專利名稱：蝙蝠sars樣冠狀病毒刺突蛋白免疫決定區(qū)及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(Rp3-S)免疫決定區(qū)，同時(shí)還涉及ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(Rp3-S)免疫決定區(qū)的制備方法，還涉及ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(Rp3-S)免疫決定區(qū)的用途。
背景技術(shù)：
SARS冠狀病毒是2002-2003年在中國暴發(fā)的SARS的病原。而蝙蝠SARS樣冠狀病毒與SARS冠狀病毒存在很高的同源性。自2005年被本課題組首次發(fā)現(xiàn)后，世界范圍內(nèi)均有關(guān)于類似病毒的報(bào)道，但關(guān)于蝙fe SARS樣冠狀病毒免疫原性的報(bào)道卻不多。香港大學(xué)通 過信息學(xué)分析認(rèn)為，該病毒有逃逸并傳播于人類的危險(xiǎn)。研究表明，蝙fe SARS樣冠狀病毒與SARS冠狀病毒的主要差異在S蛋白，即主要負(fù)責(zé)和細(xì)胞受體結(jié)合、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白。蝙蝠SARS樣冠狀病毒只要獲得人SARS冠狀病毒S蛋白上的一小段，便可以對小鼠致病。由此可見，此病毒有潛在致病性。因而，關(guān)于該病毒免疫原性的研究對于設(shè)計(jì)特異性疫苗或診斷方法就顯得特別重要。申請人:前期的工作發(fā)現(xiàn)，蝙蝠SARS樣冠狀病毒感染的蝙蝠血清與人SARS冠狀病毒S蛋白有交叉反應(yīng)，但不能中和人SARS冠狀病毒，說明蝙蝠SARS樣冠狀病毒和人SARS冠狀病毒S蛋白之間存在著很大的差異。這可以歸因于兩個(gè)病毒S蛋白與受體結(jié)合的部分，即誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的區(qū)域存在著相對較低的同源(圖I)。本研究組在前期的工作中利用假病毒入侵實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蝙蝠SARS樣冠狀病毒S蛋白的免疫決定區(qū)位于其受體結(jié)合區(qū)對應(yīng)的區(qū)域。該免疫決定區(qū)的具體位置的確定對于設(shè)計(jì)蝙蝠SARS樣冠狀病毒特異診斷、保護(hù)性疫苗、和抗病毒藥物的研發(fā)極為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒(Rp3)刺突蛋白(Rp3_S)免疫決定區(qū)蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示。該決定區(qū)信息為首次鑒定，可用于蝙蝠SARS樣冠狀病毒的特異性的診斷。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是在于提供了ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(Rp3_S)免疫決定區(qū)蛋白的制備方法。該方法簡單易行，操作方便，易于生產(chǎn)。本發(fā)明的再ー個(gè)目的是在于提供了ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(Rp3_S)中的S280-455多肽片段在鑒定小鼠抗S單克隆抗體表位中的應(yīng)用。該方法特異性好，操作簡單，實(shí)驗(yàn)易于重復(fù)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(S)免疫決定區(qū)蛋白及其制備方法，它包括以下步驟根據(jù)本研究組前期的工作，申請人比較了蝙蝠SARS樣冠狀病毒和SARS-CoV S蛋白免疫原性的差別，認(rèn)識到它們免疫顯性區(qū)的差異可能在于其受體結(jié)合區(qū)。然而，申請人依然不清楚其免疫顯性區(qū)的具體氨基酸位置。為此，申請人將S基因(GenBank序列號:DQ071615,在基因組核苷酸序列的位置21486-25211bp)序列截成6段(圖2)，分別進(jìn)行原核蛋白表達(dá)，而后應(yīng)用了鼠源的全長S單抗克隆抗體、多克隆抗體鑒定S免疫決定區(qū)的具體位置。