專利名稱：大腸埃希氏菌及由其高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用基因工程的方法構(gòu)建表達(dá)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)，更具體地說(shuō)是涉及一種大腸埃希氏菌及由其高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法。
背景技術(shù)：
人表皮生長(zhǎng)因子(Human epidermal growth factor,簡(jiǎn)稱hEGF)又名尿抑胃素，hEGF見于人正常生理狀態(tài)下的幾乎所有體液中，如尿、乳液、血液、唾液、淚液、胃液、骨髓液等中都含有EGF，一般認(rèn)為腎內(nèi)尿液、乳液中含量較多(Orsinib B, et al. ClinBiochem, 1991，24:135-137)。Cohen S (Cohen S，et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA,1975, 72:1317-1321)和 Gregorg H (Gregorg H, et al. Nature, 1975, 257:325-327)于1975年都在尿液中分離得到hEGF，其一級(jí)結(jié)構(gòu)也于同年闡明，hEGF成熟肽由53個(gè)氨基酸組成，分子量為6. 2 KD，等電點(diǎn)約為pH 4.6-4. 7，分子內(nèi)有三對(duì)二硫鍵，以維持其蛋白構(gòu)型和生物活性。hEGF是一種重要的生長(zhǎng)因子，也是最早發(fā)現(xiàn)并用于臨床的生長(zhǎng)因子之一，臨床試驗(yàn)表明hEGF可促使外胚層細(xì) 胞和毛細(xì)血管生長(zhǎng)，促進(jìn)燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合，加速移植表皮和移植角膜的生長(zhǎng)，因此對(duì)創(chuàng)傷性皮膚、角膜移植和外傷性皮膚潰瘍等治療有重要作用(Huang BR, Basic Clin Med, 1991, 11:87-91) 另外hEGF還廣泛應(yīng)用于高端化妝品(王麗明，山東科學(xué)，2006，4: 71-73)。現(xiàn)在報(bào)道的hEGF有三種生產(chǎn)的方法化學(xué)合成的方法，1988年March D (MarchD, et al. American Pepetide Symposium , 1988, 10:202-203)首先完成了 hEGF 的全合成，但由于hEGF分子內(nèi)的二硫鍵及很多活性位點(diǎn)的存在，致使合成產(chǎn)物的純度、產(chǎn)率及活性都無(wú)法滿足工業(yè)化的生產(chǎn)要求；再有從生物來(lái)源中提取(美國(guó)專利19840619708)，主要從尿液中分離提取，但天然來(lái)源原料hEGF濃度很低，致使分離提純效率低成本高，很難規(guī)?；a(chǎn)；基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)hEGF是現(xiàn)在規(guī)?；a(chǎn)的主要方法。已經(jīng)報(bào)道很多發(fā)酵生產(chǎn)hEGF的技術(shù)和方法，包括使用大腸桿菌、芽孢桿菌(Wang GL, et al. Yi Chuan Xue Bao, 2003，30 (2) : 267-271 )、酵母(Clements JM, et al.Gene, 1991，106(2) : 267-271 )、藻類細(xì)胞(戴激，等，植物學(xué)報(bào)，2001，43 (12) : 1260-1261 )、動(dòng)物細(xì)胞(Mroczkowshi B. Methods Enzymol, 1991, 198:175-177)植物組織細(xì)胞(W0patent:W09821348)等作為宿主發(fā)酵表達(dá)rhEGF?，F(xiàn)在生產(chǎn)中主要還是利用原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)，大腸桿菌以其生長(zhǎng)速度快，遺傳背景清晰，易于改造，工藝簡(jiǎn)單，已經(jīng)有大規(guī)模的發(fā)酵醫(yī)用蛋白的經(jīng)驗(yàn)，使之成為外源表達(dá)rhEGF的首選宿主菌。非組成型表達(dá)方式的大腸桿菌在生長(zhǎng)表達(dá)過(guò)程中一般分兩個(gè)階段，菌體的生長(zhǎng)階段和誘導(dǎo)表達(dá)階段，誘導(dǎo)階段的誘導(dǎo)表達(dá)方式有多種，有些誘導(dǎo)啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)需要添加相應(yīng)誘導(dǎo)劑如乳糖、IPTG、阿拉伯糖等，加入誘導(dǎo)劑后往往會(huì)造成菌體生理狀態(tài)變化、裂解或者誘導(dǎo)過(guò)快造成表達(dá)量劇增對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害，而且有些誘導(dǎo)劑(如IPTG)本身具有毒性，在很多國(guó)家醫(yī)藥生產(chǎn)中禁止使用；有的誘導(dǎo)方式不需要添加誘導(dǎo)劑而使用營(yíng)養(yǎng)限制型的啟動(dòng)子，如堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子，色氨酸啟動(dòng)子等，但這類啟動(dòng)子都對(duì)培養(yǎng)基要求比較苛刻，而且誘導(dǎo)物質(zhì)本身也是營(yíng)養(yǎng)成分致使發(fā)酵不易控制，增加了發(fā)酵成本。