專利名稱：一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒及其應用的制作方法
ー種快速檢測端粒酶活性的試劑盒及其應用
背景技術：
端粒(Telomere)是一段DNA重復序列，位于染色體末端，可以保持染色體的完整性。1990年，Harley等證實端粒的長度可以隨著細胞分裂次數(shù)的增多而逐漸變短。這ー發(fā)現(xiàn)在端粒和細胞衰老之間建立了緊密的聯(lián)系。端粒重復序列的長度可能起著ー種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細胞的壽命明顯不同,其端粒的長度也不相同。是隨著年齡的增長而縮短。來自新生兒的體細胞可在體外傳代培養(yǎng)80—90代，來自70歲老人的體細胞在體外只能傳代培養(yǎng)20 30代，而且端粒的重復序列長度也縮短很多。端粒酶(Telomerase)是細胞中負責端粒延長的ー種酶,是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA加至真核細胞染色體末端。端粒在不同物種細胞中對于保持染色體穩(wěn)定性和細胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒(縮短的端粒其細胞復制能力受限)，從而增強體外細胞的増殖能力。 但是，在正常人體細胞中，端粒酶的活性受到相當嚴密的調(diào)控。實驗證明，體細胞里沒有端粒酶的活性，所以體細胞每分裂一次，端粒也就縮短ー些。隨著細胞不斷地進行分裂，端粒的長度將越來越短，當達到ー個臨界長度吋，細胞染色體會失去穩(wěn)定性，使細胞不能再進行分裂而進入凋亡(apoptosis)。端粒的長度決定了細胞的壽命，因此可用丟失的端粒重復序列的長度來推測細胞有絲分裂的次數(shù)，所以端粒被稱為分子鐘或有絲分裂鐘(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色體穩(wěn)定性,細胞的衰老和死亡外,還與腫瘤的發(fā)生密切相關。在人體內(nèi)的各種細胞中，生殖細胞和干細胞染色體的末端比體細胞染色體的末端長出幾千個堿基對，并且在這兩類細胞里能檢測到端粒酶的活性。除此之外，其他所有體細胞里都未測得端粒酶的活性。惟一的例外是來源于體細胞的惡性腫瘤細胞卻又重新出現(xiàn)了端粒酶活性，發(fā)揮其合成端粒重復序列的功能，以補償正常的端粒序列丟失，使端粒的重復序列不會達到導致細胞死亡的臨界長度，從而獲得細胞的“永生性”(immortality)。這樣，惡性腫瘤細胞在體內(nèi)或體外都能無限制地分裂増殖。目前，檢測端粒酶活性最常用的方法是基于PCR反應的端粒重復序列擴增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)。以人類細胞為例，這種方法使用 PCR反應擴增由端粒酶通過特定引物延長的6堿基重復序列(TTAGGG)，使該重復序列的量達到能被檢測到的程度，從而間接的測定端粒酶的活性。雖然這種方法被廣泛應用，但是該方法仍然有其不可忽視的缺點步驟相對復雜，耗時長，容易得到假陽性或假陰性結果等。基于以上原因，最近ー些無需通過PCR反應擴增端粒重復序列而達到擴增檢測信號目的的方法被開發(fā)出來，包括使用多價過核苷酸，納米金顆粒，具有催化功能的分子信標等。但是這些技術都沒有得到廣泛的應用，可能的原因是這些技術的步驟仍然很復雜，與原來的TRAP方法比較，并不具備很大的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本專利涉及一種基于核酸外切酶III (exonuclease III)可以逐步移除雙鏈DNA 3’平末端或3’縮進末端單個核苷酸的特性，測量樣品細胞內(nèi)端粒酶活性的方法。ー種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于包括盒體，4個試劑管；所述的試劑管分別裝有延伸反應混合物，標記的分子信標序列，ExoIII, Ix NEB Buffer I。所述的反應混和物成分為20mM Tris-HCl, pH 8. 3 ；1. 