專利名稱：一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境生物工程，特別是涉及一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria,簡(jiǎn)稱PSB)是具有原始光能合成體系的原核生物的總稱，廣泛分布于海洋、湖泊、土壤、水田等自然環(huán)境中。光合細(xì)菌不僅能在厭氧光照條件下以低級(jí)脂肪酸、多種二羧酸、醇類、糖類、芳香族化合物等低分子有機(jī)物作為光合作 用的電子供體進(jìn)行光能異養(yǎng)生長(zhǎng)，而且能在黑暗有氧條件下以上述有機(jī)物為呼吸基質(zhì)進(jìn)行好氧異養(yǎng)生長(zhǎng)。這種隨生長(zhǎng)條件變化而靈活地改變代謝類型的特性，決定了此類微生物是當(dāng)今世界上最具發(fā)展前景的凈化環(huán)境的生物制劑?；诖?，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)光合細(xì)菌進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用和深入的研究，并對(duì)食品加工、石油加工、印染、農(nóng)藥制造、皮革加工等多種行業(yè)高濃度有機(jī)廢水作了成功的處理。然而，盡管采用光合細(xì)菌法處理有機(jī)廢水具有工藝設(shè)備簡(jiǎn)單、有機(jī)負(fù)荷高、耗能少、菌體可綜合利用、無二次污染等許多優(yōu)點(diǎn)，但也有其不足之處光合細(xì)菌細(xì)胞普遍十分微小(細(xì)胞長(zhǎng)0.5 1.0 Pm)，大部分懸浮在廢水中，易被水中原生動(dòng)物捕食，自然沉降困難，在有限的時(shí)間內(nèi)固液分離效果不理想，從而一方面造成了光合細(xì)菌菌體的流失，使得廢水處理過程中需要不斷添加新鮮菌體；另一方面導(dǎo)致處理后的廢水帶有大量菌體細(xì)胞，使出水具有一定色度，COD和BOD偏高，無法達(dá)到直接排放標(biāo)準(zhǔn)。光合細(xì)菌存在的這些問題，嚴(yán)重影響了其在實(shí)際有機(jī)廢水處理過程中的推廣應(yīng)用。要解決此類問題，可以考慮采用一定的物理或化學(xué)手段使光合細(xì)菌細(xì)胞通過人為作用將其限制在有限的空間中，同時(shí)保持細(xì)菌的生物活性，這就是固定化微生物技術(shù)。常見的固定化載體和包埋材料為聚乙烯醇、海藻酸鈉、瓊月旨、明膠等。然而，將光合細(xì)菌固定在這些化學(xué)載體中常會(huì)抑制細(xì)胞的生物活性，降低體系的物質(zhì)傳遞速率，這些問題在一定程度上影響了光合細(xì)菌對(duì)有機(jī)廢水的處理能力。于是，開發(fā)廉價(jià)、高效的新型載體就成為了固定化微生物技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。隨著微生物在廢水處理中的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)某些微生物(主要是霉菌和放線菌)在液體培養(yǎng)過程中能自動(dòng)聚集形成一定大小的球狀顆粒物，這些顆粒物即為菌絲球，它們是由菌絲纏繞而成，易于吸附其他顆粒物質(zhì)。菌絲球具有諸多優(yōu)點(diǎn)(I)具有一定的親疏水平衡值，有利于細(xì)菌的附著；(2)沉降性能良好，易于固液分離；(3)菌絲球表面有很多空隙，傳質(zhì)擴(kuò)散阻力?。?4)成球和生長(zhǎng)條件寬泛，生產(chǎn)成本低廉；(5)具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠抵抗較大的水流剪切力。菌絲球的這些優(yōu)點(diǎn)也是作為菌體細(xì)胞附著生長(zhǎng)的載體所應(yīng)具備的特點(diǎn)，即一定的機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)越的物理形狀和無毒性。因此，通過生物發(fā)酵手段，將菌絲球作為載體，與游離的、對(duì)有機(jī)廢水具有特殊降解能力的光合細(xì)菌共同培養(yǎng)形成“混合菌絲球”，對(duì)于處理有機(jī)工業(yè)廢水具有潛在的應(yīng)用前景。然而與此有關(guān)的研究國(guó)內(nèi)外卻尚未有報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，該方法解決了光合細(xì)菌直接處理有機(jī)廢水時(shí)出水水質(zhì)差，并克服了光合細(xì)菌固定在海藻酸鈉、瓊脂、明膠等傳統(tǒng)載體中常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞的生物活性受到抑制、體系的物質(zhì)傳遞速率較低等現(xiàn)象。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，該方法包括如下具體步驟
