專利名稱：抗凝血酶ⅲ(at-ⅲ)測定試劑盒(發(fā)色底物法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷領(lǐng)域，特別涉及一種發(fā)色底物法檢測抗凝血酶III的試劑盒。
背景技術(shù)：
抗凝血酶III (antithrombin ΙΙΙ,ΑΤ-ΙΙΙ)是一種依賴于肝素的絲氨酸蛋白酶抑制劑，是ー種重要的抗凝血因子，在血漿中承擔(dān)著609Γ70%的抗凝血酶活性，在維持血液生理性凝血與抗凝血平衡中起著重要的作用。AT-III由肝臟、血管內(nèi)皮細胞和巨核細胞合成，分子量約為60000Da，屬于α 2_球蛋白，其基因位于第I號染色體(1ρ23)。在血栓形成過程中，AT-III是ー個非常重要的調(diào)節(jié)劑，在肝素的催化下，通過與凝 血酶或凝血因子IXa、Xa、XIa、XIIa、纖溶酶等絲氨酸蛋白酶以1:1的比例形成復(fù)合物，從而使這些酶失去活性，發(fā)揮抗凝作用。正常人AT-III的血漿濃度為20 30mg/dl，活性為80% 130%，波動范圍相對狹窄，當(dāng)血液中AT-III水平低于正常范圍，則增加形成血栓的風(fēng)險，是發(fā)生靜脈血栓和肺栓塞的常見原因之一。血液中AT-III缺乏可由多種原因造成，如AT-III合成降低，主要見于肝硬化、重癥肝炎、肝癌晩期等；AT-III丟失增加，見于腎病綜合癥;AT-III消耗増加，見于血栓前期和血栓性疾病，如彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、心絞痛、心肌梗死等；先天性AT-III缺陷或異常。因此，AT-III在臨床診斷中是ー個非常重要的指標(biāo)。目前，測定AT-III的方法主要分為三類免疫學(xué)分析方法、凝固法和發(fā)色底物法。免疫學(xué)分析方法是通過單向放射免疫擴散法、免疫比濁法以及酶聯(lián)免疫吸附法測定樣本中AT-III的濃度。這種方法比較特異和靈敏，但是操作繁瑣、耗吋，由于該方法在測定AT-III過程中，非活性的AT-III也參與了免疫學(xué)反應(yīng)，檢測的AT-III濃度并不能完全反映AT-III活性水平，這對于由于AT-III活性降低而導(dǎo)致的AT-III缺乏II型的病人，檢出的高值結(jié)果明顯是不合適的。凝固法是通過血漿凝固時間直接或間接地測定樣本中AT-III活性，主要包括一步法和兩步法。一歩法是將檢測樣本與AT-III缺乏的血漿混合，通過加入相應(yīng)試劑激活外源性凝血途徑或內(nèi)源性凝血途徑，測定凝固時間，與參考標(biāo)準(zhǔn)進行對照，從而求得AT-III的活性，該方法有多種蛋白酶參與反應(yīng)，測定易受影響。兩步法是將血漿通過加熱進行脫纖維蛋白處理，再與過量的凝血酶孵育，殘余的凝血酶活性通過測定加入血漿或纖維蛋白原后的凝固時間而換算出樣本中AT-III的活性，該方法缺點在于操作比較繁瑣、費時，需要將血漿加熱變性進行脫纖維，從而會導(dǎo)致AT-III水平的降低。發(fā)色底物法是在待測血漿中加入過量的凝血酶，在肝素存在下，凝血酶與血漿中的AT-III形成I: I復(fù)合物，剰余的凝血酶作用于底物，裂解出顯色基團，顯色程度與剰余凝血酶的量呈正相關(guān)，而與血漿中AT-III活性呈負相關(guān)。由于該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢測時間短，且能夠適用于多種自動化分析儀器，目前，臨床上已廣泛應(yīng)用。但是該方法也存在一定的缺陷，該法是通過加入外源性凝血酶來分析樣本中AT-III活性，由于樣本中也存在另ー個肝素催化的凝血酶抑制劑一肝素輔助因子II(HCII)，因而測定剰余凝血酶的活性是凝血酶與AT-III和HCII反應(yīng)后剩余的活性，這在HCII水平正常的病人，AT-III的缺乏將有可能由于HCII的抗凝血酶活性而掩蓋。因此，該法易受樣本中HCII的干擾而導(dǎo)致AT-III的測定不準(zhǔn)確，尤其是在AT-III缺乏的樣本中。有研究顯示，在肝素存在下HCII對凝血酶的抑制作用取決于離子強度。美國專利US5646007通過提高鹽的濃度，使凝血酶的構(gòu)象發(fā)生變化，HCII對凝血酶測定的干擾降低，但凝血酶對發(fā)色底物的敏感度也隨之降低。Demers 等人(Thrombosis and Hemostasia,69 (3), pp. 231-235 (1993))報道米用FXa替代凝血酶，不會受到HCII的抑制，但是用FXa分析價格更加昂貴，而且FXa不太穩(wěn)定，分析時需要大量稀釋，不太適合自動分析儀