大腸桿菌同樣具有細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分泌(分泌至周質(zhì))表達(dá)方式，分泌表達(dá)方式所表達(dá)的多肽結(jié)構(gòu)均一'I"生強(qiáng)、活性高、利于純化、且成本低，因此成為現(xiàn)在生產(chǎn)rhEGF的主要表達(dá)方式。但利用大腸桿菌分泌表達(dá)也有相對(duì)胞內(nèi)表達(dá)的缺點(diǎn)，如表達(dá)量較低。Grossman TH 報(bào)道了(Grossman TH, et al. GENE, USA, 1998, 209:95-103)在復(fù)合培養(yǎng)基中用乳糖啟動(dòng)子控制的大腸桿菌PET表達(dá)系統(tǒng)可以在沒有專門誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)情況下表達(dá)，cAMP在啟動(dòng)表達(dá)中起到關(guān)鍵作用，而且以此種方式表達(dá)的宿主菌質(zhì)粒保存率優(yōu)于誘導(dǎo)表達(dá)的方式；魏東芝等人(Fu XY, et al. Chem Technol Biotechnol, 2006, 81:1866- 1871)研究了大腸桿菌pET表達(dá)系統(tǒng)在不需要專門誘導(dǎo)時(shí)酵母抽提物對(duì)其表達(dá)Trx - hPTH的影響，發(fā)現(xiàn)在復(fù)雜培養(yǎng)基中不同來(lái)源和不同濃度的酵母抽提物對(duì)大腸桿菌表達(dá)影響很大，高濃度的酵母抽提物有利于表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上原因發(fā)明人設(shè)計(jì)并得到了一個(gè)大腸桿菌高效分泌表達(dá)hEGF的方法。本發(fā)明公開了一種大腸桿菌不需要專門誘導(dǎo)高效分泌表達(dá)重組人表皮生長(zhǎng)因子(rhEGF)的方法。大腸埃希氏菌(E. coli)通常稱為大腸桿菌。具體說(shuō)來(lái)，發(fā)明人提供如下的技術(shù)方案
一種大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BTE-9,于2012年4月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為=CGMCC NO. 6014。

上述的大腸埃希氏菌BTE-9，其特征包括質(zhì)粒pTEGF9，此質(zhì)粒帶有T71ac啟動(dòng)子序列、堿性磷酸酯酶信號(hào)肽基因、大腸桿菌偏好性密碼子的hEGF基因、卡那霉素抗性基因，宿主菌為萬(wàn).BL21 (DE3)[基因型:F-, ompT, hsdS (rBB-mB-)，gal, dcm(DE3)]。本發(fā)明還提供了上述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，包括
(O大腸埃希氏菌BTE-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選，
(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)大腸埃希氏菌BTE-9表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子，
(3)產(chǎn)物純化。作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其中，所述的步驟(I)大腸埃希氏菌BTE-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選為
(1. O構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PTEGF9，
(1. 2)將質(zhì)粒pTEGF9用CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入β. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)，電泳分析發(fā)酵液中hEGF含量，篩選出高表達(dá)的菌株命名為B. coli BL21 (DE3)/pTEGF9，即大腸埃希氏菌 BTE-9。作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其中，所述的步驟(2)中搖瓶培養(yǎng)基以100 mL計(jì)含如下成分多聚蛋白胨Ig、酵母抽提物0.8 g、葡萄糖0.8 g、磷酸二氫鉀0.08 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸銨0.2g、無(wú)水硫酸鎂0.05 g、甘氨酸0. lg、飽和酚紅200 μ I。
本發(fā)明還提供了另外一種上述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，包括
(O大腸埃希氏菌BTE-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選，
(2)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)大腸埃希氏菌BTE-9表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子，
(3)產(chǎn)物純化。第二種方案中，作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其中，所述的步驟(I)大腸埃希氏菌BTE-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選為
(1. O構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PTEGF9，
