專利名稱：葡萄球菌lz16株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種對水稻稻瘟病有拮抗作用的葡萄球菌LZ16株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
稻瘟病、白葉枯病和紋枯病被列為水稻三大主要病害。稻瘟病是由稻瘟霉(Magnaporthe grisea)引起的水稻真菌性病害,分布范圍十分廣泛,90年代以來,我國稻痕病的年發(fā)生面積均在5700萬畝以上，年損失稻谷達(dá)數(shù)億公斤。廣東稻瘟病年發(fā)生面積不少于50萬畝，而且出現(xiàn)逐年增加趨勢。稻瘟病的發(fā)生不但影響產(chǎn)量，而且影響米質(zhì)，因此對稻瘟菌的研究，受到水稻科研的普遍重視和水稻生產(chǎn)的廣泛關(guān)注，并取得了可喜的成績和巨大的進(jìn)步。由于稻瘟病菌生理小種多變、環(huán)境氣候復(fù)雜、水稻品種抗性喪失等諸多因素影 響，稻瘟病至今仍然嚴(yán)重威脅著水稻生產(chǎn)，亟待解決的問題還很多。當(dāng)前對水稻稻瘟病的防治主要為化學(xué)防治。長期使用化學(xué)農(nóng)藥，使污染物在農(nóng)田土壤中大量殘留，理化性質(zhì)惡化，肥力下降。嚴(yán)重的污染，直接影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，使生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，生物多樣性減少，農(nóng)田土壤生產(chǎn)力下降，對國家生態(tài)安全構(gòu)成威脅。同時，化學(xué)污染造成有害物質(zhì)在農(nóng)作物中積累，并通過食物鏈進(jìn)入人體，引發(fā)各種疾病危害人體健康。如何既能保證農(nóng)作物健康生長，又可以不對人畜、農(nóng)田和生態(tài)環(huán)境造成新的傷害，是當(dāng)前研究者普遍關(guān)注的問題。生物防治和化學(xué)農(nóng)藥相比，具有選擇性強(qiáng)、對人畜安全、對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。海洋微生物具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的巨大潛力，又具有生長周期短、代謝易于調(diào)控、菌種較易選育、可通過大規(guī)模發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化等特點(diǎn)，故開發(fā)海洋微生物天然產(chǎn)物來作為生物農(nóng)藥制劑，具有潛在的產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢。當(dāng)前生物農(nóng)藥的研制90%以上是殺蟲劑，殺菌劑主要針對小麥條銹病、水稻條紋葉枯病等，對防治稻瘟病的生物源農(nóng)藥創(chuàng)制至今未見報道。迫切需要研制有效針對稻瘟霉的生物農(nóng)藥，為稻瘟病的防治和農(nóng)田土壤可持續(xù)利用，改善農(nóng)村生產(chǎn)環(huán)境提供有力保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對水稻稻瘟病有拮抗作用的葡萄球菌LZ16及其應(yīng)用。本發(fā)明篩選出一株對水稻稻瘟病有拮抗作用的菌株，通過分子鑒定，確定其為葡萄球菌(Staphylococcus sp.)LZ16。該菌株的發(fā)酵液平板對峙實驗表明，24h后的培養(yǎng)液對稻瘟菌有很好的抑制作用。用24h發(fā)酵液的裂解上清對稻瘟菌的分生孢子萌發(fā)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對孢子萌發(fā)、芽管伸長及附著胞形成都有很好的抑制作用。24h發(fā)酵液裂解上清在pH4-7、7-45°C情況下較穩(wěn)定。對葡萄球菌LZ16 24h發(fā)酵液裂解上清防治水稻稻瘟病進(jìn)行了離體葉片實驗，確定其對葉瘟的防治有很好的效果。本發(fā)明提供的葡萄球菌菌株LZ16于2012年5月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為 CGMCC No. 6121,分類名為葡萄球菌(Staphylococcus sp.)。本發(fā)明提供了含有葡萄球菌LZ16株的菌劑。本發(fā)明提供了含有葡萄球菌LZ16株的生物制品。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)葡萄球菌LZ16株產(chǎn)生的具有抗菌活性的嘌呤核苷磷酸化酶(purinenucleoside phosphorylase, PNP),其氛基酸序列為DSEQ ID No. 3所示的氨基酸序列，或2)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 3)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將G23替換為A23，將L26替換為A26，將V45替換為A45，將G50替換為A50，將G57替換為A57，將G95替換為A95，將D105替換為A105，將G154替換為A154，將G177替換為A177，將M183替換為A183，將第A140位增加一個A或幾個AA，將第A192位增加一個A或幾個AA，不影響其活性。因此，本發(fā)明的嘌呤核苷磷酸化酶PNP還包括SEQ ID No. 3所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有與嘌呤核苷磷酸化酶同等活性的由嘌呤核苷磷酸化酶衍生得到的蛋白質(zhì)。編碼上述嘌呤核苷磷酸化酶PNP的基因，是如下a)或b):a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；或b)由SEQ ID No. 2所示核苷酸序列經(jīng)取代一個或幾個核苷酸，得到編碼嘌呤核苷磷酸化酶的核苷酸序列。