A. Rp3-s六個(gè)截?cái)嗟钠蔚腜CR擴(kuò)增Rp3_S蛋白的SI區(qū)及其截?cái)嗟奈鍌€(gè)區(qū)域分別為l_666aa，表達(dá)的蛋白命名為 S1-666，核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；l_81aa，表達(dá)的蛋白命名為S1-82核苷酸序列為SEQID NO. 3所示；82-280aa，表達(dá)蛋白質(zhì)命名為S82-280，核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示；280-455aa，表達(dá)的蛋白質(zhì)命名為S280-455，核苷酸序列為SEQ ID NO. 5所示；429_574aa，表達(dá)的蛋白質(zhì)命名為S429-574，核苷酸序列為SEQ ID NO. 6所示；561_666aa，蛋白質(zhì)命名為S561-666，核苷酸序列為SEQ ID NO. 7所示。根據(jù)六個(gè)片段的核苷酸序列，設(shè)計(jì)的6對引物如下1-666 :正向5 ’ -GGCCGAATTCATGAAAATTTTAAT-3 ’，反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，，l-81aa :正向5，-GGCCGGATCCATGAAAATTTTAAT-3，，反向5，-ACTTGTCGACGTAGGTAAACCTAT-3，；82-280aa :正向5，-GGCCGGATCCTTTGACAATCCTAT-3，，反向5’-CTCAGTCGACAATAGCATTGGTAA-3’ ；280-455aa :正向5’ -TGCCGGATCCATTGATTGTGCTCA-3 ’，即為 SEQ ID NO. 8，反向5’-CAGTGTCGACTTAAGAAAGGTCTCTCTCAAA-3’，即為 SEQ IDN0. 9 ；429-574aa :正向5，-GGACGGATCCACTGCAAAGCAGGATCAA-3，，反向5’-GAACGTCGACTGTTCCTGGTGTAATTAC-3’ ；561-666aa :正向5，-GGCTGGATCCCCATGCTCTTTTGG-3，；反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，。PCR反應(yīng)的試劑如下將5μ I的IOxTaq聚合酶緩沖液、4μ I的dNTP混合物、
O.25 μ I 的 TaqDNA 聚合酶、I μ I 含 Rp3_S 基因的質(zhì)粒 pCDNA3.ト Rp-S (Ren, ff.，Qu, X.，Li, ff. , Han, Z. , Yu, Μ. , Zhang, S. , Wang, L. F. , Deng, H. , Shi, Z. Difference in receptorusage between SARScoronavirus and SARS-Iike coronavirus of bat origin.JVirol, 2008, 82(4) :1899 - 1907)，引物對各用I μ I和37. 75 μ I的無菌水混合。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性300秒、94°C變性30秒、56°C復(fù)性30秒、72°C延伸60秒，循環(huán)30次后72°C最后延伸600秒。B.載體構(gòu)建通過上述擴(kuò)增后得到的Rp3_Sl通過BamHI和XhoI酶切后連接于表達(dá)載體pMAL-C2X(購自New England Biolabs)，五個(gè)截?cái)嗥瓮ㄟ^BamHI和XhoI酶切后分別連接于表達(dá)載體pET32a上(購自Novagen)。所有的構(gòu)建質(zhì)粒都通過測序確定無誤。C.蛋白的表達(dá)和純化將重組質(zhì)粒純化后，轉(zhuǎn)化BL21 (購自Promega)感受態(tài)細(xì)胞，再培養(yǎng)于含氨芐青霉素(Amp)抗性平板上。次日挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，然后在終濃度為0. 3mMIPTG的培養(yǎng)基中30°C誘導(dǎo)6小吋。收集菌體超聲波破碎后進(jìn)行純化。以pMALc2x載體表達(dá)的SI蛋白需要用MBP樹脂柱進(jìn)行純化，用pET32a表達(dá)載體上帶有His Tag標(biāo)簽，表達(dá)的蛋白均用His Tag純化試劑盒進(jìn)行純化。所有純化步驟均按照Promega公司的His_band試劑盒說明進(jìn)行。