專利名稱：布魯氏菌病a19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及布魯氏菌病A19分子標記疫苗的應用及其免疫學鑒別，尤其是布魯氏菌病A19分子標記疫苗的(A19-AVirB12)免疫保護力及應用，建立免疫學方法解決了免疫動物與臨床患病動物難以鑒別的問題，屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的世界各地廣泛流行的人畜共患傳染病。對布魯氏菌病的預防和根除，已經(jīng)成為眾多國家和地區(qū)公共衛(wèi)生安全防御體系的主要任務。在多數(shù)布病流行的國家和地區(qū)，控制家畜布病的主要手段仍是使用疫苗接種進行 免疫，因此，疫苗免疫是預防和控制畜間布魯氏菌病的主要措施和最有效的手段。目前我國使用的弱毒菌疫苗有牛A19、羊M5和豬S2 ;國外使用的弱毒菌疫苗有牛S19和RB51、羊Revl ；S19由美國研發(fā)，我國從前蘇聯(lián)引進，不缺失Ery基因，命名為A19。加拿大、澳大利亞、美國等幾個宣布布病消滅的國家，主要采用以弱毒疫苗免疫為主的綜合防控措施?？v觀布魯氏菌免疫制劑研究歷史我們發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌弱毒苗一直處于主導地位，對布魯氏菌的防治起到很大的作用，但是同時也帶來一些隱憂，首先，現(xiàn)用的布魯氏菌疫苗均為弱毒活菌疫苗，容易感染人，對人類健康存在威脅。其次，疫苗缺乏鑒別診斷標記，疫苗接種動物與自然患病動物無法甄別，造成患病動物在自然群體中長期存在，嚴重危害人類和動物的健康，阻礙動物魯氏菌病的根除和凈化。隨著分子生物學技術的發(fā)展，基因敲除技術成為目前解決弱毒疫苗毒力強、無法用免疫學方法區(qū)分疫苗免疫和自然感染等難題的一項重要技術。為解決布魯氏菌病弱毒疫苗中存在的上述問題，本發(fā)明通過分子生物學技術構建出缺失VirB12蛋白的牛布魯氏菌病分子標記苗，缺失的VirB12蛋白能刺激機體產生有診斷意義的抗體，并且不改變A19疫苗的免疫原性和生物學特性，用免疫學方法可以區(qū)分疫苗免疫抗體和自然感染抗體，彌補現(xiàn)有A19苗的缺陷，對全面提升國產弱毒菌疫苗的性能，發(fā)揮國內自主產權的布魯氏菌弱毒菌疫苗作用的意義重大，為動物布病防控提供新的疫苗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別，應用該布魯氏菌病A19分子標記疫苗后可提供間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)區(qū)分該疫苗接種的動物與野毒感染動物。本發(fā)明以牛為防疫布魯氏菌病的實驗靶動物，應用布魯氏菌病A19- A VirB12標記疫苗免疫牛,評價該分子標記苗的免疫保護力。利用該分子標記苗中缺失的VirB12蛋白作抗原包被酶標板，以健康非免疫牛免疫為陰性對照，自然感染的布病陽性牛免疫為陽性對照，以辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG為二抗，建立了鑒別布魯氏菌病A19-AVirB12免疫動物與野毒感染動物的iELISA方法。本發(fā)明提供的布魯氏菌病A19-AVirB12標記疫苗不僅對牛布魯氏菌病具有好的免疫保護力，而且發(fā)明的iELISA方法解決了免疫動物與臨床患病動物難以鑒別的問題，對牛布魯氏菌病的防控、根除和凈化具有實際應用價值。本發(fā)明所述的一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗的應用，以500億CFU的牛布魯氏菌病A19-A VirB12疫苗活菌皮下注射免疫4_6月齡犢牛。