(1)將葡萄糖0. I 20 克，蛋白胨 0. I 20 克，KH2P04 0. I 10 克，MgS04 7H20 0. 01 10克加入到1000毫升蒸餾水中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH和10%的HCl調(diào)節(jié)pH 5. (TlO. 0，攪拌均勻，即為富集培養(yǎng)基；
(2)配制100毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌115°C，30分鐘，取出錐形瓶冷卻至室溫，用接種環(huán)移取2環(huán)實(shí)驗(yàn)室冰箱保存的光合細(xì)菌至錐形瓶?jī)?nèi)，·用無菌玻璃球?qū)⒐夂霞?xì)菌打散、混勻，取出玻璃球，用黑布將錐形瓶周圍包好，將錐形瓶置于空氣浴振蕩器中進(jìn)行好氧黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后備用，即得光合細(xì)菌種子液；
(3)用無菌水沖洗長(zhǎng)有青霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面，并用接種環(huán)輕刮斜面，將沖洗后的含有青霉菌孢子的懸浮液用移液管移至錐形瓶中，添加無菌水使得每毫升懸浮液中含有青霉菌孢子約106個(gè)，然后輕輕搖晃錐形瓶，使其中的孢子呈均勻分散狀態(tài)，即得孢子懸液；
(4)配制5(Tl00毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌115°C，30分鐘，在冷卻后的錐形瓶中按I :1 5的比例同時(shí)接種體積分?jǐn)?shù)為f 25%的孢子懸液和體積分?jǐn)?shù)為廣25%的光合細(xì)菌種子液，然后將錐形瓶置于溫度15 40°C、轉(zhuǎn)速6(T200轉(zhuǎn)/分鐘的空氣浴振蕩器中培養(yǎng)2 7天，即獲得青霉菌與光合細(xì)菌形成的混合菌絲球。所述的一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，所述葡萄糖為蔗糖，可溶性淀粉，乙酸鈉，蛋白胨為酵母膏，馬鈴薯，NaN03。所述的一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，所述培養(yǎng)溫度控制在-1(T6(TC、空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速控制在100 20()轉(zhuǎn)/分鐘。由此達(dá)到通過青霉菌的自絮凝作用來固定光合細(xì)菌的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果是
本發(fā)明以青霉菌形成的菌絲球?yàn)樯镔|(zhì)載體，通過光合細(xì)菌與青霉菌的混合培養(yǎng)使光合細(xì)菌吸附在菌絲球表面及內(nèi)部孔隙中，獲得“混合菌絲球”，達(dá)到使光合細(xì)菌固定化的目的，克服了單獨(dú)投加光合細(xì)菌處理有機(jī)廢水所存在的一系列問題。研究表明，青霉菌在形成菌絲球的同時(shí)對(duì)光合細(xì)菌細(xì)胞顯示出良好的吸附作用，形成的“混合菌絲球”的傳質(zhì)性能高于海藻酸鹽、瓊脂等常規(guī)固定化材料，且具有良好的沉降性能和機(jī)械強(qiáng)度。此外，通過青霉菌的自絮凝作用來固定化光合細(xì)菌還具有操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)成本低、培養(yǎng)時(shí)間短、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)光合細(xì)菌的大規(guī)模有機(jī)廢水處理應(yīng)用具有重要意義。