(1.2)將質(zhì)粒pTEGF9用CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入萬(wàn).co7i BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)，電泳分析發(fā)酵液中hEGF含量，篩選出高表達(dá)的菌株命名為B. coli BL21 (DE3)/pTEGF9，即大腸埃希氏菌 BTE-9。第二種方案中，作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其中，所述的步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(w/v):多聚蛋白胨2%、酵母抽提物1. 6%、葡萄糖1%、硫酸銨O. 5%、無(wú)水磷酸氫二鉀O. 41%、無(wú)水磷酸二氫鉀
O.16%、氯化鈉O. 12%、無(wú)水硫酸鎂O. 19%、甘氨酸O. 2%。第二種方案中，作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法， 其中，所述的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為
種子制備取凍存管里菌以1/500 (v/v)比例接種于有含有30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)中，220 rpm，37°C，培養(yǎng)至菌體濃度0D600為2.0，
發(fā)酵控制種子1% (v/v)接種入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基含30 μ g/ml的卡那霉素,維持pH為6. 5-7. O,當(dāng)溶氧下降后又上升時(shí)(約8個(gè)小時(shí))開始流加25%葡萄糖溶液，流加速度以恒定溶氧確定，溶氧維持在20-30%，同時(shí)恒流速加入O. 2%甘氨酸(甘氨酸質(zhì)量\發(fā)酵液體積)直至發(fā)酵16-17個(gè)小時(shí)結(jié)束。本發(fā)明大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法包括擴(kuò)增磷酸酯酶信號(hào)肽和hEGF基因串聯(lián)的DNA片段，克隆入質(zhì)粒pET30a，得到表達(dá)質(zhì)粒pTEGF9，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選得到高產(chǎn)菌株萬(wàn).co7i BL21 (DE3)/pTEGF9 (即大腸埃希氏菌BTE-9)，優(yōu)化搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法，并進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明的特點(diǎn)是，首先，在發(fā)酵表達(dá)過(guò)程中不使用誘導(dǎo)劑，避免了使用誘導(dǎo)劑(如IPTG)帶來(lái)的菌體生理狀態(tài)改變和質(zhì)粒丟失，而且降低了生產(chǎn)成本，避免了有毒類誘導(dǎo)劑對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的污染，其次，表達(dá)量高，使用優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法使搖瓶中分泌表達(dá)rhEGF可達(dá)140 mg/L,發(fā)酵罐中達(dá)到190 mg/L,所表達(dá)的rhEGF與天然hEGF有相同的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物活性。本發(fā)明中的菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中不經(jīng)過(guò)專門誘導(dǎo)就可以高效分泌表達(dá)rhEGF，簡(jiǎn)化了發(fā)酵操作，提高了分泌表達(dá)效率，此種表達(dá)方式還可用來(lái)表達(dá)其它活性多肽。


圖1是本發(fā)明表達(dá)載體pTEGF9結(jié)構(gòu)圖，圖2是本發(fā)明搖瓶發(fā)酵液HPLC分析結(jié)果，
圖3是本發(fā)明已純化rhEGF的HPLC分析結(jié)果，
圖4是本發(fā)明已純化rhEGF的SDS-PAGE分析結(jié)果，
其中I為標(biāo)準(zhǔn)品hEGF加入DTT ；2為純化的rhEGF加入DTT ；
3為標(biāo)準(zhǔn)品hEGF ；4為純化的rhEGF ；5為Marker，
圖5是本發(fā)明rhEGF N端分析圖譜，
圖6是本發(fā)明搖瓶培養(yǎng)E. coli BL21 (DE3)/pTEGF9中rhEGF的表達(dá)量和生物量變
化，
圖7是本發(fā)明發(fā)酵罐發(fā)酵E. coli BL21 (DE3)/pTEGF9中生物量，rhEGF表達(dá)量，殘?zhí)呛侩S時(shí)間的變化，
圖8是本發(fā)明已純化rhEGF的細(xì)胞生物活性測(cè)定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。主要原料、試劑和設(shè)備說(shuō)明質(zhì)粒pET30a，萬(wàn).co7i BL21(DE3)均購(gòu)自N0VAGEN公司，質(zhì)粒pE-5為上海普洛康裕藥物研究院生物一室保存，高效液相色譜儀購(gòu)自安捷倫公司。本發(fā)明的大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BTE-9，2011年6月從上海市浦東新區(qū)南匯工業(yè)園園中路1399號(hào)上海普洛康裕藥物研究院有限公司實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)獲得，于2012年4月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)微生物研究所，保藏號(hào)為=CGMCC NO. 6014。實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒pTEGF9的構(gòu)建及鑒定