一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗的免疫學鑒別，以布魯氏菌病A19疫苗為起始原料，制備牛布魯氏菌VirB12抗原蛋白具體操作按下列步驟進行a、根據(jù)布魯氏菌A19的VirB12基因設計引物，VirB12基因的一對特異性引物為VirB12F 5 ' -CATATGCGCACATTGGTTATGGTC-3 '含 NdeI 酶切位點；VirB12R 5' -GTCGACTTACTTGCGTAAAATTTC-3'含 Sal I 酶切位點；b、從牛種布魯氏菌A19株提取細菌總DNA，以細菌總DNA為模板，將步驟a中設計 的VirB12基因引物進行聚合酶鏈反應，獲得VirB12蛋白基因；C、將步驟b中獲得VirB12蛋白基因轉入原核表達載體pET_28a (+)中，獲得重組表達載體；d、將步驟c中重組表達載體導入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)中，搖菌至0D_=0. 5，以IPTG終濃度0. 2mg/mL溫度37°C誘導表達4h，收集菌體制備VirB12抗原蛋白即可。所述布魯氏菌病A19分子標記疫苗的免疫學鑒別中，步驟d中所述的制備VirB12蛋白能被非免疫布魯氏菌陽性牛血清所識別。所述布魯氏菌病A19分子標記疫苗免疫學鑒別的方法，該方法以VirB12標記蛋白作抗原包被酶標板，以健康非免疫牛血清為陰性對照，自然感染的布病陽性牛血清為陽性對照，以辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG為二抗，建立了鑒別布魯氏菌病A19-AVirB12疫苗免疫動物與臨床患病動物的間接酶聯(lián)免疫吸附實驗方法，區(qū)分A19-AVirB12疫苗免疫抗體與自然感染抗體。本發(fā)明所述的一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別，提供了以牛為試驗靶動物，確定了牛種布魯氏菌2308強毒株感染牛的最小感染劑量。本發(fā)明所述的一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別，以牛為試驗靶動物，牛種布魯氏菌2308強毒株作為牛布魯氏菌病感染病原，以此評價了牛布魯氏菌病A19- A VirB12標記疫苗對布魯氏菌病的免疫保護力。本發(fā)明所述的一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別，應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增出VirB12基因，經(jīng)克隆、亞克隆連接到原核表達載體pET-28a(+)上，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5，用IPTG誘導表達，結果溫度37°C誘導4h時，用SDS-PAGE分析，高效表達出帶有His-tag標簽的融合蛋白VirB12蛋白，經(jīng)8M尿素變性，組氨酸結合樹脂柱純化，復性得到純化的VirB12蛋白。Western-blot鑒定純化的VirB12蛋白具有免疫活性。本發(fā)明所述的一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別，以VirB12標記蛋白作抗原包被酶標板，以健康非免疫牛血清為陰性對照，自然感染的布病陽性牛血清為陽性對照，以辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG為二抗，建立了鑒別布魯氏菌病A19-A VirB12標記疫苗免疫動物與臨床患病動物的間接酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測方法。


圖I為本發(fā)明A19_AVirB12免疫?？贵w消長規(guī)律曲線2為本發(fā)明A19_AVirB12免疫保護牛的病理組織切片3為本發(fā)明重組質粒經(jīng)IPTG誘導表達的SDS-PAGE分析4為本發(fā)明VirB12重組蛋白的Western Blot檢測5為本發(fā)明的iELISA法鑒別布魯氏菌A19_AVirB12免疫抗體與野毒株感染抗體的檢測圖
具體實施方式