圖I為“混合菌絲球”外觀顯微鏡照片圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明所提供的光合細(xì)菌是一株可降解2-氯苯酚的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris), 16SrDNA 序列為 GenBank Accession No. HM068966。該菌是已知現(xiàn)有菌種，各大菌種保藏庫(kù)中均有保存。本發(fā)明所提供的能形成菌絲球的微生物為一株命名為DH-I的青霉菌(Penicillium)。本發(fā)明采用HZQ-C型空氣浴震蕩器作為微生物培養(yǎng)設(shè)備。本發(fā)明的高壓蒸汽滅菌采用LD2X-40BI電熱壓力蒸汽滅菌器。本發(fā)明采用的無菌水為用電熱壓力蒸汽滅菌器處理的去離子水，處理?xiàng)l件為在溫度 121。。，壓力 0. 105Mpa 維持 20 30min。實(shí)施例I :
(I)培養(yǎng)基的配制
將葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2P04 I克，MgS04 7H20 0. 5克加入到1000毫升蒸餾水中，PH自然，攪拌均勻，即為富集培養(yǎng)基。(2)光合細(xì)菌的富集培養(yǎng)
配制100毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(115°C，30分鐘)。取出錐形瓶冷卻至室溫。用接種環(huán)移取2環(huán)實(shí)驗(yàn)室冰箱保存的光合細(xì)菌至錐形瓶?jī)?nèi)，用無菌玻璃棒將光合細(xì)菌打散、混勻。用黑布將錐形瓶周圍包好。將錐形瓶置于空氣浴振蕩器中進(jìn)行好氧黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后備用，即得光合細(xì)菌種子液。其中，培養(yǎng)溫度控制在30°C、空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速控制在130轉(zhuǎn)/分鐘。(3)制備孢子懸液
用無菌的蒸餾水沖洗長(zhǎng)有青霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面，并用接種環(huán)輕刮斜面。將沖洗后的含有青霉菌孢子的蒸餾水用移液管移至錐形瓶中，添加無菌水使得每毫升懸浮液中含有青霉菌孢子約106個(gè)，然后輕輕搖晃錐形瓶，使其中的孢子呈均勻分散狀態(tài)，即得孢子懸液。(4)同時(shí)接種
配制80毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(115°C，30分鐘)。在冷卻后的錐形瓶中按I :1的比例同時(shí)接種體積分?jǐn)?shù)為10%的孢子懸液和體積分?jǐn)?shù)為10%的光合細(xì)菌種子液。然后將錐形瓶置于溫度30°C、轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分鐘的空氣浴振蕩器中培養(yǎng)2天，即獲得此條件下青霉菌與光合細(xì)菌形成的“混合菌絲球”。對(duì)“混合菌絲球”采用“顏色浸潤(rùn)法”測(cè)其傳質(zhì)性能，結(jié)果表明菌絲球的傳質(zhì)性能好于海藻酸鈉固定化細(xì)胞PSB-ID形成的顆粒的傳質(zhì)性能?！盎旌暇z球”降解2-氯苯酚，降解率為62. 1%，好于海藻酸鈉固定化細(xì)胞PSB-ID降解2-氯苯酚的效果(55. 7%)。實(shí)施例2
(I)培養(yǎng)基的配制
將蔗糖5克，尿素2克，KH2P04 2克，MgS04 7H20 I克加入到1000毫升蒸餾水中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH和10%的HCl調(diào)節(jié)pH 8. 0，攪拌均勻，即為富集培養(yǎng)基。(2)光合細(xì)菌的富集培養(yǎng)、配制100毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(115°C，30分鐘)。取出錐形瓶冷卻至室溫。用接種環(huán)移取2環(huán)實(shí)驗(yàn)室冰箱保存的光合細(xì)菌至錐形瓶?jī)?nèi)，用無菌玻璃棒將光合細(xì)菌打散、混勻。用黑布將錐形瓶周圍包好。將錐形瓶置于空氣浴振蕩器中進(jìn)行好氧黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后備用，即得光合細(xì)菌種子液。其中，培養(yǎng)溫度控制在25°C、空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速控制在150轉(zhuǎn)/分鐘。(3)制備孢子懸液
