步分離純化，超濾膜是一種有效的高分子分離膜，膜孔徑大小是影響分離效果的關(guān)鍵因素，一般用截留分子量來描述超濾膜孔徑的大小。在蛋白質(zhì)水解物中，活性物質(zhì)的分子量一般低于lOOOODa，而且大部分低于5000Da,因此選用截留分子量< 5000Da的超濾膜進行超濾，既可以保留大部分的活性物質(zhì)，又可以滿足充分除雜的要求。本發(fā)明以蝦殼為原料，對蝦殼中的蛋白進行酶解，分離純化制得血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE抑制肽，同現(xiàn)有的制備方法相比，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點
I)原料豐富易得，所用蝦殼為蝦類加工的副產(chǎn)物，成本低廉，避免了其對環(huán)境造成的污染，增加了蝦類產(chǎn)品的附加值，且制備方法簡單；2)制得的ACE抑制肽分子量較低，可快速進入血液循環(huán)被人體吸收和利用，活性穩(wěn)定，體外實驗表明其對ACE的抑制率高；3)對血壓正常者沒有降壓作用，不會產(chǎn)生降壓過度的問題；4) ACE抑制肽是采用 食用級酶在溫和條件下獲得的，安全性高，無毒副作用，適用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
具體實施例方式實施例I—種蝦殼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的制備方法，采用如下步驟A)將蝦殼清洗除雜，在40°C下烘24小時，烘干樣品用組織粉碎機磨成粉末，將粉末過40目篩，制成蝦殼粉，然后加水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的蝦殼粉溶液；B)將上述蝦殼粉溶液的pH調(diào)節(jié)到6. 5，然后加入中性蛋白酶5000U/g蝦殼粉溶液，置于45°C水浴中水解4小時，反應(yīng)在攪拌狀態(tài)下進行，并保持溫度和pH恒定，得到蝦殼蛋白水解液；C)將上述蝦殼蛋白水解液于95°C水浴滅酶15分鐘，取出冷卻至室溫后，在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液，用截留分子量4000Da的超濾膜進行超濾，得到蝦殼多肽超濾液；D)將上述蝦殼多肽超濾液進行減壓蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥處理，得到蝦殼ACE抑制肽產(chǎn)品。實施例2 一種蝦殼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的制備方法，采用如下步驟A)將蝦殼清洗除雜，在60°C下烘干24小時，烘干樣品用組織粉碎機磨成粉末，將粉末過100目篩，制成蝦殼粉，然后加水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蝦殼粉溶液；B)將上述蝦殼粉溶液的pH調(diào)節(jié)到7. 5，然后加入中性蛋白酶1000U/g蝦殼粉溶液，置于55°C水浴中水解I小時，反應(yīng)在攪拌狀態(tài)下進行，并保持溫度和pH恒定，得到蝦殼蛋白水解液；C)將上述蝦殼蛋白水解液于95°C水浴滅酶15分鐘，取出冷卻至室溫后，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，取上清液，用截留分子量SOOODa的超濾膜進行超濾，得到蝦殼多肽超濾液；D)將上述蝦殼多肽超濾液進行減壓蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥處理，得到蝦殼ACE抑制肽產(chǎn)品。實施例3 一種蝦殼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的制備方法，采用如下步驟A)將蝦殼清洗除雜，在50°C下烘干24小時，烘干樣品用組織粉碎機磨成粉末，將粉末過60目篩，制成蝦殼粉，然后加水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2. 5%的蝦殼粉溶液；B)將上述蝦殼粉溶液的pH調(diào)節(jié)到7，然后加入中性蛋白酶2000U/g蝦殼粉溶液，置于50°C水浴中水解2小時，反應(yīng)在攪拌狀態(tài)下進行，并保持溫度和pH恒定，得到蝦殼蛋白水解液，;C)將上述蝦殼蛋白水解液于95°C水浴滅酶15分鐘，取出冷卻至室溫后，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，取上清液，用截留分子量為5000Da的超濾膜進行超濾，得到蝦殼多肽超濾液；D)將上述蝦殼多肽 超濾液進行減壓蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥處理，得到蝦殼ACE抑制肽產(chǎn)品。