下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明，下述實施例中方法與材料，如無特殊說明，均為常規(guī)方法與常用試劑。實施例I布魯氏菌病A19分子標記疫苗的應用及其免疫保護力材料菌株A19_ A VirB12標記疫苗由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所布病室研制和保存，布魯氏菌2308株購自中國獸藥監(jiān)察所，A19疫苗購自新疆天康畜牧生物技術股份有限公司；頭驗動物25頭6_8月齡新疆土牛，購自新疆米泉地區(qū)活牛父易市場，經(jīng)布魯氏囷病檢測均為陰性；布魯氏菌2308株攻毒劑量的確定25頭的新疆本地牛，隨機分為5組，每組5頭牛，其中，1-4組分別用布魯氏菌2308標準菌攻毒，眼瞼接種的攻毒劑量分別為1X106CFU、I X IO7CFU, I X IO8CFU, I X IO9CFU,第5組為空白對照組，應用0. OlMPBS液皮下注射，45天后于動物生物安全三級實驗室屠宰攻毒牛，取脾臟分離布魯氏菌并計數(shù)，計算每組脾臟的克脾菌數(shù)見表I :表I布魯氏菌2308株不同攻毒劑量的牛脾臟載菌量
實驗組~ Tm2 3 Tm ~空白對照組~
2308菌液
IX IO6CFU IX IO7CFU IX IO8CFU IX IO9CFUPBS 液
攻毒劑量 克脾菌數(shù)
未分到菌98190648未分到菌
(CFU/g)實驗數(shù)據(jù)表明隨著接種劑量的增加，平均克脾菌數(shù)呈上升的趨勢。因此，根據(jù)牛脾臟分到的克脾菌數(shù)的量確定2308標準菌對牛的攻毒劑量為5X 107CFU。A19-A VirB12標記疫苗免疫保護力的評價動物分組10頭8月齡的新疆本地牛，隨機分為2組，每組5頭牛，即免疫A19-AVirB12疫苗組，對照組。牛免疫實驗采用頸部皮下注射A19_AVirB12疫苗，免疫劑量為500億CFU活菌，對照組注射0. OlMPBS液I. 0ml，每周采血并應用試管凝集試驗檢測抗體效價，檢測結果表明布魯氏菌A19-AVirB12疫苗刺激牛機體產生特異的抗體，且抗體效價自第I周開始增長，第三周到第四周達到最高峰，第四周至第五周后抗體滴度逐漸降低，但一直維持I 200-1 400左右的抗體滴度，在第六周后抗體滴度迅速下降至I : 50-1 100。以SAT檢測的抗體滴度為縱坐標，采樣時間(周)為橫坐標，A19-A VirB12免疫?？贵w消長規(guī)律曲線圖見圖I。免疫牛的攻毒實驗免疫45天后，將實驗牛全部移至新疆天康畜牧生物技術股份有限公司動物生物安全三級實驗室內隔離飼養(yǎng)，2天后將10頭牛采用眼瞼接種布魯氏菌2308株攻毒，劑量為5X107CFU。攻毒后45天剖檢牛，取脾臟分離布魯氏菌。牛脾臟細菌的分離屠宰牛后無菌取脾臟，加TSB液體研磨脾臟，研磨脾臟液體接種于TSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，A19- A VirB12組的5頭牛中有I頭牛的脾臟分離到布魯氏菌，對照組5頭牛的脾臟均分離到布魯氏菌。實驗數(shù)據(jù)表明，A19-A VirB12疫苗對牛布魯氏菌病具有好的免疫保護力，免疫保護率達80%。
牛組織病理變化切片將屠宰的牛取心、肝、脾、肺、腎及淋巴結組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，組織脫水、透明、浸蠟和包埋，常規(guī)方法制備石蠟切片。HE染色，鏡檢，觀察牛組織的病理變化。病理組織學觀察，免疫組攻毒后牛的淋巴結中有輕微纖維組織增生；脾小梁稍有延伸；肝細胞間質間有淤血，而心臟、腎臟、肺組織中未見明顯病理變化。對照組攻毒后牛的淋巴結中有纖維組織增生，且淋巴結結構被破壞；脾小梁明顯增生，增多、并伴有延伸和增寬現(xiàn)象；肝細胞部分區(qū)域有炎細胞浸潤。與對照組攻毒后牛的組織變化相比較，A19-AVirB12疫苗免疫攻毒后牛組織無明顯病理損傷，該疫苗對牛布魯氏菌病有好的免疫保護力，結果見圖2。圖2中，A為免疫攻毒組牛的淋巴結；B為對照攻毒組牛的淋巴結；C為免疫攻毒組牛的脾臟；D為對照攻毒組牛的脾臟；E為免疫攻毒組牛的肝臟；F為對照攻毒組牛的肝臟。