專利名稱：重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序方法,具體是關于一種設計特定引物、采用二次PCR以實現(xiàn)對重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序的方法。
背景技術：
RNA 干涉(RNA interfering, RNAi)是一種由雙鏈 RNA (double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PGTS)機制，具有普遍的生物學意義。目前RNA干涉的作用機理還不是十分的明確，一般認為有兩個階段。在RNAi的起始期，雙鏈RNA被細胞內(nèi)的Dicer酶(RNA酶III家族成員)切割降解成21-23個核苷酸的小片段干擾RNA (siRNA)，每個siRNA片段均含有2_3個3’突出端和5’磷酸基團，其5’磷酸末端對mRNA的降解有著重要的作用。在效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物形成RNA導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC),在ATP存在的 情況下，雙鏈的siRNA解旋，解旋后的siRNA反義鏈引導RISC到達靶mRNA，通過堿基配對的原則特異性地降解靶序列，從而達到高效特異性沉默目的基因表達。RNA干涉技術能有效、特異性地抑制細胞內(nèi)特定基因的表達，它在基因功能研究、惡性腫瘤的治療和神經(jīng)退行性疾病基因治療方面可能存在著較高的應用價值。目前，siRNA的獲得主要通過化學合成法和siRNA表達載體法，siRNA表達載體法常用的是質(zhì)粒表達和病毒表達，目前常用的病毒有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒。腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70 90nm的顆粒,基因組大小約為36kb,有大約超過50種的腺病毒血清型中，人腺病毒2型及5型研究最為深入，常用作基因轉(zhuǎn)移的載體。因為腺病毒基因組較大，在構建腺病毒載體時，通常將El區(qū)基因切除，把目的基因插入到多克隆位點后與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞內(nèi)進行同源重組，得到腺病毒。目前腺病毒載體法是基因治療中最常用的基因轉(zhuǎn)移方法之一，其具有以下優(yōu)點①克隆容量可達10kb，適合容納較大片段基因腺病毒基因的結構和功能比較清楚，易操作和構建；③宿主范圍廣，能感染分裂狀態(tài)的細胞與感染非分裂狀態(tài)的細胞；④病毒滴度高；⑤安全性好。He等介紹的AdEasy-I系統(tǒng)是通過細菌內(nèi)同源重組來構建腺病毒載體的一種方法，其具有成功率高、不需要電穿孔等優(yōu)點而被廣泛的應用。但是該腺病毒系統(tǒng)中穿梭質(zhì)粒PAdTrack,由于多克隆位點前后序列高度重復，目前尚沒有一種通用的測序引物，從而限制了該病毒系統(tǒng)在RNA干擾領域中的直接應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于針對現(xiàn)有技術中對pAdTrack-shRNA的測序難題，提供一種對重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA進行測序的方法，進而為pAdEasy-Ι系統(tǒng)直接應用于基因沉默方面奠定基礎。本發(fā)明的另一目的在于提供用于實現(xiàn)上述重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA測序方法的引物對。
為達上述目的，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序方法，其中是通過設計特定引物、采用二次PCR以實現(xiàn)對重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序。具體地,該方法包括在多克隆位點前后設計上游引物M和下游引物N，使上游引物M和下游引物N分別在DNA鏈上有2個匹配位點，且引物M的2個匹配位點位于多克隆序列的同側(cè)，引物N的2個匹配位點分別位于多克隆序列的兩側(cè)；進行第一次PCR反應，電泳后膠回收含有多克隆位點的目的條帶；以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進行二次PCR反應，對反應產(chǎn)物進行測序。siRNA發(fā)夾結構可參見圖I所示。本發(fā)明的間接測序的方法具體原理可參見圖2所示在本發(fā)明的方法中，是于多克隆位點前后設計上游引物M和下游引物N，它們分別在DNA鏈上有2個匹配位點，即引物M可以識別A或者A’位點，下游引物N可以識別B或者B’位點。其中引物N的匹配位點在多克隆序列的兩側(cè)，引物M的匹配位點在多克隆序列的同側(cè)。進行第一次PCR反應時其產(chǎn)物會出現(xiàn)以下情況的三條帶I. A點為上游引物識別位點，B’為下游引物識別位點。2. A點為上游引物識別位點，B為下游引物識別位點。3. A’點為上游引物識別位點，B為下游引物識別位點。