常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)操作方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社第三版)。以EGF-1(5，-AAACATATGAAACAAAGCACTATTGCACTG-3’，下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn))和 EGF-2 (5’ -AAAGGATCCTTATTAACGCAGTTCCCACC-3’ )為引物，質(zhì)粒pE_5為模板擴(kuò)增帶有磷酸酯酶信號(hào)肽的hEGF基因片段，所擴(kuò)增基因片段利用BamHI和NdeI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后與BamHI和NdeI雙酶切的質(zhì)粒pET30a相連接，并電擊轉(zhuǎn)化入疋co7i T0P10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有30 μ g/ml卡那霉素的LB 平板上，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取菌落以EGF-2和EGF-3(5’ -TACCATCGACACCACCACGC-3’)為引物進(jìn)行菌落PCR，用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序，正確質(zhì)粒命名為PTEGF9 (圖1)。實(shí)施例2表達(dá)菌株的構(gòu)建、高表達(dá)菌株的篩選及質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)
2.1表達(dá)菌株的構(gòu)建、高表達(dá)菌株的篩選
將質(zhì)粒PTEGF9用CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入萬(wàn).coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞并涂布含有30μ g/ml卡那霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆100個(gè)分別接種到10 mL含有30μ g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm，培養(yǎng)36小時(shí)，取培養(yǎng)液O. 5 mL，離心取上清，放入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮，濃縮定容至50 μ I。使用Tricine-SDS-PAGE方法進(jìn)行電泳(此膠共三層，從上到下依次為5%的積層膠，10%的夾層膠和15%的分離膠)電泳結(jié)束后用高靈敏考馬斯亮藍(lán)染色方法染色并脫色，掃描拍照并用QuantityOne進(jìn)行灰度分析，篩選出高表達(dá)的菌株命名為萬(wàn).coli BL21(DE3)/pTEGF9,即大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BTE-9，于2012年4月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱 CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC NO. 6014。2. 2質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性檢測(cè)
將高產(chǎn)菌種疋co7i BL21 (DE3)/pTEGF9以1/1000 (v/v)比例接種于含有30 μ g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm，培養(yǎng)過(guò)夜，重復(fù)上述操作10次，每次得到的菌液稀釋IO5倍涂布于沒有抗性的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，分別挑取100個(gè)平板上的菌落，劃線到含有30 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，并計(jì)數(shù)每塊平板上長(zhǎng)出的菌落
權(quán)利要求
1.一種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BTE_9,于2012年4月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為=CGMCC NO. 6014。
2.如權(quán)利要求1所述的大腸埃希氏菌BTE-9，其特征在于包括質(zhì)粒pTEGF9帶有T71ac啟動(dòng)子序列、堿性磷酸酯酶信號(hào)肽基因、大腸桿菌偏好性密碼子的hEGF基因、卡那霉素抗性基因，宿主菌為萬(wàn).BL21 (DE3)[基因型:F-, ompT, hsdS (rBB-mB-), gal, dcm(DE3)]