用無菌的蒸餾水沖洗長(zhǎng)有青霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面，并用接種環(huán)輕刮斜面。將沖洗后的含有青霉菌孢子的蒸餾水用移液管移至錐形瓶中，添加無菌水使得每毫升懸浮液中含有青霉菌孢子約106個(gè)，然后 輕輕搖晃錐形瓶，使其中的孢子呈均勻分散狀態(tài)，即得孢子懸液。(4)同時(shí)接種
配制70毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(115°C，30分鐘)。在冷卻后的錐形瓶中按I :2的比例同時(shí)接種體積分?jǐn)?shù)為10%的孢子懸液和體積分?jǐn)?shù)為20%的光合細(xì)菌種子液。然后將錐形瓶置于溫度35°C、轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘的空氣浴振蕩器中培養(yǎng)4天，即獲得此條件下青霉菌與光合細(xì)菌形成的“混合菌絲球”。對(duì)“混合菌絲球”采用“顏色浸潤(rùn)法”測(cè)其傳質(zhì)性能，結(jié)果表明菌絲球的傳質(zhì)性能好于海藻酸鈉固定化細(xì)胞PSB-ID形成的顆粒的傳質(zhì)性能?！盎旌暇z球”降解2-氯苯酚，降解率為60. 3%，好于海藻酸鈉固定化細(xì)胞PSB-ID降解2-氯苯酚的效果(55. 7%)。實(shí)施例3
(I)培養(yǎng)基的配制
將可溶性淀粉15克，NaN033克，KH2P04 I克，MgS04 7H20 0. 5克加入到1000毫升蒸餾水中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH和10%的HCl調(diào)節(jié)pH 6. 0，攪拌均勻，即為富集培養(yǎng)基。(2)光合細(xì)菌的富集培養(yǎng)
配制100毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(115°C，30分鐘)。取出錐形瓶冷卻至室溫。用接種環(huán)移取2環(huán)實(shí)驗(yàn)室冰箱保存的光合細(xì)菌至錐形瓶?jī)?nèi)，用無菌玻璃棒將光合細(xì)菌打散、混勻。用黑布將錐形瓶周圍包好。將錐形瓶置于空氣浴振蕩器中進(jìn)行好氧黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后備用，即得光合細(xì)菌種子液。其中，培養(yǎng)溫度控制在35°C、空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速控制在110轉(zhuǎn)/分鐘。(3)制備孢子懸液
用無菌的蒸餾水沖洗長(zhǎng)有青霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面，并用接種環(huán)輕刮斜面。將沖洗后的含有青霉菌孢子的蒸餾水用移液管移至錐形瓶中，添加無菌水使得每毫升懸浮液中含有青霉菌孢子約106個(gè)，然后輕輕搖晃錐形瓶，使其中的孢子呈均勻分散狀態(tài)，即得孢子懸液。(4)同時(shí)接種
配制85毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(115°C，30分鐘)。在冷卻后的錐形瓶中按I :2的比例同時(shí)接種體積分?jǐn)?shù)為5%的孢子懸液和體積分?jǐn)?shù)為10%的光合細(xì)菌種子液。然后將錐形瓶置于溫度25°C、轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘的空氣浴振蕩器中培養(yǎng)3天，即獲得此條件下青霉菌與光合細(xì)菌形成的“混合菌絲球”。
對(duì)“混合菌絲球”采用“顏色浸潤(rùn)法”測(cè)其傳質(zhì)性能，結(jié)果表明菌絲球的傳質(zhì)性能好于海藻酸鈉固定化細(xì)胞PSB-ID形成的顆粒的傳質(zhì)性能。