電泳后膠回收含有多克隆位點的目的條帶，以膠回收產(chǎn)物為模板，M和N為引物進行第二次PCR反應，其產(chǎn)物即可測序，測序引物為M或者N。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法特別適用于重組質(zhì)粒的插入片段小于IOObp的情況。在本發(fā)明的一具體實施方案中，利用本發(fā)明的上述方法，實現(xiàn)了對重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測序。S卩，本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測序方法,該方法包括在多克隆位點前后設計上游引物M和下游引物N:上游引物M :ACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID No. I)下游引物N :TTATGGGACTTTCCTACTTG (SEQ ID No. 2)；進行第一次PCR反應，電泳后膠回收含有多克隆位點的目的條帶(即，含有插入片段的目的條帶)；以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進行二次PCR反應，對反應產(chǎn)物進行測序。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在上述對重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測序方法中，所述第一次PCR反應條件為94°C預變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個循環(huán)；最后72°C延伸5 lOmin。所述第二次PCR反應條件為94°C預變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個循環(huán)；最后72°C延伸5 lOmin。反應體系包括DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸、DNA模板和緩沖液等的備置可以參照所屬領域的現(xiàn)有技術進行。需要說明的是，盡管本發(fā)明的具體實施例是對pAdTrack-IL-Ι β -shRNA進行測序，本發(fā)明的測序方法的思路可以延及對其他類似shRNA小片段的重組質(zhì)粒的測序。另一方面，本發(fā)明還提供了用于實現(xiàn)本發(fā)明所述測序方法例如上述對重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序方法的引物對，即所述的引物對M和N，更具體地，在對pAdTrack-shRNA測序時，所述的引物對M、N分別為所述的引物對SEQ ID No. I和SEQ ID
No. 2o綜上所述，本發(fā)明提供了一種間接的測序方法，針對pAdTrack設 計了引物、通過二次PCR方法，巧妙的完成了對pAdTrack-IL-Ι β -shRNA測序。其設計的思路可同樣應用于所有以PAdTrack質(zhì)粒為基礎的研究，同樣為腺病毒AdEasy-I系統(tǒng)在基因治療的領域應用奠定了基礎。


圖IsiRNA發(fā)夾結構示意圖；圖2 二次PCR原理示意圖；圖3重組穿梭質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖4第一次PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖；圖5第二次PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖；圖6重組穿梭質(zhì)粒的測序圖譜。
具體實施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例及附圖進一步描述本發(fā)明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中未注明具體條件的實驗方法為所屬領域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件；實施例中所用AdTrack載體為電子科技大學神經(jīng)免疫學實驗室保存，感受態(tài)細菌及其它各試劑材料均為寶生物公司商購獲得。實施例I重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的構建首先通過Genbank中報道的大鼠IL-I β基因的mRNA序列(基因編號ΝΜ_031512)。應用 Amhino 公司網(wǎng)站中 siRNA 輔助設計工具(http: //www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder.html)在線尋找IL-I β-siRNA的祀序列。根據(jù)干涉祀點的選擇原則，設計革巴向 mRNA 序列，隨后用 BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast, cgi)對選擇的靶序列進行同源性分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能。設計IL-I β -shRNA表達載體的插入序列結構酶切位點+siRNA序列+環(huán)狀結構+終止序列+酶切位點，為了后續(xù)重組穿梭質(zhì)粒的檢測方便，在設計并合成插入序列模板兩端的酶切位點時僅保留四個堿基，將插入序列連接到穿梭質(zhì)粒上時，此酶切位點因為缺失一個堿基故被破壞掉。加入轉(zhuǎn)錄終止序列(TTTTTT，polyT)是確保轉(zhuǎn)錄準確終止，并在合成DNA的末端設計一個新的Stu I酶切位點，具體堿基序列為TCGAGCACAGACCTGTCTTCCTATTCAAGACGTAGGAAGACAGGTCTGTGCTTTTTTAGGCCT (SEQ ID No. 3)。將合成的寡核苷酸片段用無菌水溶解，按照如下體系進行退火反應正義鏈2ul，反義鏈2ul，退火緩沖液16ul充分混勻后95°C 2min，之后自然冷卻至室溫37°C Ih0產(chǎn)物最后保存于4 C。