實施例2布魯氏菌病A19分子標記疫苗的免疫學鑒別制備VirB12抗原蛋白菌株及載體:A19分子標記疫苗由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所布病室研制；布魯氏菌2308株購自中國獸藥監(jiān)察所，克隆pGEM-T載體為商品化試劑，購自Promega公司；原核表達載體pET_28a(+)由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所保存；試劑限制性內切酶購自Fermentas公司；質粒DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自Promega公司；T4DNA連接酶、DNA Marker,DH5 a為北京鼎國生物公司產品。酶標二抗為兔抗牛IgG辣根過氧化物酶(美國，Bethyl公司);蛋白純化的His_trap柱為美國GE公司產品；序列測定由上海Invitrogen貿易有限公司完成；VirB12基因表達載體的構建從牛種布魯氏菌A19株提取細菌總DNA，以該總DNA為模板，根據(jù)布魯氏菌A19的VirB12基因序列設計引物，VirB12F 5 ' -CATATGCGCACATTGGTTATGGTC-3 '含 Nde I 酶切位點；VirB12R 5' -GTCGACTTACTTGCGTAAAATTTC-3'含 Sal I 酶切位點；PCR 擴增 VirB12 基因片段，見序列I。將VirB12基因克隆至pGEM-T載體中，S卩pV12，將該克隆質粒送至上海Invitrogen貿易有限公司測序，序列結果與目的VirB12基因序列一致，應用限制性內切酶Nde I和SalI雙酶切原核表達載體pET-28a(+)和pV12，將pET-28a(+)與VirB12基因片段連接、轉化DH5 a，得到 VirB12 基因表達載體 pET28a_VirB12 ；序列I 為布魯氏菌 VirB12 基因 DNA 序列 ATGCGCACAITGGTTATGGTCGCATGCGCTGTCTCTCTGGCCGCTTGTTCCAGCCCGCCGAAGCCGCCCACAGTCAGCGGACGCCACCGCATTCCGATAAACAGCCCGGCGGCACAAGAGGAACTGCGCTTGCAGGTTTTCCCGCAAGAACCCACCGCGCAAGCAACCATGTGGCCAGCACGACCGCCCAAACAAACAGTCAACGTGTATTTTCCCCAGGATGTGACGGTATTCCGGCCAACATCCGCACAGATAAACCAACTCCACACACTGCTCTGGCCCGTGCCCAAGCATATCAACGTCAGGGGCCTGACGGACAACAACTGCCCTCCTCCCGGTGATACGCAAGTCGCGCGTGTCCGTGCGCTGGCTATCTATAATTGGCTGATCAATCAAGGCGTACCCGCCAGCAGGATCACCATAAGCTATGCCCCGGTAAAAGATTACGCATCAAATGCCCCCCTTTCACCGGGCCGCGTCCTGAACAGGCGCGTGGATATCGAAATTTTACGCAAGTAAVirB12重組蛋白的表達將鑒定為陽性的pET28a_VirB12轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單克隆接入含卡那霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，溫度37°C培養(yǎng)至OD600 = 0 . 5，加入終濃度為0. 2mg/mL的IPTG誘導4h，收集菌體，SDS-PAGE檢測結果表明VirB12蛋白的表達在菌液沉淀中，VirB12蛋白序列見序列2。