3.一種由權(quán)利要求1所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述的方法包括 (O大腸埃希氏菌BTE-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選， (2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)大腸埃希氏菌BTE-9表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子， (3)產(chǎn)物純化。
4.如權(quán)利要求2所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述的步驟(I)大腸埃希氏菌BTE-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選為 (1. O構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PTEGF9， (1.2)將質(zhì)粒pTEGF9用CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)，電泳分離培養(yǎng)液，篩選出高表達(dá)的菌株命名為E. coli BL21(DE3) /pTEGF9,即大腸埃希氏菌BTE-9。
5.如權(quán)利要求2所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中搖瓶培養(yǎng)基以100 mL計(jì)含如下成分多聚蛋白胨I g、酵母抽提物0.8 g、葡萄糖0.8 g、磷酸二氫鉀0.08 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸銨0.2 g、無(wú)水硫酸鎂O. 05 g、甘氨酸O. lg、飽和酚紅200 μ I。
6.一種由權(quán)利要求1所述的大腸埃希氏菌ΒΤΕ-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述的方法包括 (O大腸埃希氏菌ΒΤΕ-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選， (2)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)大腸埃希氏菌ΒΤΕ-9表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子， (3)產(chǎn)物純化。
7.如權(quán)利要求6所述的大腸埃希氏菌ΒΤΕ-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述的步驟(I)大腸埃希氏菌ΒΤΕ-9菌株的構(gòu)建及高表達(dá)菌株的篩選為 (1. O構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PTEGF9， (1.2)將質(zhì)粒pTEGF9用CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)，電泳分離培養(yǎng)液，篩選出高表達(dá)的菌株命名為E. coli BL21(DE3) /pTEGF9,即大腸埃希氏菌BTE-9。
8.如權(quán)利要求6所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(w/v):多聚蛋白胨2%、酵母抽提物1. 6%、葡萄糖1%、硫酸銨O. 5%、無(wú)水磷酸氫二鉀O. 41%、無(wú)水磷酸二氫鉀O. 16%、氯化鈉O. 12%、無(wú)水硫酸鎂O. 19%、甘氨酸O. 2%。
9.如權(quán)利要求6所述的大腸埃希氏菌BTE-9高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為 種子制備取凍存管里菌以1/500 (v/v)比例接種于有含有30μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)中，220 rpm，37°C，培養(yǎng)至菌體濃度0D600為2. 0，發(fā)酵控制種子1% (v/v)接種入發(fā)酵罐,發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基含30 μ g/ml的卡那霉素，維持PH為6. 5-7. 0，當(dāng)溶氧下降后又上升時(shí)開始流加25%葡萄糖溶液，流加速度以恒定溶氧確定，溶氧維持在20-30%，同時(shí)恒流速加入O. 2%甘氨酸直至發(fā)酵16-17個(gè)小時(shí)結(jié)束。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用基因工程的方法構(gòu)建表達(dá)菌株，公開了一種大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BTE-9，于2012年4月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.6014。還提供了該菌株高效分泌表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子的方法。本發(fā)明在發(fā)酵表達(dá)過(guò)程中不使用誘導(dǎo)劑，避免了使用誘導(dǎo)劑帶來(lái)的菌體生理狀態(tài)改變和質(zhì)粒丟失，而且降低了生產(chǎn)成本，避免了有毒類誘導(dǎo)劑對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的污染，且表達(dá)量高。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103060249SQ20121018960
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者楊圣勇, 朱冬發(fā), 李仁寶, 張輝, 王莉, 韓文琦, 董國(guó)秀, 呂岳寅 申請(qǐng)人:浙江普洛康裕制藥有限公司, 上海普洛康裕藥物研究院有限公司