發(fā)明內(nèi)容
針對目前現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)色底物法檢測抗凝血酶III(AT-III)活性的試劑盒，該試劑盒抗干擾能力強、靈敏度高，具有廣泛的應(yīng)用前景。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了ー種抗凝血酶III活性檢測試劑盒，該試劑盒包括Rl試劑和R2試劑，所述Rl試劑包含肝素衍生物、凝血酶，所述R2試劑包含發(fā)色底物試劑；所述肝素衍生物是由肝素通過肝素酶II降解，從肝素上裂解出一個或多個不飽和雙糖而得。上述試劑盒中，所述肝素衍生物能夠增強AT-III的抗凝血酶活性，但并不增強HCII的抗凝血酶活性，從而可以消除HCII對AT-III活性測定的影響。所述肝素衍生物的制備方法包括以下步驟步驟I :將肝素溶于pH值為6. 0-8. O的磷酸鹽緩沖液，得肝素母液；步驟2 :將肝素酶II加入上述肝素母液中，所得混合物于25_40°C反應(yīng)20_40小時；步驟3 :將上述反應(yīng)后的混合物于80_100°C滅活肝素酶II。上述制備方法中，步驟I中所述肝素為人、?；蜇i肝素中的任意ー種，優(yōu)選豬肝素；所述肝素在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為1000 4000U/ml，優(yōu)選濃度為2000U/ml。步驟2中所述肝素酶II來源于肝素黃桿菌，可由商業(yè)化途徑獲得。步驟2所述肝素酶II與肝素母液中所述肝素的量之比為IIU 5000 10000U，優(yōu)選比例為Iiu :8000U。上述制備方法中，步驟2還包括用紫外分光光度計分別檢測所述反應(yīng)前、后，反應(yīng)混合物在232nm處的吸光度值，將所述反應(yīng)后的混合物吸光度較反應(yīng)前增強5%_20%認定為生成了所述肝素衍生物。優(yōu)選地，將所述反應(yīng)后的混合物吸光度較反應(yīng)前增強15%認定為生成了所述肝素衍生物。上述制備方法中，步驟3所得包含肝素衍生物的反應(yīng)混合物，可以直接配制Rl試齊U，也可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分離方法從所述混合物中分離出肝素衍生物作為Rl試劑配制的原料，例如，使用根據(jù)粒子大小分離的葡聚糖凝膠色譜柱純化獲得肝素衍生物。上述試劑盒中，所述凝血酶選自人、牛、豬凝血酶中的任意ー種,優(yōu)選牛凝血酶。作為優(yōu)選，上述試劑盒中所述Rl試劑、R2試劑為冷凍干燥試劑。
所述Rl冷凍干燥劑由包含肝素衍生物、凝血酶以及緩沖劑、表面活性剤、穩(wěn)定劑、防腐劑的試劑經(jīng)冷凍干燥制成。所述R2冷凍干燥劑由包含發(fā)色底物、賦形劑和防腐劑的試劑經(jīng)冷凍干燥制成；所述R2試劑中的賦形劑選自甘露醇、葡萄糖、乳糖、B SA中的任意ー種，防腐劑選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的防腐劑，如疊氮鈉。作為優(yōu)選，上述試劑盒還包括Rl復(fù)溶試劑，所述Rl復(fù)溶試劑包含無機鹽和緩沖液，用于Rl冷凍干燥劑的復(fù)溶重建。上述Rl復(fù)溶試劑中，所述無機鹽為氯化鈉或氯化鉀，優(yōu)選氯化鉀。工作濃度的定義在用上述試劑盒檢測樣本AT-III活性的過程中，所述Rl冷凍干燥劑用Rl復(fù)溶試劑復(fù)溶后，與稀釋樣本混合，所形成的分析混合物中各組分的濃度被定義為其工作濃度。 上述試劑盒中，所述肝素衍生物的工作濃度為O. 25-3. OU/ml，優(yōu)選工作濃度為