純化后在SDS-PAGE中檢測蛋白的純度(圖3)，即得到目的蛋白。所有的蛋白純度都達(dá)到了90%以上。D.蝙蝠SARS樣冠狀病毒S DNA免疫的小鼠血清的制備pCDNA3. l_Rp3_S被以體內(nèi)電擊的方式注射6_8周齡雌性BALB/c小鼠，分別在0、3和5周時(shí)免疫小鼠，在第八周的時(shí)候提取小鼠血清，這些血清即為含蝙蝠SARS樣冠狀病毒S蛋白多克隆抗體的抗血清。同時(shí)采健康小鼠的血清一份作為陰性對照，共五份血清樣本，陽性血清樣本依次命名為Rp-SfRp-S4。E. ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(Rp3_S)免疫決定區(qū)蛋白的確立，其步驟 為首先用5個(gè)純化的截?cái)郤I蛋白作為包被抗原，小鼠抗S蛋白血清作為ー抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗進(jìn)行ELISA反應(yīng)。結(jié)果顯示5只小鼠血清與5個(gè)蛋白反應(yīng)各異(圖4)。結(jié)果顯示，大多數(shù)免疫小鼠血清都可以與S280-455和S561-666反應(yīng)Rp-Sl Rp-S4四份免疫小鼠血清都可與S280-455反應(yīng)，Rp-Sl, Rp_S3和Rp_S4與S561-666反應(yīng)，只有Rp_S2 —份血清與S429-574反應(yīng)，沒有血清可以跟S1-82及S82-455反應(yīng)。鑒于S561-666區(qū)段存在著冠狀病毒中非常保守的免疫顯性區(qū)，因而不能作為蝙蝠SARS樣冠狀病毒特異檢測的表位，而S280-455存在著蝙蝠SARS樣冠狀病毒和人SARS冠狀病毒S蛋白主要區(qū)別之一，因而申請人認(rèn)為S280-455存在著可以被小鼠抗體識別且可被應(yīng)用的主要免疫決定表位，其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示。該肽段具有最好的免疫原性，是S蛋白的主要免疫區(qū)，而該區(qū)域與人SARS冠狀病毒S蛋白的主要免疫決定區(qū)并不完全重疊，此發(fā)現(xiàn)對于構(gòu)建針對蝙蝠SARS樣冠狀病毒的特異檢測方法，以及設(shè)計(jì)針對該病毒的疫苗都要重要的意義，在未來該類病毒特異鑒定工作中具有良好的前景?！N編幅SARS樣誕狀病韋刺突蛋白免疫決定區(qū)蛋白在鑒定小鼠抗S單克隆抗體表位中的應(yīng)用，其步驟為A.小鼠抗蝙蝠SARS樣冠狀病毒S單克隆抗體的制備申請人將含蝙蝠SARS樣冠狀病毒Rp3株S蛋白的假病毒(HIV/Rp3-S)作為抗原在BALB/c小鼠中按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Evan, G. let al，1985，Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-mycproto-oncoge ne product. Mol Cell Biol 5:3610-6.)制備。將挑選陽性的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并腹腔注射入同來源小鼠，并收集腹水。其效價(jià)隨后通過ELISA進(jìn)行鑒定。為了避免這些單克隆抗體與載體pET32a tag (購自Novagen)的交叉反應(yīng),在應(yīng)用之前,所有的單抗均用含pET32a tag的細(xì)菌裂解物進(jìn)行了中和。B.用S280-455鑒定小鼠抗S單克隆抗體的蛋白雜交反應(yīng)。用S280-455蛋白作為抗原，小鼠抗S單克隆抗體作為檢測抗體進(jìn)行蛋白雜交反應(yīng)。篩選到四個(gè)S蛋白單克隆抗體，命名SmAbl-SmAb4，均可以特異的識別S280-455而不是pET32a Tag或其它四個(gè)截?cái)啾磉_(dá)的S蛋白。這些數(shù)據(jù)印證了 S280-455是主要的免疫決定區(qū)(圖5)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
首先，鑒定出的蝙蝠SARS樣冠狀病毒S蛋白主要免疫決定區(qū)S280-455，該肽段具有最好的免疫原性，是S蛋白的主要免疫區(qū)，而該區(qū)域與人SARS冠狀病毒S蛋白的主要免疫決定區(qū)并不完全重疊，此發(fā)現(xiàn)對于構(gòu)建針對蝙蝠SARS樣冠狀病毒的特異檢測方法，以及設(shè)計(jì)針對該病毒的疫苗都要重要的意義，在未來該類病毒特異鑒定工作中具有良好的前
