專利名稱：基于石蠟的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑保存方法及反應(yīng)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化試劑的保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種基于石蠟的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑保存方法及反應(yīng)試劑，即分子生物學(xué)中等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑及其混合物的保存方法。
背景技術(shù)：
在過去的20年里，以多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為代表的核酸擴(kuò)增技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展和應(yīng)用；最近幾年，產(chǎn)生了一系列新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)。其中，核酸等溫?cái)U(kuò)增(isothermal nucleic acid amplification)能在某一特定的溫度下,擴(kuò)大特定DNA或RNA片段的拷貝數(shù)。核酸等溫?cái)U(kuò)增利用具有特殊功能的生物酶來實(shí)現(xiàn)恒溫條件下對(duì)目標(biāo)核酸的擴(kuò)增；無論在實(shí)際操作還是在儀器要求方面，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)都比PCR技術(shù)更簡單和廉價(jià)，從而更容易被開發(fā)和利用。尤其是在核酸檢測及診斷領(lǐng)域，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)正逐漸成為PCR技術(shù)的替代方法而被廣泛應(yīng)用。利用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開發(fā)的各類檢測及診斷 產(chǎn)品在特異性、易用性、成本和方便性等方面具有PCR技術(shù)產(chǎn)品無可比擬的優(yōu)勢，市場前景極為廣闊。雖然等溫?cái)U(kuò)增技木本身優(yōu)勢明顯，但基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)品在大規(guī)模應(yīng)用過程中卻面臨ー些問題的困擾，其中最為突出的是產(chǎn)品需要低溫冷凍保存和運(yùn)輸。作為核酸擴(kuò)增技術(shù)的ー種，等溫?cái)U(kuò)增需要具有生物活性的酶的參與，而酶生物活性的長期保持需要低溫冷凍條件，同時(shí)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)和反應(yīng)緩沖液等均需在冷凍條件下貯存，反復(fù)凍融會(huì)使這些成份失效。所以基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)品要求在低溫冷凍條件進(jìn)行運(yùn)輸和保存，這ー方面増加了運(yùn)輸成本，另ー方面也限制了這些產(chǎn)品在不具備低溫保存條件的環(huán)境或地區(qū)的應(yīng)用。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)、商品化的基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)品，為了保證產(chǎn)品的一致性、穩(wěn)定性和可靠性，也要求盡可能把各種反應(yīng)試劑一次性添加和分裝，并使產(chǎn)品在貯存和運(yùn)輸過程中具備盡可能長的保質(zhì)期限。因此，發(fā)明一種能夠方便有效保存等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物的方法具有重要的價(jià)值。發(fā)明專利“環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物的保存方法(200810159414. 3)”公開了ー種在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物中添加干燥保護(hù)劑然后進(jìn)行真空干燥或快速風(fēng)干實(shí)現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物常溫長期保存的方法，但這種方法需要專門的真空冷凍干燥儀或快速風(fēng)干機(jī)等復(fù)雜的設(shè)備，還需要消耗大量的能源，并不是ー種十分經(jīng)濟(jì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種利用石蠟實(shí)現(xiàn)核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑在室溫或常溫進(jìn)行長時(shí)間保存的方法。本發(fā)明的目的之ニ是提供ー種通過采用上述方法制備的可在室溫或常溫長時(shí)間保存的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，以及包含該試劑的試劑盒。本發(fā)明的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑保存方法，是將用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的生物酶用石蠟覆蓋或包埋后與 核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的除生物酶外的一種或幾種組分隔離來實(shí)現(xiàn)核酸等溫?cái)U(kuò)增試劑的常溫長期保存的。所述石蠟為熔點(diǎn)介于20°C 90°C的直鏈烷烴、支鏈烷烴或環(huán)烷烴中的任一種或幾種。所述的石蠟為固體石蠟或固體石蠟與液體石蠟的混合物。為了防止常溫保存時(shí)核酸等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)液蒸發(fā)，核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的除生物酶外的一種或幾種組分也用石蠟覆蓋或包埋。上核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的除生物酶外的組分為寡聚核苷酸引物、dNTP和/或NTP、核酸等溫?cái)U(kuò)增的生物酶的反應(yīng)緩沖液中的ー種或幾種。上述的生物酶為DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。上述的生物酶為DNA聚合酶和/或反轉(zhuǎn)錄酶。