專利名稱：一種用于改良感病水稻品種黑條矮縮病抗性的引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明針對水稻黑條矮縮病主效抗性QTL——提供了ー種利用其緊密連鎖分子標記進行輔助選擇而改良水稻品種黑條矮縮病抗性的方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻黑條矮縮病是ー種主要由灰飛風(fēng)(LaoofeTMar striatellus Fallen)充當(dāng)媒介而傳播的病毒病，感病植株一般表現(xiàn)嚴重矮縮、葉色濃綠、葉片背部葉脈出現(xiàn)短線白色條紋、不能抽穗或包頸穗、穗粒形變小甚至畸形而顯著影響經(jīng)濟產(chǎn)量等癥狀。由于水稻一旦感染該病毒便無法防治，因而被喻之為水稻“癌癥”。該病害上世紀60年代在中國首次發(fā)生， 近年來，隨著耕作制度的變化及暖冬年份的持續(xù)出現(xiàn)，黑條矮縮病在浙江、江蘇、上海等地重新猖獗流行，局部地區(qū)嚴重發(fā)生，而生產(chǎn)上應(yīng)用的絕大多數(shù)品種對該病害均表現(xiàn)感病，給水稻生產(chǎn)造成巨大危害。目前，雖然沒有發(fā)現(xiàn)對黑條矮縮病表現(xiàn)免疫的水稻種質(zhì)，有關(guān)其抗性遺傳、育種研究的報道也較少，但已有報道表明不同類型水稻品種對黑條矮縮病的抗性有明顯差異。本研究小組利用“珍汕97/明恢63”的重組自交系群體，通過2個發(fā)病區(qū)的自然接種鑒定，分別在第6、7、9和11染色體上檢測到6個水稻黑條矮縮病的抗性QTL，均來自于親本明恢63，尤其是第6染色體上R2869-Waxy區(qū)間定位的2個緊密連鎖的QTL (因為是初歩定位，究竟是ー個效應(yīng)較大的QTL，還是兩個緊密連鎖的QTL還不能確定，將其初步命名為の，具有LOD值大、效應(yīng)顯著等特點，具有重要育種價值(潘存紅、李愛宏等，水稻黑條矮縮病抗性 QTL 分析，作物學(xué)報，2009，35 (12) :1_5)。生產(chǎn)上目前對水稻黑條矮縮病的防治主要結(jié)合耕作制度調(diào)整、栽培技術(shù)改進以及適期防治病蟲害等，但往往難以達到預(yù)期效果，且對環(huán)境造成較大污染。培育抗病品種是防治各類病害最經(jīng)濟、有效的手段，具有重要理論和實踐意義。針對定位的主效抗性QTL，通過分子標記輔助選擇的方法，將其導(dǎo)入感病品種的遺傳背景中，可有效改良其抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對第6染色體短臂上的黑條矮縮病主效抗性QTL——qRBSDV-6,提供了其基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的雙側(cè)緊密連鎖分子標記，通過分子標記輔助選擇，將其導(dǎo)入感病品種的遺傳背景中而改良其黑條矮縮病抗性的方法。qRBSDV-6初步定位在標記R2869與Waxy之間，由于R2869和Waxy都是RFLP標記，若直接應(yīng)用于標記輔助選擇，存在工作量大、操作煩瑣等缺點，因而我們根據(jù)上述標記在水稻日本睛基因組序列中的物理位置(RGP網(wǎng)站，http //rgp. dna. afrc. go. jp/)),結(jié)合Gramene網(wǎng)站(http://www. gramene. org)上公布的水稻SSR標記，在標記R2869與Waxy的外側(cè)篩選了 2個在抗性QTL供體親本明恢63與部分感病親本(如淮稻5號、武陵粳I號、揚粳9538等)間具有良好多態(tài)性的SSR標記RM7158和RM587，用于目標抗性QTL iqRBSDV-6)的分子標記輔助選擇。本發(fā)明公開了水稻SSR標記RM7158和RM587在水稻品種黑條矮縮病抗性分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的分子標記RM7158和RM587，分別由下列引物對經(jīng)PCR擴增獲得
1)標記引物RM7158，
正向引物序列，5’ -CGTCCATGGACTTGTTAGC-3，(SEQ ID NO. I)
反向引物序列，5’ -ACGGATACGCCATCCACAT-3，(SEQ ID NO. 2)；
2)標記引物RM587，
正向引物序列，5’ -ACGCGAACAAATTAACAGCC-3’ (SEQ ID NO. 3)