旦
牙ヽ；其次，提供的蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白(S)免疫決定區(qū)蛋白的制備方法，該方法簡單易行，操作方便，易于生產(chǎn)；再次，提供的S280-455多肽片段在鑒定小鼠抗S單克隆抗體表位中的應(yīng)用方法特異性好，操作簡單，易于重復(fù)。


圖I為ー種蝙蝠SARS樣冠狀病毒Rp3_S對應(yīng)于SARS冠狀病毒Tor2_S蛋白的受體結(jié)合區(qū)示意圖。圖中數(shù)字為氨基酸位點(diǎn)。下劃線部分為兩者差異最大的部分，也是Tor2-S蛋白與受體結(jié)合核心部分。圖2為ー種全長的蝙蝠SARS樣冠狀病毒SI部分及五個(gè)截?cái)嗟腟片段示意圖。圖3為ー種Rp3_S蛋白的SI區(qū)及其五個(gè)截?cái)嗟腟ARS樣冠狀病毒S蛋白純化后的SDS-PAGE示意圖。蛋白均帶有20kD的標(biāo)簽。圖4為蝙蝠SARS樣冠狀病毒SI上可被小鼠S抗體識別的免疫顯性區(qū)示意圖。截?cái)啾磉_(dá)的S蛋白作為包被抗原，它們與四份Rp3_S DNA免疫的小鼠血清(命名為Rp-Sl到Rp-S4)反應(yīng)。ー份正常鼠血清用作陰性對照。數(shù)據(jù)表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖5為ー種鑒定Rp3 SI小鼠單抗的效價(jià)及其所識別的表位示意圖。在蛋白雜交反應(yīng)中，只有S280-455可以被單抗識別。單抗I :250稀釋使用。圖中的數(shù)字1，pET32a tag 蛋白；2，S280-455 蛋白。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :設(shè)計(jì)擴(kuò)增蝙蝠SARS樣冠狀病毒S基因截?cái)嗥危洳襟E是基于本實(shí)驗(yàn)室前期工作得到的蝙蝠SARS樣冠狀病毒S基因的序列(GenBank序列號DQ071615，在基因組核苷酸序列的位置21486-25211)，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取Rp3-Sl及其五個(gè)截?cái)郤的目的基因。引物分別如下1-666 :正向5’ -GGCCGAATTCATGAAAATTTTAAT-3，，反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，；l-81aa :正向5，-GGCCGGATCCATGAAAATTTTAAT-3，，反向5，-ACTTGTCGACGTAGGTAAACCTAT-3，；82-280aa :正向5，-GGCCGGATCCTTTGACAATCCTAT-3，；反向5，-CTCAGTCGACAATAGCATTGGTAA-3，；280-455aa :正向5，-TGCCGGATCCATTGATTGTGCTCA-3，，反向5’-CAGTGTCGACTTAAGAAAGGTCTCTCTCAAA-3’ ；429-574aa :正向5，-GGACGGATCCACTGCAAAGCAGGATCAA-3，，
反向5’-GAACGTCGACTGTTCCTGGTGTAATTAC-3’ ；561-666aa :正向5，-GGCTGGATCCCCATGCTCTTTTGG-3，，反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，。每個(gè)基因各用上述的ー對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的試劑如下將5μ I的IOxTaq聚合酶緩沖液、4 μ I的dNTP混合物、O. 25 μ I的TaqDNA聚合酶、I μ含有pcDNA3. 1-Rp3-S質(zhì)粒，引物對各用I μ 1，和37. 75 μ I的無菌水混合。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性300秒、94°C變性30秒、56°C復(fù)性30秒、72°C延伸60秒，循環(huán)30次后72°C最后延伸600 秒。