分別測定以上三個實施例中蛋白水解液的水解度和多肽超濾液的ACE抑制率，具體測定方法如下水解度(DH)測定水解度(Degree of Hydrlysis, DH)是反映蛋白質(zhì)水解程度的指標(biāo)，可以作為重要的產(chǎn)品質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)。水解度通常定義為DH=h/htotX 100%,式中h為水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g))，ht(rt對于特定的蛋白質(zhì)是常數(shù)，蝦殼蛋白的htot=8. 073mmol/g,因此通過測定被水解的肽鍵數(shù)即可算出相應(yīng)的DH值，即測定每克蛋白水解液中氨基態(tài)氮的濃度。氨基態(tài)氮的測定采用甲醛滴定法。吸取蛋白水解液樣品5mL，置于IOOmL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20. OmL，置于200mL燒杯中，加60mL水，用O. 05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示PH值為8. 2。加入IOmL中性甲醛溶液，混勻。再用O. 05mol/LNaOH溶液滴定至pH9. 2，記錄消耗NaOH毫升數(shù)(V1X用80mL蒸餾水做空白。
權(quán)利要求
1.ー種利用蝦殼制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的方法，包括如下步驟 a、將蝦殼清洗后烘干、粉碎，制得蝦殼粉，加水配置得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I 5%的蝦殼粉溶液； b、調(diào)節(jié)蝦殼粉溶液的pH值為4.(Γ10. 0，加入蛋白酶1000 5000U/g蝦殼粉溶液，在攪拌條件下，于20 70°C酶解反應(yīng)I 4小時，得到蝦殼蛋白水解液； C、將蝦殼蛋白水解液滅酶后離心，取上清液，采用截留分子量< IOOOODa的超濾膜進行超濾，得到蝦殼多肽超濾液； d、將蝦殼多肽超濾液濃縮、冷凍干燥，制得血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述烘干的溫度為4(T60°C，烘干時間為12 36小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述烘干的溫度為50°C，烘干時間為24小吋。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述蝦殼粉的細度為4(Γ80目。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶為中性蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述蝦殼粉溶液的pH值為6.O 7. 5，酶解反應(yīng)溫度為35 55で。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述蝦殼粉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，所述中性蛋白酶添加量為2000U/g蝦殼粉溶液，蝦殼粉溶液的pH值為7，所述酶解反應(yīng)的溫度為50°C，時間為2小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述離心的轉(zhuǎn)速為300(Γ5000轉(zhuǎn)/min，時間為10 20min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在干，步驟c中，采用截留分子量<5000Da的超濾膜進行超濾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蝦殼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的制備方法，包括a、將蝦類洗凈烘干后磨粉過篩，并加水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%~5%的蝦殼粉溶液；b、調(diào)節(jié)pH，加入中性蛋白酶后在恒溫下進行酶解反應(yīng)；c、滅酶進行分離純化；d、濃縮和冷凍干燥制得蝦殼ACE抑制肽。該方法發(fā)獲得的ACE抑制肽分子量較低，可快速進入血液循環(huán)被人體吸收和利用，活性穩(wěn)定；對血壓正常者沒有降壓作用，不會產(chǎn)生降壓過度的問題；ACE抑制肽是采用食用級酶在溫和條件下獲得的，安全性高，無毒副作用；且該方法操作簡單，以價格低廉且豐富易得的蝦殼為原料，增加了蝦類產(chǎn)品的附加值，避免了環(huán)境污染。
文檔編號C12P21/06GK102690854SQ20121017651
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者施旭丹, 王延圣, 羅自生 申請人:浙江大學(xué)