序列2為布魯氏菌VirB12蛋白序列MRTLVMVACAVSLAACSSPPKPPTVSGRHRIPINSPAAQEELRLQVFPQEPTAQATMWPARPPKQTVNVYFPQDVTVFRPTSAQINQLHTLLWPVPKHINVRGLTDNNCPPP⑶TQVARVRALAIYNWLINQGVPASRITISYAPVKDYASNAPLSPGRVLNRRVDIEILRKVirB12重組蛋白的純化及復性先將組氨酸結合樹脂柱(His_trap柱)平衡，將菌體超聲破碎后的沉淀用含有8M尿素的結合緩沖液重懸后上柱，然后用5倍柱體積的結合緩沖液進行洗滌；用洗脫緩沖液洗脫VirB12蛋白，收集洗脫液裝入透析袋中，依次在溫度4°C下經(jīng)梯度6mol/L尿素、4mol/L尿素、2mol/L尿素、lmol/L尿素、0. Olmol/LPBS中分別透析12h，緩慢復性，收集透析的復性蛋白于_70°C冰箱保存。結果見重組質粒經(jīng)IPTG誘導表達的SDS-PAGE分析(圖3)，其中圖3中，M為低分子量蛋白Marker ；1為未誘導的pET-28a-virB12大腸桿菌液；2為誘導的pET28a_virB12大腸桿菌液；3_4為純化的virB12蛋白；VirB12重組蛋白的免疫活性鑒定將復性后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉、洗滌，然后將膜在室溫下浸泡于布魯氏菌陽性血清中l(wèi)h，應用磷酸鹽緩沖液洗膜后加入兔抗牛的二抗，室溫孵育lh，4-氯-I-萘酚顯色至條帶清晰，蒸餾水沖洗終止反應。以純化的VirB12蛋白為抗原，分別以A19疫苗免疫牛血清、A19- A VirB12免疫牛血清、非免疫布病陰性牛血清、自然感染布病陽性牛血清為抗體，Western-blot實驗結果表明，VirB12蛋白具有免疫活性，鑒定結果見圖4，其中圖4中，M為低分子量蛋白Marker ;I為A19-A VirB12免疫；2為陰性對照；3為A19免疫；4為陽性對照。實施例3A19- A VirB12疫苗抗體與野毒株抗體的iELISA鑒別實驗材料及設備丹麥NUNC酶標96孔反應板，兔抗牛IgG辣根過氧化物酶(美國，Bethyl 公司)，酶標儀(Bio-Rad 680)，微量移液器(10-1000 u L)。試劑及溶液配方酶標板預處理液(PBSTlO):lXPBS(pH7. 4) lOOOmL，Tween205mL。包被稀釋液(0. 05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH 9. 6) =Na2CO3L 5g，NaHC032. 9g, Na2N3O. 2g，加去離子水至 1000ml，調至 pH = 9. 6。洗滌液(PBST,pH 7. 4) NaCl 8. Og, KH2PO4O. 2g, NaHPO4 12H20 2. 9g, KCl 0. 2g,Tween200. 5ml,加去離子水至 1000ml,調至 pH 7. 4。樣本稀釋液lXPBS1000mL，Tween205mL，(pH10.8)。酶標二抗兔抗牛IgG辣根過氧化物酶。底物顯色液1ml檸檬酸液加入20 ii L TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺)溶液和I. 2u L H2O2, TMB 水溶液 15mg/ml ;檸檬酸為 0. lmol/L pH 4. O。終止液2mol/L H2SO4 溶液。iELISA法鑒別A19- A VirB12疫苗抗體與野毒株抗體的操作步驟酶標板預處理酶標板各孔中加滿酶標板預處理液，溫度37°C孵育0. 5h。
洗滌棄去板內處理液，用去離子水洗滌5遍。包被用包被緩沖液稀釋純化VirB12蛋白抗原，每孔加入IOOii L(含蛋白25 ii g/孔)，溫度37°C孵育2h。洗滌棄去板內包被液，用PBST洗滌3遍。加樣設置陽性和陰性對照血清孔，分別加入陽性和陰性血清5 y L，然后每孔加入樣品稀釋液95 y L，其余檢測孔加入待檢牛血清樣本5 y L，溫度37°C靜置lh。洗滌棄去板內樣品稀釋液，用PBST洗滌3遍。加酶標二抗將酶標二抗I : 5000倍稀釋，每孔加入100 U L，室溫靜置2min。洗滌棄去板內酶標二抗，用PBST洗滌4遍。加底物顯色液每孔加入現(xiàn)配制的底物顯色液IOOy L，室溫反應，觀察陽性對照孔產生明顯顏色變化。終止反應于各反應孔中加入2mol/L硫酸50 U L。結果判定將酶標板置于酶標檢測儀上，于450nm處測OD值，待檢血清OD45tl值計為P值，以非免疫的健康牛血清為陰性對照血清OD■值計為N值，若P/N彡2即判定為陽性(即牛感染布魯氏菌病)。iELISA檢測方法應用以自然感染布魯氏菌的牛血清為陽性對照，以非免疫的健康牛血清為陰性對照，布病陽性牛血清20份，免疫A19- A VirB12疫苗牛血清20份，按照上述iELISA方法操作步驟進行檢測(表2)，檢測結果如表3。表2樣品檢測序列