“混合菌絲球”降解2-氯苯酚，降解率為61. 3%，好于海藻酸鈉固定化細(xì)胞PSB-ID降解2-氯苯酚的效果(55. 7%)。
權(quán)利要求
1.一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，其特征在于，該方法包括如下具體步驟(1)將葡萄糖0. I 20 克，蛋白胨 0. I 20 克，KH2P04 0. I 10 克，MgS04 7H20 0. 01 10克加入到1000毫升蒸餾水中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH和10%的HCl調(diào)節(jié)pH 5. (TlO. 0，攪拌均勻，即為富集培養(yǎng)基； (2)配制100毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌115°C，30分鐘，取出錐形瓶冷卻至室溫，用接種環(huán)移取2環(huán)實(shí)驗(yàn)室冰箱保存的光合細(xì)菌至錐形瓶?jī)?nèi)，用無菌玻璃球?qū)⒐夂霞?xì)菌打散、混勻，取出玻璃球，用黑布將錐形瓶周圍包好，將錐形瓶置于空氣浴振蕩器中進(jìn)行好氧黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后備用，即得光合細(xì)菌種子液； (3)用無菌水沖洗長(zhǎng)有青霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面，并用接種環(huán)輕刮斜面，將沖洗后的含有青霉菌孢子的懸浮液用移液管移至錐形瓶中，添加無菌水使得每毫升懸浮液中含有青霉菌孢子約106個(gè)，然后輕輕搖晃錐形瓶，使其中的孢子呈均勻分散狀態(tài)，即得孢子懸液； (4)配制5(Tl00毫升富集培養(yǎng)基，倒入250毫升的錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌115°C，30分鐘，在冷卻后的錐形瓶中按I :1 5的比例同時(shí)接種體積分?jǐn)?shù)為f 25%的孢子懸液和體積分?jǐn)?shù)為廣25%的光合細(xì)菌種子液，然后將錐形瓶置于溫度15 40°C、轉(zhuǎn)速6(T200轉(zhuǎn)/分鐘的空氣浴振蕩器中培養(yǎng)2 I天，即獲得青霉菌與光合細(xì)菌形成的混合菌絲球。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，其特征在于，所述葡萄糖為蔗糖，可溶性淀粉，乙酸鈉，蛋白胨為酵母膏，馬鈴薯，NaN03。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)溫度控制在-1(T6(TC、空氣浴振蕩器轉(zhuǎn)速控制在10(T2(K)轉(zhuǎn)/分鐘。
全文摘要
一種利用菌絲球作為生物載體固定化光合細(xì)菌的方法，涉及環(huán)境生物工程，該方法包括為配制富集培養(yǎng)基；得光合細(xì)菌種子液；得孢子懸液；1～5的比例同時(shí)接種體積分?jǐn)?shù)為1~25%的孢子懸液和體積分?jǐn)?shù)為1~25%的光合細(xì)菌種子液，然后將錐形瓶置于溫度15~40℃、轉(zhuǎn)速60~200轉(zhuǎn)/分鐘的空氣浴振蕩器中培養(yǎng)2~7天，即獲得青霉菌與光合細(xì)菌形成的混合菌絲球。由此達(dá)到通過青霉菌的自絮凝作用來固定光合細(xì)菌的目的。且具有良好的沉降性能和機(jī)械強(qiáng)度。此外，通過青霉菌的自絮凝作用來固定化光合細(xì)菌還具有操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)成本低、培養(yǎng)時(shí)間短、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)光合細(xì)菌的大規(guī)模有機(jī)廢水處理應(yīng)用具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N11/00GK102703413SQ20121018955
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者馮治宇, 張玉革, 林靜雯, 董怡華, 高丹 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)大學(xué)