I.6U/ml。所述凝血酶的工作濃度為5_20IU/ml，優(yōu)選工作濃度為10. 9IU/ml。所述氯化鈉或氯化鉀的工作濃度為O. 1M-0. 3M。此濃度范圍的氯化鹽不會引起凝血酶不利的構(gòu)象變化，Rl試劑中的肝素衍生物能夠增強AT-III的抗凝血酶活性，且HCII對AT-III活性測定的影響率不超過5%。在發(fā)色底物法檢測AT-III活性的過程中，作為凝血酶底物，要求具有較高的敏感性和較好的水溶性，才能有效提高檢測的靈敏度，且具有較寬的線性范圍，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果底物的溶解度過低，試劑接近飽和狀態(tài)，檢測過程中易產(chǎn)生沉淀而導(dǎo)致測定結(jié)果的不準(zhǔn)確。本發(fā)明試劑盒中，所述R2試劑中的發(fā)色底物為Bz-Phe-Val-Arg-pNA (S-2160)、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA · 2HC1 (S-2238)、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (Chromozym TH)、H-D-Phe-Pro-Arg-pNA 中的任意一種；優(yōu)選發(fā)色底物為H-D-Phe-Pip-Arg-pNA · 2HC1，其工作濃度為O. 2-1. 7 μ mol/ml，優(yōu)選工作濃度為0.42 μmol/ml。作為優(yōu)選，上述試劑盒還包括AT-III的校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品由正常健康人血漿添加穩(wěn)定劑和防腐剤，經(jīng)冷凍干燥制成。正常健康人血漿可以從商業(yè)途徑獲得，也可以從健康個體獲得，將收集的正常健康人血漿混合后進行AT-III活性檢測，檢測值應(yīng)在80%-120%。血漿中加入適當(dāng)?shù)母拾彼?、疊氮鈉，混合后通過過濾除去不溶顆粒，調(diào)節(jié)PH值至6. 0-9. 0，優(yōu)選7. 5，分裝后凍干，并用WHO抗凝血酶國際標(biāo)準(zhǔn)品血漿對AT- III校準(zhǔn)品進行定值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有如下特點( I)特異性強，不受血漿樣本中HCII的干擾。(2)靈敏度高，最低檢測限在5%以下。(3)檢測線性范圍寬，最高檢測限能達到150%。(4)適用面廣，儀器兼容性強，可適用于多種血凝分析儀。


圖I為本發(fā)明試劑盒的校準(zhǔn)曲線；
圖2為本發(fā)明試劑盒的線性范圍相關(guān)性分析；圖3為本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有市售試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性分析。
具體實施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進ー步的詳細說明。實施例I肝素衍生物的制備步驟I :將肝素(購自sigma公司，貨號H3393，活性190USP/mg)溶于50mM、pH值7. O磷酸鹽緩沖液中，配成濃度為2000U/ml的肝素母液。
步驟2 :肝素酶11(購自北京艾德豪克國際技術(shù)有限公司，貨號HS6512，9.8IU/mg)用蒸餾水復(fù)溶至濃度為20IU/ml。將肝素酶II溶液加到步驟I所得肝素母液中，肝素酶II與肝素在該混合物中的濃度比例為IIU :8000U。混合液在30°C密閉條件下孵育30小時后，在232nm測定吸光度，用磷酸鹽緩沖液作為空白對照，相對于原始值提高15%，表明酶消化反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生，不飽和ニ糖已從肝素上裂解形成肝素衍生物。步驟3 :將步驟2所得反應(yīng)液浸入沸水浴中5分鐘，滅活肝素酶II。經(jīng)檢測，肝素衍生物的活性濃度為885U/ml。實施例2檢測試劑盒的組成及制備方法Rl試劑主要由以下原料配制而成牛凝血酶濃度為60IU/ml，肝素衍生物(實施例