實(shí)施例2 蝙蝠SARS樣冠狀病毒S截?cái)嗟鞍字亟M表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)和純化，其步驟 是用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI (Takara公司產(chǎn)品)對回收的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET32a質(zhì)粒進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)出&111!11和乂1101各1レ1，10倍!1緩沖液2レ1，，PCR產(chǎn)物或pET32a質(zhì)粒質(zhì)粒50-100ng，加無菌水至總體積為20 μ I。37°C I小時(shí)，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA回收后用T4DNA連接酶(Takara公司產(chǎn)品)將PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET32a連接。連接反應(yīng)T4DNA連接酶(lU/μ I) I μ l，PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET32a的摩爾比為3 :1，并且DNA總量為O. I μ g，5倍連接酶反應(yīng)緩沖液4 μ 1，加無菌水至總體積為20 μ 1，16°C放置24小吋。將2μ I連接反應(yīng)液加到60μ I的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，混勻，電擊轉(zhuǎn)化，37°C搖床(220rpm)溫育I小時(shí)；搖勻菌液，取100 μ I涂布于LB/ΑΡ+瓊脂平板上，待菌液吸干后倒置于37°C培養(yǎng)12 16小時(shí)，觀察結(jié)果。次日挑取單菌落10個(gè)，于4ml含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜。待菌液培養(yǎng)結(jié)束，取菌液提取質(zhì)粒并以BamHI和XhoI進(jìn)行酶切鑒定。有插入片段的陽性克隆子送測序公司進(jìn)行測序分析。挑選樣陽性單克隆，接種新鮮Amp LB培養(yǎng)基。250rpm，37°C，震蕩培養(yǎng)過夜。第三天，將過夜培養(yǎng)菌液，按1:100比例，接種新鮮LB培養(yǎng)基，同樣加入Amp抗性。于37°C，250rpm震蕩培養(yǎng)3_4小時(shí)，至菌液濃度達(dá)到0D260=0. 6 I. 0，此時(shí)細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期。加入終濃度為O. 3mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。250rpm，30°C，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)6小時(shí)，離心收獲菌體。用PBS溶液洗滌兩遍后，重懸于適量O. 01mol/L PBS中(濃縮比例為200ml原始菌液到20mlPBS中)。_80°C反復(fù)凍融三次后，進(jìn)行超聲波破碎和蛋白純化。因?yàn)閜ET32a表達(dá)載體上帶有His Tag標(biāo)簽,所以表達(dá)的蛋白可以用His Tag純化試劑盒(Hisband,購自Novagen)進(jìn)行純化。純化過程如下首先對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行超聲波破碎，之后，16000rpm,4°C,離心15min,收取上清,用O. 45nm孔徑濾器過濾。接下來用His Bind純化試劑盒純化,主要步驟包括首先，依次加入3倍的雙蒸水，5倍的Charge Buffer,3倍的Bi nding Buffer對柱子進(jìn)行平衡；將過濾后的上清通過柱子；依次加入10倍的Binding Buff er, 6倍的WashBuffer洗滌；最后用6倍的Elute Buffer進(jìn)行蛋白洗脫。全部純化完畢后，對His Bind純化柱子進(jìn)行再生。最終純化出的蛋白均通過SDS-PAGE、蛋白濃度測定保證純度達(dá)到95%以上和濃度大于IOOng/μ I (圖3)。l_81aa經(jīng)表達(dá)后得到的蛋白質(zhì)命名為Sl_82 ;82_280aa經(jīng)表達(dá)后得到的蛋白質(zhì)為S82-280 ;280-455aa經(jīng)表達(dá)后得到的蛋白質(zhì)命名為S280-455 ;429_574aa經(jīng)表達(dá)后得到的蛋白質(zhì)命名為S429-574 ;561-666aa經(jīng)表達(dá)后得到的蛋白質(zhì)命名為S561-666。