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。本發(fā)明提供了上述的嘌呤核苷磷酸化酶PNP或PNP編碼基因在抑制植物病原菌上的應(yīng)用。所述的植物病原菌為稻痕菌(Magnaporthe grisea)。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用PCR方法擴(kuò)增編碼PNP基因的引物，其為引物I :5’ -CAGTCCATGGGCACAAAAGCAACACCTCATATTC-3，引物 2 :5，-CCGCTCGAGTTCAGCAATTTCTAATGCTATTTC-3，。本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，其為以含上述基因為目的基因的表達(dá)盒。 本發(fā)明還提供了含有上述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明提供葡萄球菌LZ16株或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有葡萄球菌LZ16株的菌劑或生物制品在抑制植物病原菌上的應(yīng)用。所述的植物病原菌為稻痕菌(Magnaporthe grisea)。 本發(fā)明提供葡萄球菌LZ16株或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有葡萄球菌LZ16株的菌劑或生物制品在促進(jìn)植物生長上的應(yīng)用。本發(fā)明提供了葡萄球菌LZ16株在制備生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了以葡萄球菌LZ16株為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。本發(fā)明提供的葡萄球菌LZ16株對水稻稻瘟病有明顯的抑制作用，將LZ16制成抗菌劑或生物農(nóng)藥可對水稻的稻瘟病防治產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣使用，有效提高水稻的生產(chǎn)性能。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)嘌呤核苷磷酸化酶PNP在抑制植物病原菌上具有優(yōu)異的效果。


圖I為菌株LZ16在PDA培養(yǎng)基上對稻瘟病菌的對峙試驗結(jié)果。圖2為粗提物不同處理條件下平板對峙比較，其中NC、陰性對照；A、12h未裂解上清；B、12h裂解上清；C、12h裂解沉淀；D、12h未裂解上清加熱；E、12h裂解上清加熱；F、12h裂解沉淀加熱；G、24h未裂解上清；H、24h裂解上清；I、24h裂解沉淀；J、24h未裂解上清加熱；K、24h裂解上清加熱；L、24h裂解沉淀加熱。圖3為粗提物對稻瘟菌分生孢子萌發(fā)的抑制。圖4為水稻離體葉片實驗。圖5為菌株LZ16拮抗菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性實驗，其中，NC陰性對照；PC陽性對照；圖中a_d表不差異顯著p < 0. 05。圖6為菌株LZ16拮抗菌活性物質(zhì)的pH穩(wěn)定性實驗，其中，NC陰性對照；PC陽性對照；圖中a_f表不差異顯著p < 0. 05。圖7為菌株LZ1616s rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖8為菌株LZ16中的PNP蛋白的MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜分析圖。圖9為PNP表達(dá)后抑菌實驗，其中，NC陰性對照；PC陽性對照；圖中a、b表示差異顯著 p < 0. 05。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I葡萄球菌LZ16株菌株的培養(yǎng)和鑒定(I)海洋細(xì)菌的分離與培養(yǎng)樣品來源南澳海水、海泥混合物(取自廣東省汕頭市南澳縣深澳鎮(zhèn)吳平寨汕頭大學(xué)南澳臨海實驗站)。取樣品(海水、海泥混合物)(海水20ml，海泥5g)，放入已滅過菌 的三角瓶中，加入30ml滅菌人工海水(NaCl 23. 4g、MgS0412g、KCl I. 5g、CaCl22. 2g、蒸餾水1000ml)，激烈振蕩(200r/min)制成均勻的混懸液，靜置，過濾，取濾液，取0. Iml無菌人工海水梯度稀釋KT1-KT7梯度，分別吸取0. Iml的稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基(Zobell 2216E 胰蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、高磷酸鐵0. lg、瓊脂粉20g、人工海水1000ml、pH7. 6)平板上，37°C培養(yǎng)12h。待菌落長出后，挑取形態(tài)、色澤、大小不同的單菌落于篩選培養(yǎng)基(Zobell2216E)平板上劃線，37°C恒溫培養(yǎng)，菌落長出后4°C保存分離到的細(xì)菌(共得到289株海洋細(xì)菌)。(2)對水稻稻痕病有拮抗作用的腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)LZ16單菌落的獲得。