陽性血清免疫I 免疫9 免疫17野毒I 野毒9 野毒17 陽性血清免疫2 免疫10 免疫18 野毒2 野毒10 野毒18 陰性血清免疫3 免疫11 免疫19野毒3 野毒11 野毒19 陰性血清免疫4 免疫12 免疫20 野毒4 野毒12 野毒20 空白對照免疫5 免疫13 /野毒5 野毒13 /
空白對照免疫6 免疫14 /野毒6 野毒14 /
權利要求
1.一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗的應用,其特征在于以500億CFU的牛布魯氏菌病A19- A VirB12疫苗活菌皮下注射免疫4_6月齡犢牛。
2.一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗的免疫學鑒別，其特征在于以布魯氏菌病A19疫苗為起始原料，制備牛布魯氏菌VirB12抗原蛋白具體操作按下列步驟進行 a、根據(jù)布魯氏菌A19的VirB12基因設計引物，VirB12基因的一對特異性引物為 VirB12F 5 ' -CATATGCGCACATTGGTTATGGTC-3 '含 Nde I 酶切位點；VirB12R .5' -GTCGACTTACTTGCGTAAAATTTC-3'含 Sal I 酶切位點； b、從牛種布魯氏菌A19株提取細菌總DNA，以細菌總DNA為模板，將步驟a中設計的VirB12基因引物進行聚合酶鏈反應，獲得VirB12蛋白基因； C、將步驟b中獲得VirB12蛋白基因轉入原核表達載體pET-28a(+)中，獲得重組表達載體； d、將步驟c中重組表達載體導入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，搖菌至OD_ =0.5，以IPTG終濃度0. 2mg/mL溫度37°C誘導表達4h，收集菌體，經(jīng)組氨酸結合樹脂柱純化，制備VirB12抗原蛋白即可。
3.如權利要求2所述的布魯氏菌病A19分子標記疫苗的免疫學鑒別，其特征在于步驟d中所述的制備VirB12蛋白能被非免疫布魯氏菌陽性牛血清所識別。
4.如權利要求3所述的布魯氏菌病A19分子標記疫苗免疫學鑒別的方法，其特征在于，以VirB12標記蛋白作抗原包被酶標板，以健康非免疫牛血清為陰性對照，自然感染的布病陽性牛血清為陽性對照，以辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG為二抗，建立了鑒別布魯氏菌病A19-AVirB12疫苗免疫動物與臨床患病動物的間接酶聯(lián)免疫吸附實驗方法，區(qū)分A19- A VirB12疫苗免疫抗體與自然感染抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別，應用該布魯氏菌病疫苗后可提供間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)方法區(qū)分該疫苗接種的動物與野毒感染動物。本發(fā)明以牛為防疫布魯氏菌病的實驗靶動物，應用布魯氏菌病A19-ΔVirB12標記疫苗免疫牛，評價該分子標記苗的免疫保護力。建立了區(qū)分布魯氏菌病A19-ΔVirB12免疫動物與野毒感染動物的iELISA方法。本發(fā)明提供的布魯氏菌病A19-ΔVirB12標記疫苗不僅對牛布魯氏菌病具有較好免疫保護力，而且發(fā)明的iELISA方法解決了免疫動物與臨床患病動物難以鑒別的問題，對牛布魯氏菌病的防控、根除和凈化具有實際應用價值。
文檔編號C12R1/19GK102772794SQ201210190050
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權日2012年6月11日
發(fā)明者劉麗婭, 葉鋒, 吐爾洪·努爾, 吳冬玲, 姚剛, 易新萍, 李延濤, 王力儉, 范偉興, 谷文喜, 鐘旗, 馬曉菁 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院獸醫(yī)研究所