實(shí)施例3 蝙蝠SARS樣冠狀病毒S截?cái)嗥闻cS DNA免疫的小鼠血清的ELISA反應(yīng)。小鼠抗全長S的血清來自于DNA免疫的以下質(zhì)粒構(gòu)建于P⑶NA3. I (+)密碼子優(yōu)化過的 Rp3_S (Ren et al, 2008, Journal of Virology, Difference in Receptor Usagebetween Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)Coronavirus and SARS-LikeCoronavirus of Bat Origin))以及 pO)NA3· I (+)空載體質(zhì)粒(Introgen 公司)被用作陰性對照。將30 μ g質(zhì)粒用30 μ I的PBS稀釋后以體內(nèi)電擊的方式注射6-8周齡雌性BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)共分為 2 組(詳見 zhou et al, 2009, BBRC, Immunogenicity difference betweenthe SARS coronavir us and the batSARS-like coronavirus spike (S) proteins),母組有5只小鼠。分別在0、3和5周時(shí)免疫小鼠，在第八周的時(shí)候取小鼠 血清。5只被Rp3-S免疫的小鼠血清命名為Rp-SfRp-S4，Pre-bleed為免疫前小鼠血清對照組。制得抗體后，申請人進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)測定表達(dá)片段與抗體的反應(yīng)性。方法如下首先用純化的蛋白包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 μ I底物包被酶標(biāo)板，4°C過夜。次日，取出用PBS-T (含有體積比為0. I %的Tween-20的PBS)洗滌三次，每次5分鐘。然后，加入3% (質(zhì)量體積比)牛血清蛋白，200 μ I每孔，37°C，靜置I小時(shí)，進(jìn)行封閉。I個(gè)小時(shí)后，取出，PBS-T洗滌三次，每次5分鐘。洗滌之后進(jìn)行待測抗血清的檢測。每孔加入待測血清，終體積為100μ I。同時(shí)，做正常血清和PBS溶液的陰性對照組。37°C，孵育I小時(shí)后，取出反應(yīng)樣品，PBS-T洗滌五次，每次3分鐘。以I :4000比例稀釋HRP標(biāo)記羊抗鼠ニ抗(武漢三鷹公司)，每孔加入100 μ I。37°C，再次孵育I小時(shí)。取出，PBS-T再次洗滌五次后，依次加入底物A (體積比30%過氧化氫)、B (3，3，5，5，依四甲基聯(lián)苯胺，TMB緩沖液)液各50 μ 1，37°C，避光顯色5分鐘。最后，每孔加入50 μ I 2M/L H2SO4-止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀取0D450的值。OD值大于陰性對照孔的2. I倍確定為陽性反應(yīng)。結(jié)果如圖4所示大多數(shù)被免疫的小鼠血清都可以與S280-455和S561-666反應(yīng)Rp_Sl Rp_S4四份小鼠血清都可與S280-455反應(yīng)，Rp-Sl, Rp-S3和Rp-S4與S561-666反應(yīng)，只有Rp_S2 —份血清與S429-574反應(yīng)，沒有血清可以跟S1-82及S82-280反應(yīng)。鑒于S561-666區(qū)段存在著冠狀病毒中非常保守的免疫顯性區(qū)，因而不能作為蝙蝠SARS樣冠狀病毒特異檢測的表位，而S280-455存在著蝙蝠SARS樣冠狀病毒和人SARS冠狀病毒S蛋白主要區(qū)別之一，因而申請人認(rèn)為S280-455存在著可以被小鼠抗體識別且可被應(yīng)用的主要免疫決定表位，其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所