反向引物序列，5’ -CTTTGCTACCAGTAGATCCAGC-3’ (SEQ ID NO. 4)。上述標記中，RM7158在抗性QTL供體親本明恢63中的擴增產(chǎn)物是128 bp,而在感病親本中的擴增產(chǎn)物是144 bp ；RM587在抗性QTL供體親本明恢63中的擴增產(chǎn)物是222bp，而在感病親本中的擴增產(chǎn)物是210bp。本發(fā)明還提供了分子標記輔助選擇改良水稻品種黑條矮縮病的方法，是對以明恢63作抗源，通過雜交或回交等方法獲得的衍生分離群體植株，以待檢測水稻的基因組DNA為模板，由標記RM7158和RM587的2對引物進行PCR擴增，如待檢測水稻的擴增產(chǎn)物中分別有128 bp和222 bp大小的條帶，則該水稻植株攜帶有目標抗性QTL “qRBSDV-6”。DNA 的提取米用常規(guī)的 CTAB 法(Murray & Thompson, 1980 Rapid isolation ofhigh-moIecuIar-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8:4321-4325)。PCR反應(yīng)在EPPEND0RF梯度PCR儀(型號Mastercycler Pro)上進行，擴增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化こ淀(EB)染色后，BIO-RAD凝膠成像儀(型號Gel DocXR)紫外燈下掃描拍照和分析。所述PCR擴增體系為0. 2 Mmolじ1的正、反向引物各I. 5 μ , 200 Mmolじ1的dNTPs 2 μ , IOXPCR buffer 2 μ ，5(Γ 00 ng 的 DNA 模板 2 μ , I U μじ1 的 7 酶 O. 3 μ ,ddH20 10. 7 μ 。所述PCR反應(yīng)條件為94° C預(yù)變性5 min，94° C變性lmin，55° C復(fù)性lmin，72° C延伸I min，35個循環(huán)，最后72。C延伸5min。本發(fā)明的有益效果
O通過本發(fā)明首次用SSR標記限定了水稻品種明恢63中黒條矮縮病主效抗性QTL “qRBSDV-6” ；
2)本發(fā)明分子標記限定的主效抗性QTL立置明確，鑒定方便。通過檢測與
該抗性QTL緊密連鎖的分子標記，可以預(yù)測水稻植株是否含又目標抗性QTL，進而篩選黑條矮縮病抗性單株或品系用于水稻育種。其檢測方法方便快捷，不受環(huán)境影響，加速目標品種培育進程。


圖I為本發(fā)明提供的分子標記RM7158、RM587對明恢63作供體、淮稻5號為輪回親本的BC3F3世代株系的檢測結(jié)果。圖中，Pl :明恢63 ；Ρ2 :淮稻5號;ト18 =BC3F3世代不同基因型株系；R1 :純合抗病基因型；S3 :純合感病基因型。具體實施例方式以下實例結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明范圍。本發(fā)明實施例中所用水稻品種均有現(xiàn)在品種，其中淮稻5號由該品種選育單位江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供；明恢63由該品種選育單位福建省三明市農(nóng)科所提供；武陵粳I號由該品種選育單位揚州大學(xué)提供。實施例I :
I)淮稻5號遺傳背景下攜帯“づ”的近等基因系構(gòu)建
以高度感病的“淮稻5號”為母本，與供體親本“明恢63”雜交獲得F1，然后以“淮稻5 號，，為輪回親本進行連續(xù)回交，從BC1F1分離世代開始，針對不同水稻單株，利用本發(fā)明提供的目標抗性QTLづ”兩側(cè)的SSR標記RM7158和RM587進行基因型檢測。DNA的提
取采用常規(guī)的CTAB法。PCR擴增體系為0.2 Mmolじ1的正、反向引物各I. 5 μ , 200 Mmolじ1的dNTPs2 μ , IOXPCR buffer 2 μ ，5(Γ 00 ng 的 DNA 模板 2 μ , I U μじ1 的 7 酶 O. 3 μ , ddH2010. 7 μ 。PCR反應(yīng)條件為94° C預(yù)變性 5 min，94° C變性 lmin，55° C 復(fù)性 lmin，72° C延伸I min，35個循環(huán)，最后72。C延伸5 min。選擇兩標記均為雜合帶型且農(nóng)藝性狀與輪回親本接近的單株進行回交，經(jīng)過連續(xù)3次回交獲得BC3F1后代后(揚州、海南一年兩季加代)，進行自交，BC3F2分離世代選擇雙側(cè)標記均為純合抗性基因型且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株18個(圖1)，BC3F3世代種植成株系，經(jīng)農(nóng)藝性狀鑒別與評價，最終確定13個與輪回親本最為接近的株系用于后續(xù)的黑條矮縮病抗性鑒定。2)獲得的近等基因系的黑條矮縮病抗性鑒定與評價