將AdTrack載體經(jīng)HindIII和Sal I酶切后，瓊脂糖回收DNA大片段。與退火片段過夜連接，之后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5 α，挑選單克隆菌落，質(zhì)粒提取進行酶切鑒定，結果顯示為 pAdTrack-IL-Ι β -shRNA (見圖 3,M λ -HindIII/DNA Marker ；Γ2 :未酶切質(zhì)粒；3 :質(zhì)粒+Stu I酶切)。實施例2第一次PCR反應因pAdTrack載體多克隆位點前后均為重復序列，對其進行測序時，沒有一個通用的測序引物。本發(fā)明設計引物時遵循以下原則①引物長度在18-25堿基。②引物序列中G+C含量一般為40-55%。③避免擴增模板的二級結構區(qū)域。④引物末端不應超過3個連續(xù)的G或C。按照以后原則在多克隆位點前后設計上游引物M和下游引物N，其具體的序列為上游引物M:ACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID No. I)下游引物N :TTATGGGACTTTCCTACTTG (SEQ ID No. 2)第一次PCR反應體系如下
權利要求
1.重組質(zhì)粒PAdTrack-ShRNA的測序方法，該方法包括 在多克隆位點前后設計上游引物M和下游引物N，使上游引物M和下游引物N分別在DNA鏈上有2個匹配位點，且引物M的2個匹配位點位于多克隆序列的同側(cè)，引物N的2個匹配位點分別位于多克隆序列的兩側(cè)； 進行第一次PCR反應，電泳后膠回收含有多克隆位點的目的條帶； 以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進行二次PCR反應，對反應產(chǎn)物進行測序。
2.根據(jù)權利要求I所述的重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序方法，其中，重組質(zhì)粒的插入片段小于lOObp。
3.重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ιβ -shRNA的測序方法，該方法包括 在多克隆位點前后設計上游引物和下游引物上游引物 SEQ ID No. I ACCTCTACAAATGTGGTATG下游引物 SEQ ID No. 2 TTATGGGACTTTCCTACTTG 進行第一次PCR反應，電泳后膠回收含有多克隆位點的目的條帶； 以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物SEQ ID No. I和下游引物SEQ ID No. 2進行二次PCR反應，對反應產(chǎn)物進行測序。
4.根據(jù)權利要求3所述的測序方法，其中，所述第一次PCR反應條件為94°C預變性45s ;941變性458，59.61退火458，721延伸lmin，共30 35個循環(huán)；最后72°C延伸5 IOmin0
5.根據(jù)權利要求3或4所述的測序方法，其中，所述第二次PCR反應條件為94°C預變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個循環(huán)；最后72°C延伸5 IOmin0
6.一種用于實現(xiàn)權利要求3、任一項所述重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序方法的引物對 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測序方法，該方法包括在多克隆位點前后設計上游引物M和下游引物N，使上游引物M和下游引物N分別在DNA鏈上有2個匹配位點，且引物M的2個匹配位點位于多克隆序列的同側(cè)，引物N的2個匹配位點分別位于多克隆序列的兩側(cè)；進行第一次PCR反應，電泳后膠回收含有多克隆位點的目的條帶；以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進行第二次PCR反應，對反應產(chǎn)物進行測序。利用本發(fā)明的方法，通過設計引物，進行二次PCR反應，可實現(xiàn)對以pAdTrack為基礎的重組質(zhì)粒的測序，為腺病毒AdEasy-1系統(tǒng)在基因治療的領域應用奠定了基礎。
文檔編號C12N15/11GK102864217SQ20121018556
公開日2013年1月9日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權日2012年6月7日
發(fā)明者霍家佳, 游自立, 曹云飛, 徐從倫, 申兵, 佘輝 申請人:中國電子科技集團公司第三十研究所