專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶活性快速測(cè)定試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒及其檢測(cè)方法，尤其涉及一種β -葡萄糖苷酶活性快速測(cè)定試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase)是一類水解酶(EC 3. 2. 1.21),廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在生物體的生理、代謝過程中起著重要作用。近年來，人們對(duì)其催化機(jī)理、分子結(jié)構(gòu)、基因序列等方面都進(jìn)行了深入的研究。β -葡萄糖苷酶用途廣泛，已被應(yīng)用于食品、化工、生物等諸多工業(yè)生產(chǎn)中，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。目前，β -D-葡萄糖苷酶活性檢測(cè)方法有以下幾種一是Barush和Swiain法，以水楊苷為酶反應(yīng)底物，酶解產(chǎn)物用4-氨基安替比林作顯色劑，使釋放出來的水楊醇顯色，再用分光光度計(jì)比色測(cè)定，或者用DNS試劑測(cè)定生成的還原糖量來計(jì)算酶的活力；二是熒光法，利用傘形酮(7-羥基香豆素)與4-甲基傘形酮具有強(qiáng)烈熒光的特點(diǎn)，可以計(jì)算酶活力；三是比色法，以對(duì)-硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物進(jìn)行酶解，底物水解后釋放出來的對(duì)-硝基苯酚可用分光光度計(jì)比色測(cè)定。目前，微生物和植物中糖苷酶活性分析檢測(cè)以對(duì)硝基苯酚-D-葡萄糖苷為酶底物的比色法應(yīng)用最為廣泛和普遍，且該方法操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好。如何將上述的測(cè)定原理通過對(duì)吸收波長(zhǎng)，緩沖液類型、pH值，反應(yīng)溫度和時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，制造出一種機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便的β_葡萄糖苷酶活力測(cè)定試劑盒是技術(shù)人員要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供了一種β -葡萄糖苷酶活性快速測(cè)定試劑盒及其檢測(cè)方法，旨在解決上述問題。一種β -葡萄糖苷酶活性定量檢測(cè)試劑盒，包括Rl、R2、R3和R4試劑，其中Rl試劑100-300mmol/L醋酸鈉緩沖液pH5_6 ；R2試劑10-20mmol/L對(duì)硝基苯基-β -D-葡萄糖苷(pNPG)水溶液；R3試劑200-400mmol/L碳酸鈉溶液；R4試劑10-30mmol/L對(duì)硝基苯酚儲(chǔ)備液。其中所述的生色劑為對(duì)硝基苯酚；所述的緩沖液為醋酸緩沖液。所述的β -葡萄糖苷酶活性定量檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)β -葡萄糖苷酶發(fā)酵液酶活性中的應(yīng)用。其中，利用β -葡萄糖苷酶活性定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)β -葡萄糖苷酶的活性，包括的步驟如下I)樣品制備將發(fā)酵液通過3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上清液既是或?qū)⒕乒腆w酶碾碎定容。2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
依次移取一定量的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用碳酸鈉溶液定容至100_200mL，配成相應(yīng)濃度的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液；吸取l_3mL對(duì)對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入l-3mL醋酸鈉緩沖液；對(duì)照的空白試管中加入l_3mL醋酸鈉緩沖液；在所有的試管中加入5-10mL碳酸鈉溶液，振蕩，在405nm處測(cè)定吸光度OD值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。3)樣品的檢測(cè)向制備好的發(fā)酵液或精制固體酶制劑樣品溶液加入20-40 μ L Rl緩沖液混勻并加20-30 μ L入蒸餾水，在40-60°C下孵育，隨即加入20-40 μ L R2試劑，在40-60C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，最后加入預(yù)冷的試劑100-200 μ L R3終止反應(yīng)，并將反應(yīng)產(chǎn)物在酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)；酶活性單位U定義在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放出I μ mo I的對(duì)硝基酚所需的酶量定義為一個(gè)酶活性單位；樣品中β -葡萄糖苷酶活性(
權(quán)利要求
1.一種3 -葡萄糖苷酶活性快速定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括Rl、R2、R3、R4試齊U，其中Rl試劑為100-300mmol/L醋酸鈉緩沖液pH5_6 ；R2試劑為10-20mmol/L對(duì)硝基苯基-0 -D-葡萄糖苷(pNPG)水溶液；R3試劑為200-400mmol/L碳酸鈉溶液；R4試劑為10-30mmol/L對(duì)硝基苯酚儲(chǔ)備液。其中所述的生色劑為對(duì)硝基苯酚，所述的緩沖液為醋酸緩沖液。
2.權(quán)利要求I所述的3-葡萄糖苷酶活性定量檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)3 -葡萄糖苷酶發(fā)酵液酶活性中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟 1)樣品制備 將發(fā)酵液通過3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上清液既是或?qū)⒕乒腆w酶碾碎定容。
2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 依次移取一定量的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用碳酸鈉溶液定容至100-200mL，配成相應(yīng)濃度的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液；吸取l_3mL對(duì)對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入l_3mL醋酸鈉緩沖液；對(duì)照的空白試管中加入l_3mL醋酸鈉緩沖液；在所有的試管中加入5-10mL碳酸鈉溶液，振蕩，在405nm處測(cè)定吸光度OD值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
3)樣品的檢測(cè) 向制備好的發(fā)酵液或精制固體酶制劑樣品溶液加入20-40ii L Rl緩沖液混勻并加20-30 u L入蒸餾水，在40-60°C下孵育，隨即加入20-40 u L R2試劑，在40_60°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，最后加入預(yù)冷的試劑100-200 UL R3終止反應(yīng)，并將反應(yīng)產(chǎn)物在酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè)； 酶活性單位U定義在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放出I U mol的對(duì)硝基酚所需的酶量定義為一個(gè)酶活性單位； 樣品中葡萄糖苷酶活性
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β-葡萄糖苷酶活性快速定量檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，β-葡萄糖苷酶活性定量檢測(cè)試劑盒包括R1試劑和R2試劑；R1試劑包括一下含量的組分90-110mmol/LpH6.8-7.0緩沖液、1.0-3.0U/L葡萄糖氧化酶、1.0-2.5U/L過氧化酶和0.01-0.1％防腐劑；R2試劑包括以下含量的組分90-11mmol/L pH6.8-7.0緩沖液、100-115mmol/L生色劑、70-100mmol/L麥芽糖、0.2-1.0mmol/L 4-氨基安替比林和0.01-0.1％防腐劑。本發(fā)明還公開了該β-葡萄糖苷酶活性定量檢測(cè)試劑盒在快速檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活性中的應(yīng)用。本發(fā)明僅采用兩種液體試劑，試劑種類和用量都減少了許多；才用分光光度法或酶標(biāo)法，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間；簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟，節(jié)省了試劑，自動(dòng)化，規(guī)?；瘷z測(cè)，在提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的同時(shí)，大大提高了檢測(cè)效率。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK102660633SQ201210177689
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者劉逸寒, 柏桐, 王盛楠 申請(qǐng)人:天津銘恒科技發(fā)展有限公司