上述的核酸等溫?cái)U(kuò)增的生物酶的反應(yīng)緩沖液為核酸序列依賴性擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液、鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液。本發(fā)明還涉及ー種可在室溫或常溫長時(shí)間保存的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，是將核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中一種或幾種組分用石蠟包埋或覆蓋來隔離制備的。本發(fā)明還提供ー種可在室溫或常溫長時(shí)間保存的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，包括有上述利用石蠟包埋或隔離的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，以及其它分子生物學(xué)的反應(yīng)組分。采用本發(fā)明方法處理后的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑或其混合物，可常溫貯存和運(yùn)輸，使用時(shí)無需特殊處理，直接使用即可。同時(shí)本發(fā)明的方法具有エ藝簡單、成本低廉的特點(diǎn)，采用本發(fā)明方法處理后的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑或其混合物在便利的貯存條件下(常溫或室溫等溫度條件)具有活性穩(wěn)定持久的優(yōu)點(diǎn)，這在大大降低等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的貯運(yùn)成本的同吋，還為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的實(shí)際操作帶來極大的便利。本發(fā)明將有力促進(jìn)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的在科研、醫(yī)療、檢驗(yàn)和檢疫等領(lǐng)域的運(yùn)用和基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的診斷或檢測試劑產(chǎn)品的大規(guī)模推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式若是直接將等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑如引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)或三磷酸核苷酸(NTP)、生物酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶和內(nèi)切酶等)和生物酶的反應(yīng)緩沖液(不同類型的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)需要不同的反應(yīng)試劑)等的混合物保存在常溫或者室溫條件下，通常情況下廣2天后這些反應(yīng)試劑混合物就失去了對(duì)目的核酸的擴(kuò)增能力。研究發(fā)現(xiàn)，在長時(shí)間保存期間，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液(即等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物)中最容易失去反應(yīng)活性的是生物酶(如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和內(nèi)切酶等，本發(fā)明稱生物酶或酶)，而這些酶喪失活性的主要原因是由于長時(shí)間保存或溫度過高或溫度變化導(dǎo)致酶活性中心維持高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子鍵、ニ硫鍵等分子作用カ受到破壞所致。為了在較長的貯存時(shí)間里維持這些生物酶的活性，生物酶的儲(chǔ)存液中常加入較高濃度的こニ胺四こ酸(EDTA，含量約O. I-ImM)和甘油(含量約50%，質(zhì)量體積比)；EDTA能夠螯合生物酶活性中心的金屬離子大幅度降低酶在貯存期間的活性從而減少其活性損傷；高濃度的甘油能夠隔絕空氣、降低反復(fù)凍融對(duì)酶造成的活性損傷。而預(yù)混的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物中由于EDTA和甘油被稀釋濃度降低，其對(duì)酶的保護(hù)作用也基本喪失。發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑容器(如O. 2mL PCR管)中利用石蠟將儲(chǔ)存液狀態(tài)(Storage Conditions)的生物酶與等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所需其他試劑隔離開(覆蓋或包埋)，能夠在較長的貯存時(shí)間里維持生物酶及等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的反應(yīng)活性；如果同時(shí)再利用石蠟將除生物酶之外的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑與空氣隔絕，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑則能在更長的貯存時(shí)間里維持反應(yīng)活性。當(dāng)需要使用添加了石蠟進(jìn)行封裝的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物時(shí)，可在其中加入核酸模板，用移液器吸頭戳破石蠟封閉層，加熱到一定溫度進(jìn)行保溫，在這ー溫度下石蠟部分熔化或完全熔化并上浮到反應(yīng)體系的上面(石蠟密度低于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合物)，酶與等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的其他試劑混合，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)即可順利進(jìn)行。在較便利的貯存條件下(如常溫或室溫)和一定的貯存期內(nèi)，上述添加石蠟封閉生物酶和等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑組分然后進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)所得的結(jié)果與用新鮮配制的反應(yīng)混合物所得到的結(jié)果完全相同。因不同類型的等溫?cái)U(kuò)增所需的生物酶及最適反應(yīng)溫度不同，所以不同類型的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑或其混合物需要利用不同熔點(diǎn)的石蠟進(jìn)行隔離反應(yīng)體系中的酶和非酶試劑來實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的長期保存。