專利名稱：檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
木薯細(xì)菌性萎蔫病菌導(dǎo)致的木薯細(xì)菌性萎蔫病是木薯上最為嚴(yán)重的病害，是木薯繁育的ー個(gè)重要限制因子。該病具有高風(fēng)險(xiǎn)、分布廣、可種傳的特點(diǎn)，是國際上的ー種重要的植物檢疫對(duì)象，在我國新出臺(tái)的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄》被列為檢疫性病害。木薯感染此病后可造成木薯產(chǎn)量下降12%_100%，該病害在南非被首次報(bào)道，目前在除歐洲以外的全世界的許多國家都有報(bào)道。1973年該細(xì)菌病害在Nigeria發(fā)生時(shí)當(dāng)年就造成木薯產(chǎn)量損失75%，并導(dǎo)致了嚴(yán)重的恐慌。木薯細(xì)菌性萎蔫病菌主要為害部位是木薯的葉片、莖部。屬系統(tǒng)性分布為害整株病害。葉片染病形成濕色角斑，濕度大時(shí)其上流膠，初為白色粘液，后變?yōu)辄S褐色，致植株萎蔫、流膠。莖部染病常致莖凹陷，分泌出大量膠質(zhì)物，加速葉片枯萎。塊根染病維管束變?yōu)辄S褐色，根系及維管束出現(xiàn)干腐，嚴(yán)重的全株死亡。病菌在老熟莖桿的皮部里存活，主要靠帶菌的種莖進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，此外雨水、昆蟲、病土及帶菌工具也可傳播。在嚴(yán)重的木薯細(xì)菌性萎蔫病的困擾下，全世界大部分易感病地區(qū)都降低了木薯的種植面積。因此需要建立一種準(zhǔn)確、高效、快速的木薯細(xì)菌性萎蔫病的檢測方法，為木薯繁殖材料的檢疫工作提供技術(shù)支持。但目前還沒有能夠精確的檢測出檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的相關(guān)技木。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物及試劑盒，從而能夠精確快速的對(duì)木薯細(xì)菌性萎蔫病菌進(jìn)行檢測，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明ー個(gè)方面涉及檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物，為引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO 1-4 0本發(fā)明另ー個(gè)方面提供ー種木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒，其中包括如下的組分(I)模板預(yù)處理反應(yīng)液:3· 2μΜ引物FIP，3. 2μΜ引物ΒΙΡ，0· 4μΜ引物F3，0. 4μΜ引物 Β3，800 μ M dNTP, IXThermol Buffer ；所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分別如SEQ ID NO :1、2、3和4所示;(2)溶液 I :lXThermol Buffer, O. 64U/ μ L Bst DNA Polymerase,所述IXThermol Buffer 成分為20mM Tris-HCl (pH8. 8)，IOmM KCl, IOmM (NH4)2S04,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，pH 8.8。、
本發(fā)明的試劑盒用于檢測植物中的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌。本發(fā)明的試劑盒根據(jù)木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株的TAL效應(yīng)器蛋白質(zhì)(pthBXam)保守基因序列設(shè)計(jì)引物，從而保證了檢測方法的特異性。本發(fā)明采用改進(jìn)的LAMP擴(kuò)增技木，該技術(shù)特異性強(qiáng)，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，檢測方法簡單、快速，特異性強(qiáng)、靈敏度高，特別適用于基層植保機(jī)構(gòu)及植物產(chǎn)品公司與相關(guān)檢測部門。


圖I:本發(fā)明的引物檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌LAMP的擴(kuò)增圖譜，其中I空白對(duì)照、2陽性樣品、3-6陰性對(duì)照、M DNA Marker。
具體實(shí)施例方式LAMP引物的設(shè)計(jì)主要是針對(duì)靶基因的四個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3'端的以及 5'端的4個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4個(gè)引物。利用設(shè)計(jì)的異引物并依靠高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。本發(fā)明選用TAL效應(yīng)器蛋白質(zhì)(pthBXam)保守基因來設(shè)計(jì)LAMP引物。申請(qǐng)人在長期的研究中發(fā)現(xiàn)TAL效應(yīng)器蛋白質(zhì)(pthBXam)保守基因是木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的特異序列之一，該序列在GenBank上的登錄號(hào)是HQl 13297. I。本發(fā)明提供的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒，其中包括(I)模板預(yù)處理反應(yīng)液其中包括3. 2 μ M引物FIP，3. 2 μ M引物BIP，O. 4 μ M引物F3，O. 4 μ M引物 Β3，800μΜ dNTP, IXThermol Buffer，和 ddH20。引物 FIP、BIP、F3 與 B3 的終濃度比為8 8 I I ο木薯細(xì)菌性萎蔫病菌引物F3 5' -CAGAACATCCCGACGCTG-3' (SEQ ID NO 1)B3 5' -GCCCTGTGGCCGTTGA-3' (SEQ ID NO 2)FIP 5' -AGCGCGACCGCTTAAGTCAAG-GTTCCGGCTTACATCCCCA-3' (SEQ ID NO 3)BIP 5' -GGCATTGCCGGCGATCACT-TCGAGCTTCGGAAAGGACCA-3' (SEQ ID NO 4)(2)溶液 I :lXThermol Buffer, O. 64U/ μ L Bst DNA Polymerase,和 ddH20。IXThermol Buffer 反應(yīng)緩沖液成分為20mM Tris_HCl(pH8. 8)，IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，和 ddH20, pH 8. 8。本發(fā)明提供的利用上述試劑盒檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的方法，包括下列步驟( I)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在I. 6-2. O范圍內(nèi)，濃度在IO-IOOng/μ L 范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理將裝有23 μ L模板預(yù)處理反應(yīng)液的反應(yīng)管加入2 μ L待檢模板DNA于94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中45s ;然后94°C水浴25s和59°C水浴45s過程反復(fù)進(jìn)行6個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物用于LAMP模板。(3) LAMP 恒溫?cái)U(kuò)增將上述經(jīng)過處理的模板預(yù)處理溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加熱60min，80°C IOmin,降溫至 4°C。(4)核酸凝膠電泳檢測