/Jn ο實(shí)施例4 S280-455在鑒定S小鼠單克隆抗體識別表位中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程為針對Rp3-S_的假病毒(HIV/Rp3_S)制備過程如下利用HIVNL4-3 ( Δ ENV) Iuc質(zhì)粒(缺失囊膜基因ENV，帶有ー個(gè)熒光素酶報(bào)告基因)，外來質(zhì)粒表達(dá)的人SARS-CoVBJ01，SL-CoVRp3 S蛋白或ー個(gè)RBD區(qū)被替換為SSARS的嵌合體SSL，替代ENV蛋白的位置，構(gòu)成HIV/BJ01-S、HIV/Rp3-S或HIV/CS310-518假病毒，假病毒的感染成功與否可用熒光素酶的活性表示。具體的包裝步驟如下轉(zhuǎn)染前一天將293T細(xì)胞按4xl06/皿密度接種于IOcm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前給293T細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基(或者換一半培養(yǎng)基)，轉(zhuǎn)染時(shí)分2個(gè)I. 5ml離心管離心管A(CaCl2+DNA 混合物)500 μ I (用超純水補(bǔ)齊)，包括HIV_luc 質(zhì)粒 pNL-Luc-E-R- (RongLiu, Benjamin Chen and Nathaniel R. Landau. Use of Luciferase Reporter Viruses forStudying HIV Entry. HIV Protocols, Methods in Molecular Medicine, 1999, HIV Volume17，I, 35-40, DOI :10. 1385/0-89603-369-4:35) 12 μ g, Rp3_S 表達(dá)質(zhì)粒 pCDNA3.トRp3_SDNA 12 μ g,向上述DNA溶液中加入62 μ 12Μ CaCl2,，輕輕吹吸混勻。取一個(gè)新的I. 5ml離心管(管 B)，加入 500 μ 12xHBS (280mMNaCl, I. 5mMNa2HP02 , 50mMHepes, pH 7. 10)，將 500 μ I管A溶液逐滴加入管B溶液中，邊加入邊用槍頭或輕彈混勻，室溫放置20-30min,將上述Iml混合液體逐滴均勻地加入293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染8至12h之后給細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基10ml，轉(zhuǎn)染48h后，收集293T細(xì)胞的培養(yǎng)基上清，3000轉(zhuǎn)低速離心5min去除細(xì)胞碎片，上清再用0. 45 μ m濾器過濾除去細(xì)小細(xì)胞碎片及可能的細(xì)菌，將過濾好的病毒上清分裝凍存于_80°C或直接用于感染試驗(yàn)。針對S全長的鼠源單抗制作過程如下申請人首先將含Rp3_S的假病毒(HIV/ Rp3-S)注射BALB/c小鼠，然后將小鼠殺死后將其脾臟細(xì)胞取出并與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合而成)進(jìn)行融合。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以ELISA進(jìn)行Rp3-S抗體陽性篩選，包被抗原為假病毒HIV/Rp3-S和純化的Rp3-Sl (實(shí)施例4)。將挑選陽性的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并腹腔注射入同來源小鼠，并收集腹水。其效價(jià)隨后通過ELISA進(jìn)行鑒定。為了避免這些單克隆抗體與pET32a tag的交叉反應(yīng)，在應(yīng)用之前，所有的單抗均用含pET32a tag的細(xì)菌裂解物進(jìn)行了中和。接下來應(yīng)用蛋白雜交試驗(yàn)測試S蛋白片段中單克隆抗體的抗原表位，其步驟是用IX 樣品處理液(50mM Tris-HCl (pH6. 8),2% (ff/V)SDS,0. 1% (W/V)溴酚藍(lán)，10% (V/V)甘油，1% (W/V) β-巰基こ醇)純化的S片段蛋白并在沸水浴中煮10分鐘，然后以12%的SDS-PAGE進(jìn)行分離。然后將蛋白膠或進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色或轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜在含5% (質(zhì)量體積比)脫脂奶粉的TBS(20mMTris base, 137mMNaCl, pH 7. 