實(shí)際使用中，可根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增所需要的最適溫度選 擇在該溫度下能夠完全或大部分熔化的石蠟以取得較佳保護(hù)及擴(kuò)增效果。以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。實(shí)施例I不同熔點(diǎn)石蠟的制備本發(fā)明中所述石蠟是指熔點(diǎn)在20°C—90°C的直鏈烷烴、支鏈烷烴或環(huán)烷烴的混合物，可以是固態(tài)石臘(paraffin wax),也可以是由固態(tài)石臘與液體石臘(liquid paraffin)按比例混合制得的符合上述熔點(diǎn)要求的混合石蠟。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，所購買的商品化石蠟的熔點(diǎn)與其標(biāo)號(hào)并不是完全對(duì)應(yīng)的，如標(biāo)號(hào)為 60的石蠟需要恒溫60°C — 62°C才能較好的熔化，所以實(shí)施例中未按照石蠟的標(biāo)號(hào)進(jìn)行分類實(shí)驗(yàn)，而是將石蠟的熔點(diǎn)范圍作為分類實(shí)驗(yàn)的依據(jù)，如60°C—62°C所用為標(biāo)號(hào)60的固體石蠟，56°C — 58°C所用為標(biāo)號(hào)56的固體石蠟，以此類推；實(shí)施例中熔點(diǎn)在48°C及以上的石蠟均為按標(biāo)號(hào)購買的商品化石蠟，熔點(diǎn)在46°C及以下的石蠟均為用標(biāo)號(hào)62的固體石蠟(切片石蠟)與液體石蠟按表I比例混合制得。表I.利用不同比例的固體石蠟和液體石蠟配制不同熔點(diǎn)的石蠟
權(quán)利要求
1.ー種核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑保存方法，其特征在于，所述的保存方法是將用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的生物酶用石蠟覆蓋或包埋后與核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的、除生物酶外的ー種或幾 >種組分隔開來保存的。
2.如權(quán)利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的石蠟為熔點(diǎn)介于20°C 90°C的直鏈烷烴、支鏈烷烴或環(huán)烷烴中的任ー種或幾種。
3.如權(quán)利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的石蠟為固體石蠟或固體石蠟與液體石蠟的混合物。
4.如權(quán)利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的、除生物酶外的一種或幾種組分也用石蠟覆蓋或包埋。
5.如權(quán)利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的、除生物酶外的組分為寡聚核苷酸引物、dNTP和/或NTP、核酸等溫?cái)U(kuò)增的生物酶的反應(yīng)緩沖液中的ー種或幾種。
6.如權(quán)利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的生物酶為DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
7.如權(quán)利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的生物酶為DNA聚合酶和/或反轉(zhuǎn)錄酶。
8.如權(quán)利要求5所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等溫?cái)U(kuò)增的生物酶的反應(yīng)緩沖液為核酸序列依賴性擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液、鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液。
9.ー種可在室溫或常溫長時(shí)間保存的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，其特征在于，所述的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑是將核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中一種或幾種組分用石蠟包埋或覆蓋來隔離制備的。
10.ー種可在室溫或常溫長時(shí)間保存的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括有權(quán)利要求9所述的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于石蠟的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑保存方法及反應(yīng)試劑，所述的保存方法是將用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的生物酶用石蠟覆蓋或包埋后與核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的除生物酶外的一種或幾種組分隔離來實(shí)現(xiàn)核酸等溫?cái)U(kuò)增試劑的常溫長期保存的。采用本發(fā)明方法處理后的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑或其混合物，可常溫貯存和運(yùn)輸，使用時(shí)無需特殊處理，直接使用即可。同時(shí)本發(fā)明的方法具有工藝簡單、成本低廉的特點(diǎn)。采用本發(fā)明方法處理后的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑或其混合物在便利的貯存條件下具有活性穩(wěn)定持久的優(yōu)點(diǎn)，這在大大降低等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的貯運(yùn)成本的同時(shí)，還為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的實(shí)際操作帶來極大的便利。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102703431SQ20121018344
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者劉慶慧, 張慶利, 李晨, 李美霞, 楊冰, 黃倢 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所