專利名稱：禽肺病毒通用型rt-pcr檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽類病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一對(duì)禽肺病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)又名火雞鼻氣管炎病毒(Turkey Rhinotracheitis Virus, TRTV),屬于副粘病毒科肺病毒亞科肺病毒屬，為單鏈負(fù)股RNA病毒,可引起火雞和一些其他禽類上呼吸道疾病。APV基因組包含了 8個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因，基因組全長(zhǎng)約為13.4 kb，8個(gè)基因從3’端到5’端排列順序?yàn)?N-P-M-F-M2-SH-G-L。最初人們認(rèn)為APV只有一個(gè)血清型，兩個(gè)基因亞型(A和B)，通過(guò)核苷酸序列分析和單克隆抗體分析可以有效將兩個(gè)基因型區(qū)分開。上世紀(jì)90年代末，分別在美國(guó)和法國(guó)出現(xiàn)了兩種不同的新型的APV毒株(C型和D型)，改變了之前的看法，人們由此認(rèn)為APV至少存在四個(gè)以上基因型或者多個(gè)血清型的毒株。RT-PCR已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于APV的病原檢測(cè)中，設(shè)計(jì)區(qū)別不同亞型APV的RT-PCR比設(shè)計(jì)通用型RT-PCR簡(jiǎn)單得多。但將亞型特異性RT-PCR作為首選的檢測(cè)技術(shù)會(huì)導(dǎo)致當(dāng)有新型APV存在的時(shí)候常常被忽略掉，不利于對(duì)APV感染進(jìn)行有效地檢測(cè)，D型APV就是在法國(guó)存在超過(guò)15年后才被認(rèn)識(shí)到的。現(xiàn)有的用于APV檢測(cè)引物只能檢測(cè)出其中的某一種亞型，為了便于全面檢測(cè)該病毒，急需一種通用型的RT-PCR檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種禽肺病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物。本發(fā)明的另一目的是提供一種禽肺病毒RT-PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
禽肺病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示?；谏鲜鲈O(shè)計(jì)的引物，本發(fā)明還保護(hù)一種禽肺病毒檢測(cè)方法，是用上述SEQ IDNO: Γ2所示引物和待檢樣品RNA進(jìn)行RT-PCR，如果PCR產(chǎn)物片段大小為319bp或320bp，則待檢樣品中有禽肺病毒。可以使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，如果電泳結(jié)果在319bp或320bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，即表明待檢樣品中有禽肺病毒。上述禽肺病毒檢測(cè)方法中，RT-PCR的反應(yīng)體系含有一步法PCR混合酶(PrimeScipt I Step Enzyme Mix)、緩沖液(2X1 Step Buffer)>SEQ ID NO: I 2所不引物、樣品RNA和無(wú)RNA酶的水(RNase Free H20)。上述禽肺病毒檢測(cè)方法中，RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)?br> (1)50°C30min ；
(2)預(yù)變性95°C4min ；
(3)變性94°C30sec ;退火55 58°C 20sec ;延伸72°C I min ;共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；
(4)延伸72°CIOmin0
上述RT-PCR反應(yīng)程序的步驟(3)中退火溫度最佳為57°C。上述禽肺病毒檢測(cè)方法，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列為SEQ ID NO: 3飛中的任意一條時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中有禽肺病毒。該檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)APV病毒的多種亞型，至少包括A、
B、C、D四個(gè)目前已知的亞型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的引物特異性高、且片段小、敏感性高，整個(gè)PCR過(guò)程可以在2h內(nèi)完成，能夠特異地檢測(cè)出各亞型APV的存在，可以大大減小對(duì)APV感染錯(cuò)漏診斷。


圖I. APV各亞型病毒檢測(cè)電泳結(jié)果，其中M:DNA Marker DL2000 ;1、空白對(duì)照；2、A 型 APV ;3、B 型 APV ;4、C 型 APV。圖2. APV各亞型病毒RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，其中TN-A為A亞型，TN-B為B亞型，TN-C為C亞型，TN-D為D亞型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
1、試驗(yàn)材料
1.1主要試劑與儀器
AxyPrep 體液病毒 DNA/RNA 小量試劑盒(Cat No. AP-MN-BF-VNA-250), TaKaRaPrimeScript One step RT-PCR Kit Ver. 2 (TaKaRa Code:DRRO55A), Thermo 高速低溫離心機(jī)，Thermo PCR 儀。I. 2 毒株
A、B型APV弱毒株購(gòu)自海博萊生物有限公司，C型APV弱毒株購(gòu)自梅里亞生物有限公司，作為待檢樣品。I. 3引物設(shè)計(jì)
首先對(duì)比APV A、B、C、D基因組N基因序列上共同的保守區(qū)域，然后設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增目的帶為319bp或者320 bp的引物TNOI。表I
權(quán)利要求
1.禽肺病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物，其特征在于核苷酸序列如SEQID N0:l 2所示。
2.ー種禽肺病毒檢測(cè)方法，其特征在于用權(quán)利要求I所述禽肺病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物和待檢樣品RNA進(jìn)行RT-PCR，如果PCR產(chǎn)物片段大小為319bp或320bp，則待檢樣品中有禽肺病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述禽肺病毒檢測(cè)方法，其特征在于RT-PCR的反應(yīng)體系含有ー步法PCR混合酶、緩沖液、SEQ ID NO: Γ2所示引物、樣品RNA和無(wú)RNA酶的水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述禽肺病毒檢測(cè)方法，其特征在于RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)?1)50。。30min； (2)預(yù)變性95°C 4min ；(3)變性94°C30sec ;退火55 58°C 20sec ;延伸72°C I min ;共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)； (4)延伸72°CIOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述禽肺病毒檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)退火溫度為57°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述禽肺病毒檢測(cè)方法，其特征在于RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列為SEQIDNO: 3^6中的任意一條時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中有禽肺病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了禽肺病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，屬于禽類病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該通用型RT-PCR檢測(cè)引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示，檢測(cè)方法是用禽肺病毒通用型RT-PCR檢測(cè)引物和待檢樣品RNA進(jìn)行RT-PCR，如果PCR產(chǎn)物片段大小為319bp或320bp，則待檢樣品中有禽肺病毒。本發(fā)明的引物特異性高、且片段小、敏感性高，整個(gè)PCR過(guò)程可以在2h內(nèi)完成，能夠特異地檢測(cè)出各亞型APV的存在，可以大大減小對(duì)APV感染錯(cuò)漏診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676701SQ20121019044
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者劉闖, 孫石開, 宋永峰, 張祥斌, 覃健萍, 鄺春明, 陳 峰, 魯俊鵬 申請(qǐng)人:廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司