6)溶液中封閉過夜。用TBST (含體積比為0. 1% TWeen-20TBS溶液)洗滌3次，每次lOmin。然后以I :1000稀釋的DNA免疫得到的S蛋白抗體、I :250稀釋的S蛋白單抗37°C孵育一小吋，抗體孵育液為含1% (質(zhì)量體積比)脫脂奶粉的TBST。棄去ー抗孵育液，用TBST洗滌3次，每次lOmin。加入AP標(biāo)記1:2000稀釋的羊抗鼠ニ抗37°C孵育一小時(shí)。棄去ニ抗孵育液，用TBST洗滌3次，每次lOmin。PVDF膜在IOmL堿性磷酸酶顯色液(33 μ 15-溴-4-氯吲哚磷酸鹽+66 μ I氯化硝基四氮唑藍(lán))避光顯示，并及時(shí)終止反應(yīng)。所有的四個(gè)單抗均可以特異的識別S280-455而不是pET32a Tag或其它四個(gè)截?cái)啾磉_(dá)的S。這些數(shù)據(jù)印證了該區(qū)域是重要的免疫顯性區(qū)。
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I所述蛋白的制備方法，其步驟是 A、PCR擴(kuò)增以蝙蝠SARS樣冠狀病毒S基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增 正向引物5’ -TGCCGGATCCATTGATTGTGCTCA-3’，即為 SEQ ID NO. 8 ； 反向引物5’ -CAGTGTCGACTTAAGAAAGGTCTCTCTCAAA-3’，即為 SEQ ID NO. 9 ； PCR反應(yīng)的試劑如下將5 μ I的IOxTaq聚合酶緩沖液、4 μ I的dNTP混合物、O. 25 μ I的TaqDNA聚合酶、I μ I含Rp3_S基因的質(zhì)粒pCDNA3. l_Rp_S，引物對各用I μ I和37. 75 μ I的無菌水混合； PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性300秒、94°C變性30秒、56°C復(fù)性30秒、72°C延伸60秒，循環(huán)30次后72 °C最后延伸600秒； B、通過上述擴(kuò)增后得到的片段用BamHI和XhoI酶切后連接于表達(dá)載體pET32a上，并測序確定無誤； C、將重組質(zhì)粒純化后，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，在培養(yǎng)于含氨芐青霉素抗性平板上；次日挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，然后在終濃度為O. 3mM IPTG的培養(yǎng)基中30°C誘導(dǎo)6小時(shí)；收集菌體超聲波破碎后進(jìn)行純化，用His Tag純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后在SDS-PAGE中檢測蛋白的純度，即得到目的蛋白。
3.權(quán)利要求I所述蛋白在鑒定小鼠抗S單克隆抗體表位中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了蝙蝠SARS樣冠狀病毒刺突蛋白免疫決定區(qū)及制備方法和用途，其步驟是A、以蝙蝠SARS樣冠狀病毒S基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增；B、通過上述擴(kuò)增后得到的片段用BamHI和XhoI酶切后連接于表達(dá)載體pET32a上，并測序確定無誤；C、將重組質(zhì)粒純化后，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，在終濃度為0.3mMIPTG的培養(yǎng)基中30度誘導(dǎo)；收集菌體超聲波破碎后進(jìn)行純化，用HisTag純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后在SDS-PAGE中檢測蛋白的純度，得到目的蛋白。該方法簡單易行，操作方便，易于生產(chǎn)；該肽段具有最好的免疫原性，在鑒定小鼠抗S單克隆抗體表位中的應(yīng)用方法特異性好，操作簡單，易于重復(fù)。
文檔編號C12N15/50GK102690336SQ20121018971
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者周鵬, 石正麗, 韓正剛 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所