2011年正季，在揚州市灣頭鎮(zhèn)里下河地區(qū)農(nóng)科所試驗基地對上述13個近等基因系及對照分兩個播期進行自然誘發(fā)鑒定，以穴發(fā)病率來評價其抗性水平(其方法參見李愛宏、戴正元等，不同基因型水稻種質(zhì)對黑條矮縮病抗性的初歩分析，揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2008，29 (3):18-22)。結(jié)果顯示，兩個感病對照淮稻5號、武陵粳I號在2個播期的自然鑒定試驗中發(fā)病率均超過50%，表明發(fā)病情況充分。方差分析顯示培育的近等基因系其抗性與輪回親本“淮稻5號”相比有顯著改良(表1)，5月5日播種的近等基因系，除MTJ-12外，其余12個株系其黑條矮縮病發(fā)病率一般在20-30%之間，較“淮稻5號”56%左右的發(fā)病率下降25%左右；5月12日播種的近等基因系，同樣除MTJ-12外，其余株系發(fā)病率一般在25-40%，發(fā)病率普遍比5月5日播種的提高約10%，同樣，感病對照“淮稻5號”的發(fā)病率也明顯上升，達到65. 85%，大多數(shù)改良近等基因系的發(fā)病率仍然較輪回親本下降25%左右，充分證明了目標QTL在育種實踐中選擇的有效性。人工接種鑒定采用人工捕捉灰飛虱成蟲接種的方法，將待鑒定株系在5月5日至15日之間播種，出苗后適當(dāng)間苗，保持在120株左右的群體規(guī)模，用60目的尼龍絲網(wǎng)封罩。2葉期開始從周圍秧田采集灰飛虱成蟲，對其進行灰飛虱攜毒率測定后(呂永平，雷娟利等，水稻黑條矮縮病的RT-PCR檢測，浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，14 (2):117_119)，按每苗5頭灰飛虱的蟲量接種，每天人工攪動，5天后噴施殺蟲劑，移栽到田間防蟲網(wǎng)內(nèi)。試驗結(jié)果與兩次分期自然誘發(fā)鑒定結(jié)果基本一致，相關(guān)系數(shù)達到O. 88和O. 87，驗證了自然鑒定結(jié)果的可靠性。由于分子標記RM7158、RM587之間的距離較大，參照日本睛的基因組序列，兩標記間的物理距離達到2000Kb左右，因而其間容易發(fā)生交換重組。株系MTJ-12雖然標記選擇為陽性，兩側(cè)標記均為抗病基因型，但表現(xiàn)感病表型，可能與該株系兩標記間染色體區(qū)段發(fā)生了交換重組有夫。本實例中，標記選擇與抗性表型的吻合率達到92. 31%，充分證明了本方法的有效性。表I不同近等基因系的黑條矮縮病抗性表現(xiàn)
權(quán)利要求
1.水稻SSR標記RM7158和RM587在水稻品種黑條矮縮病抗性分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。
2.用于水稻黑條矮縮病主效抗性QTL分子標記輔助選擇的引物對，其特征在于， 一對是分子標記RM7158的引物,序列為 正向引物，5 ’ -CGTCCATGGACTTGTTAGC-3， 反向引物，5 ’ -ACGGATACGCCATCCACAT-3，； 另一對是分子標記RM587的引物，序列為正向引物，5 ’ -ACGCGAACAAATTAACAGCC-3 ’ 反向引物，5 ’ -CTTTGCTACCAGTAGATCCAGC-3，。
3.一種分子標記輔助選擇改良水稻品種黑條矮縮病的方法，其特征在于，對以明恢63作抗源，通過雜交或回交等方法獲得的衍生分離群體植株，以待檢測水稻的基因組DNA為模板，由權(quán)利要求I所述的標記RM7158和RM587的2對引物進行PCR擴增，如待檢測水稻的擴增產(chǎn)物中分別有128 bp和222 bp大小的條帶，則該水稻植株攜帶有目標抗性QTLqRBSDV-6。
全文摘要
本發(fā)明提供了水稻黑條矮縮病抗性主效QTL——qRBSDV-6的緊密連鎖SSR分子標記及利用標記輔助選擇改良感病水稻品種抗性的方法。對以明恢63作抗源，與感病受體親本雜交、回交的衍生后代分離群體，針對來自于明恢63的第6染色體短臂上的黑條矮縮病抗性主效QTL——qRBSDV-6，通過檢測其雙側(cè)緊密連鎖標記RM7158、RM587的基因型，可將其成功導(dǎo)入感病品種的遺傳背景中，有效提高其黑條矮縮病抗性，選擇效率達到92.31%。該方法操作簡單，快捷高效，為水稻黑條矮縮病的抗性改良提供了一種有效方法。
文檔編號C12Q1/68GK102676685SQ201210177659
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者余玲, 劉廣青, 張小祥, 戴正元, 李愛宏, 李育紅, 潘存紅, 王寶, 肖寧, 趙步洪 申請人:江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所