①病原真菌稻痕菌(Magnaporthe grisea)生理小種yc_25 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)，作為目標(biāo)致病真菌。②初篩首先，刮取少量稻瘟菌菌絲接種于PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯液體培養(yǎng)基，馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉16g，加蒸餾水定容至1L)中，28°C、150r/min搖床培養(yǎng)24h，獲得稻瘟菌液；將分離得到的海洋細(xì)菌接種于Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中，37°C、180r/min搖床培養(yǎng)12h，獲得細(xì)菌菌液。取稻瘟菌液(950iU)+細(xì)菌菌液(50iU)于IOml離心管中混合，280C、150r/min搖床培養(yǎng)60h，看是否有菌絲體產(chǎn)生。③復(fù)篩將初篩得到的具有拮抗作用的細(xì)菌，通過平板對峙進(jìn)行復(fù)篩。平板對峙法^PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯固體培養(yǎng)基)平板中心首先接種稻瘟菌菌絲塊(直徑5_用藍(lán)色槍頭倒著打孔)，放置于28°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，在平板的4個角點(diǎn)(距中心2. 5cm)接種拮抗菌 株(直徑約5_的濾紙片沾取拮抗細(xì)菌菌懸液)，于28°C恒溫箱中培養(yǎng)7d后觀察，并測量各拮抗菌株菌落邊緣與稻瘟病菌落邊緣之間的抑菌距離，篩選出拮抗作用明顯且生長較快的菌株。本發(fā)明對其中一株對稻瘟病拮抗作用很明顯的菌株命名為LZ16，其在PDA培養(yǎng)基上對稻瘟病菌的對峙試驗見圖I。(3)細(xì)菌總DNA的提取①取0. 5-2ml處于對數(shù)生長期菌液,置于I. 5ml離心管中，12000r/min離心Imin
棄上清。②向收集到的菌體沉淀中加200 Ul消化緩沖液Ds，用漩渦振蕩器劇烈震蕩直至菌體徹底懸浮。③加入20 ill蛋白酶K溶液混勻。④加入220 u I裂解緩沖液Ms，漩渦震蕩混勻后，65°C溫浴lOmin，溶液變清涼，簡短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠。⑤加入220 ill無水乙醇，上下顛倒混勻，此時可能出現(xiàn)絮狀沉淀，將溶液及絮狀沉淀轉(zhuǎn)移到純化柱中，12000r/min離心lmin，棄濾液。⑥加入500 ii I去蛋白液Ps, 12000r/min離心lmin,棄濾液。⑦加入500 u I漂洗液PE, 12000r/min離心lmin,棄濾液。⑧重復(fù)步驟⑦⑨12000r/min離心3min，以徹底除去純化柱中殘留的液體。⑩將純化柱置于新的I. 5離心管中，向純化柱中央處懸空加入20-30 ill超純水，室溫放置2min，12000r/min離心2min，管底即為高純度基因組DNA，-20°C保存。(4) 16s rDNA 序列擴(kuò)增①PCR擴(kuò)增引物(細(xì)菌通用引物)27F GGCAGGCCTAACACATGCAAG1492R ACGGCTACCTTGTTACGACTT②PCR擴(kuò)增體系和程序
權(quán)利要求
1.葡萄球菌(Staphylococcussp. ) LZ16 株，其保藏編號為 CGMCCNo. 6121。
2.含有權(quán)利要求I所述葡萄球菌LZ16株的菌劑。
3.含有權(quán)利要求I所述葡萄球菌LZ16株的生物制品。
4.權(quán)利要求I所述的葡萄球菌LZ16株產(chǎn)生的具有抗菌活性的嘌呤核苷磷酸化酶PNP，其氨基酸序列為 1)SEQID No. 3所示的氨基酸序列，或 2)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求4所述嘌呤核苷磷酸化酶PNP的基因，是如下a)或b) a)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. 2所示；或 b)由SEQID No. 2所示核苷酸序列經(jīng)取代一個或幾個核苷酸，得到編碼嘌呤核苷磷酸化酶的核苷酸序列。
6.一種重組表達(dá)載體，其為含有權(quán)利要求5所述基因為目的基因的表達(dá)盒。
7.權(quán)利要求I所述的葡萄球菌LZ16株或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求2所述的菌劑或權(quán)利要求3所述的生物制品在抑制植物病原菌上的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于,所述的植物病原菌為稻痕菌(Magnaporthegrisea)。
9.權(quán)利要求4所述的嘌呤核苷磷酸化酶PNP或權(quán)利要求5所述的PNP編碼基因在抑制植物病原菌上的應(yīng)用。
10.用于PCR方法擴(kuò)增權(quán)利要求5所述基因的引物，其為引物I:5’ -CAGTCCATGGGCACAAAAGCAACACCTCATATTC-3，引物 2 :5，-CCGCTCGAGTTCAGCAATTTCTAATGCTATTTC-3，。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株葡萄球菌(Staphylococcus sp.)LZ16株，其保藏編號為CGMCC No.6121。該菌具有嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase,PNP)蛋白，對植物病原菌具有抑制作用，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，編碼該抗菌蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明提供的葡萄球菌LZ16株對水稻稻瘟病有明顯的抑制作用，將本發(fā)明的菌株LZ16制成抗菌劑或生物農(nóng)藥可對水稻的稻瘟病防治產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣使用，有效提高水稻的生產(chǎn)性能。
文檔編號C12N9/12GK102703355SQ201210189708
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者余琴, 劉柱, 孫群, 張維, 朱建清, 林敏 申請人:汕頭大學(xué)