I所制)為 9. OU/ml，Tris 為 10mM、吐溫-80 為 O. 2mg/ml、明膠為 O. 05mg/ml、BSA 為 I. 2mg/ml、聚こニ醇-8000為5mg/ml及疊氮鈉為O. 5mg/ml,以Iml/瓶分裝凍干。Rl試劑復(fù)溶試劑由以下原料配制而成Tris濃度為40mM，KCl為O. 2M，EDTA_K2為3. 75mM, NaN3 為 O. 5mg/ml，在 25°C 以 lmol/LHCl 調(diào)節(jié) pH 值至 8. 40。R2試劑由以下試劑配制而成發(fā)色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA · 2HC1 為 3. 6 μ mol/ml,甘露醇為 30mg/ml,疊氣納為 3mg/ml,以lml/瓶分裝凍干。AT-III校準(zhǔn)品為將收集的健康正常人血漿混合后加入甘氨酸、疊氮鈉溶解，并調(diào)節(jié)pH值為7. 5,甘氨酸濃度為IOmM,疊氮鈉為lmg/ml,以Iml/瓶分裝凍干。用WHO抗凝血酶國際標(biāo)準(zhǔn)品血漿06/166對AT- III校準(zhǔn)品進行定值，定值為94%。實施例3檢測試劑盒的測定方法(I)將實施例2所得Rl試劑、R2試劑以及AT-III標(biāo)準(zhǔn)品進行復(fù)溶重建每瓶Rl試劑用3ml Rl復(fù)溶試劑復(fù)溶，每瓶R2試劑用3ml蒸餾水復(fù)溶，每瓶AT-III校準(zhǔn)品用Iml蒸餾水復(fù)溶。(2)以日本東亞CA530血凝儀操作為例，根據(jù)儀器說明，設(shè)定分析程序測定波長為 405nm ；取5μ I血漿樣本，加入生理鹽水120μ I稀釋，稀釋比例為1:25，在37°C孵育30秒，取50 μ I稀釋后樣本，加入60 μ I Rl試劑在37°C孵育90秒，再加入60 μ I R2試劑在37°C孵育，測定第10秒和第40秒的吸光度差值(Λ 0D)。儀器自動將校準(zhǔn)品稀釋成144%、96%、48%、24%、0%5個標(biāo)準(zhǔn)點，每管重復(fù)測定2次，以Λ OD的均值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的活性為橫坐標(biāo)，制作“活性-吸光度差值”校準(zhǔn)曲線y=-0. 0081X+1. 4413，相關(guān)系數(shù)r=0. 9993，見圖
Io取待測樣本，同上方法測定樣本的吸光度差值，代入校準(zhǔn)曲線，即可以計算出待測樣本中AT-III的活性。本試劑盒不僅適用于日本東亞CA530血凝儀，而且還適用于其它品牌、型號的凝血分析儀，如法國思達高STA Compact血凝儀、美國貝克曼庫爾特ACL elite血凝儀、德國BE Compact X血凝儀等，具體參數(shù)可根據(jù)儀器不同進行適當(dāng)調(diào)整。實施例4本發(fā)明試劑盒的分析性能評估(I)線性范圍
將接近線性范圍上限的高活性樣本(AT-III活性147%)用生理鹽水分別按2/3、1/3、1/6、1/12的比例稀釋，并以生理鹽水為空白樣本，加上稀釋前原樣本，共得到6份不同活性的樣本，使用實施例2所得本發(fā)明試劑盒、實施例3所述檢測方法檢測各樣本，每份樣本重復(fù)測定2次，將測定濃度的平均值與理論濃度進行線性回歸分析，計算回歸方程Y=O. 9944X+0. 4903，相關(guān)系數(shù)r=0. 9991，見圖2，表明本發(fā)明試劑盒在0% 150%線性范圍內(nèi)相關(guān)性較好。(2)靈敏度以5%人血清白蛋白為空白樣本，使用實施例2所得本發(fā)明試劑盒、實施例3所述檢測方法，重復(fù)測定20次，計算空白樣本Λ OD均值(X )和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以空白均值減兩倍標(biāo)準(zhǔn)差代入校準(zhǔn)曲線方程，計算最低檢測限，其結(jié)果如表I所示。表I最低檢測極限分析
權(quán)利要求