核酸擴(kuò)增完成后，在反應(yīng)管中加入6XLoading buffer (組分30mM EDTA ；36%(v/V) Glycerol ;0· 05%(w/v) Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v) BromophenoI Blue),取產(chǎn)物 10 μ L加入2%的瓊脂糖凝膠板的樣品孔中，IOOv電壓，電泳30-40分鐘，電泳成像系統(tǒng)拍照。擴(kuò)增結(jié)果在瓊脂糖凝膠電泳上為梯形核酸條帶，如果出現(xiàn)條帶可以判斷為陽性，否則為陰性。下列實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :對(duì)木薯細(xì)菌性萎蔫病菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測利用木薯細(xì)菌性萎蔫病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒，檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的標(biāo)準(zhǔn)樣品 (I)待檢樣品和木薯細(xì)菌性萎蔫病菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26(l/0D28(l在1.6-2. O范圍內(nèi)，濃度在IO-IOOng/μ L 范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理將裝有23 μ L模板預(yù)處理反應(yīng)液的反應(yīng)管加入2 μ L待檢樣品模板DNA于94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中45s ;然后94°C水浴25s和59°C水浴45s過程反復(fù)進(jìn)行6個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物用于LAMP模板。取2份模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，分別加入2 μ L ddH20和木薯細(xì)菌性萎蔫病菌DNA，重復(fù)上述相同步驟，產(chǎn)物用作LAMP模板，分別作為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照；(3) LAMP 恒溫?cái)U(kuò)增將上述經(jīng)過處理的模板預(yù)處理溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加熱60min，80°C IOmin,降溫至 4°C。(4)核酸凝膠電泳檢測核酸擴(kuò)增完成后，在反應(yīng)管中加入6XLoading buffer，取產(chǎn)物10 μ L加入凝膠板的樣品孔中，電泳40分鐘，電泳成像系統(tǒng)拍照。檢測結(jié)果如圖I所示。結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能夠檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌；不會(huì)產(chǎn)生假陰性或假陽性。利用本發(fā)明的試劑盒對(duì)疑似感染了木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果為陽性。對(duì)該樣品的細(xì)菌培養(yǎng)檢測證實(shí)了本發(fā)明的試劑盒的可靠性。
權(quán)利要求
1.一種檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物，為引物F3、B3、FIP和BIP，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO 1-40
2.一種木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒，其中包括如下的組分 (1)模板預(yù)處理反應(yīng)液3.2 ii M引物FIP，3. 2 ii M引物BIP，0. 4 ii M引物F3，0. 4 ii M弓I物 B3，800iiM dNTP, IXThermol Buffer ；(2)溶液I :lXThermol Buffer, 0. 64U/ u L Bst DNA Polymerase,所述 IXThermol Buffer 成分為20mM Tris-HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4)2SO4,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，pH 8.8。
3.權(quán)利要求2所述的試劑盒用于檢測植物中的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物及試劑盒。所述的引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO1-4。試劑盒內(nèi)有模板預(yù)處理反應(yīng)液、恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液Ⅰ。檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的方法包括細(xì)菌DNA的提取、模板預(yù)處理、LAMP恒溫?cái)U(kuò)增、核酸檢測。本發(fā)明的試劑盒根據(jù)木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株的TAL效應(yīng)器蛋白質(zhì)(pthBXam)保守基因序列設(shè)計(jì)引物，保證了檢測方法的特異性。本發(fā)明采用改進(jìn)的LAMP擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，檢測方法簡單、快速，特異性強(qiáng)、靈敏度高，特別適用于基層植保機(jī)構(gòu)及植物產(chǎn)品公司與相關(guān)檢測部門。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676688SQ20121018981
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者倪新, 厲艷, 吳興海, 封立平, 王英超, 甘琴華, 紀(jì)瑛 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心