1.ー種抗凝血酶III活性檢測試劑盒，包括Rl試劑和R2試劑，所述Rl試劑包含肝素衍生物、凝血酶，所述R2試劑包含發(fā)色底物試劑；所述肝素衍生物是由肝素通過肝素酶II降解，從肝素上裂解出一個或多個不飽和雙糖而得。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述肝素衍生物的制備方法包括以下步驟 步驟I :將肝素溶于PH值為6. 0-8. O的磷酸鹽緩沖液，得肝素母液； 步驟2 :將肝素酶II加入上述肝素母液中，所得混合物于25-40°C反應(yīng)20-40小時； 步驟3 :將上述反應(yīng)后的混合物于80-100°C滅活肝素酶II。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟I中所述肝素為人、?；蜇i肝素中的任意ー種。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟I中所述肝素在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為1000 4000U/ml。
5.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟I中所述肝素在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為2000U/ml。
6.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟2所述肝素酶II與肝素母液中所述肝素的量之比為IIU 5000 lOOOOUo
7.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟2所述肝素酶II與肝素母液中所述肝素的量之比為IIU :8000U。
8.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在干，步驟2還包括用紫外分光光度計分別檢測所述反應(yīng)前、后，反應(yīng)混合物在232nm處的吸光度值，將所述反應(yīng)后的混合物吸光度較反應(yīng)前增強5%-20%認定為生成了所述肝素衍生物。
9.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在干，步驟3還包括將所述肝素衍生物從反應(yīng)混合物中分離純化的步驟。
10.如權(quán)利要求1-9任ー項所述的試劑盒，其特征在于，所述Rl試劑、R2試劑為冷凍干燥試劑。
11.如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括Rl復(fù)溶試劑，所述Rl復(fù)溶試劑包含無機鹽和緩沖液。
12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述無機鹽為氯化鈉或氯化鉀。
13.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述肝素衍生物的工作濃度為O.25-3. OU/ml。
14.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述肝素衍生物的工作濃度為I.6U/ml ο
15.如權(quán)利要求11-14所述的試劑盒，其特征在于，所述凝血酶的工作濃度為5-20IU/ml ο
16.如權(quán)利要求11-14所述的試劑盒，其特征在于，所述凝血酶的工作濃度為10.9IU/ml ο
17.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在干，所述氯化鈉或氯化鉀的工作濃度為O.1M-0. 3M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)色底物法檢測血漿中抗凝血酶III(AT-III)活性的試劑盒。本發(fā)明試劑盒包含肝素衍生物、凝血酶和發(fā)色底物試劑；所述肝素衍生物由肝素通過肝素酶II降解，從肝素上裂解出一個或多個不飽和雙糖而得。本發(fā)明檢測試劑盒能夠避開血漿樣本中肝素輔助因子II(HC-II)的干擾，具有抗干擾能力強、靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單、快速、儀器兼容性強等優(yōu)點，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/56GK102690862SQ20121018957
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者謝永華 申請人:上海太陽生物技術(shù)有限公司