5 mM MgCl2 ；63 mM KCl ；O. 05% Tween 20 (w/v) ；1 mM EGTA ; 10 μ M dATP ；10 μ M dGTP ；10 μ M dCTP ； 10 μ M dUTP ；300 ηΜ延伸反應引物；0. I mg/ml BSA ;其中所述的延伸反應引物序列為5’_AAT CCG TCGAGC AGA GTT-3’ ；所述的標記的分子信標序列為5’ -(熒光基團)GGT TAC TAA CCCTAA CCC TAA CCC T-(淬滅基團)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜體字母代表鎖核酸LNA。所述的熒光基團包括5’6-FAM、5’ TET、5’ HEX、5’ TAMRA、5’ CY5、中間6-FAM-dT、3，6-FAM、3，TAMRA、中間 TAMRA_dT、5，R0X、3，R0X、5，Texas Red、5，Cy3、中間 Cy3、3，Cy3、3，Cy5、5，Cy5、5，Cy5. 5、5，AMCA、3，AMCA、5，J0E、3，JOE,Alexa Fluor 488、5’ Methylene Blue、3’ Methylene Blue、FR610 ;所述的淬滅基團包括3’ BHQ _1、3’ BHQ _2、3， Dabcyl、5， Dabcyl、3， Eclipse。ー種快速檢測端粒酶活性的試劑盒的應用，其特征在于按步驟實現(xiàn)
A.從細胞中提取含端粒酶的樣品；
B.在2μ L含端粒酶樣品中分別加入48 μ L延伸反應混合物，30°C孵育I h，獲得延伸產(chǎn)物；其中所述的延伸反應引物序列為5’ -AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’ ；
C.將上述延伸產(chǎn)物，分別添加含IxNEB Buffer 1,100 U ExoIII, 2 μ M標記的分子信標序列，將反應混合物置于37 0C 2 h后，使用可見光分光光度計讀取結果；其中所述的標記的分子信標序列為5’_ (熒光基團)GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬滅基團)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜體字母代表鎖核酸LNA。原理說明
I、分子信標(MBs)與靶序列結合，產(chǎn)生檢測信號的原理(圖I)
MBs是ー種可特異識別核酸序列的發(fā)夾型莖環(huán)雙標記寡核苷酸熒光探針，具有高特異性、高敏感性、操作簡便、可用于定量分析等優(yōu)點。兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。在復性溫度下，因為模板存在時形成莖環(huán)結構雙鏈解開，并與模板序列配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開，熒光基團被激發(fā)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子，從而可被檢測器檢測到。2、通過exonuclease III (ExoIII)移除3’端單個核苷酸,達到突光信號不斷再生、增強的原理(圖2):
ExoIII具有從雙鏈DNA的3' -OH末端降解生成5’ -單核苷酸的外切酶活性。該酶對雙鏈DNA具有高度特異性，能降解平滑末端、3'縮進末端及有切ロ的DNA，但是不能降解3'-突出末端。利用ExoIII的特性，在與端粒酶延伸產(chǎn)物雜交并激活熒光基團后，MBs 3’端核苷酸被反應體系中的ExoIII逐步移除，最終使得被降解的MBs與靶序列分離，這使得靶序列能夠重新與完整的MBs雜交，并激活其熒光基團。這種靶序列與MBs雜交-激活熒光基團-ExoIII降解MBs-靶序列與MBs分離的步驟不斷循環(huán)，從而解決了靶序列與MBs只能以I :1的比例結合的局限性，使得熒光信號被極大的增強，直至能被檢測器檢測到。有益效果
I、本發(fā)明通過設計特異性引物，能夠?qū)崿F(xiàn)端粒酶的提取。2、端粒酶是已知的惡性腫瘤特異性最強的生物標志物，其酶活性在腫瘤的早期診斷和預后評估中均具有很大的潛在價值。同時，在生殖細胞和造血干細胞等非腫瘤細胞中，也能檢測出端粒酶活性，因而單憑端粒酶活性的有無難以區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞。所以端粒酶活性的定量分析是癌癥診斷和預防中重要的手段。本專利涉及的基于ExoIII 3’-5’外切酶活性的端粒酶檢測方法，有步驟簡單，耗時短，準確性高，成本低等特點，具有非常大的大規(guī)模及商業(yè)化應用潛力。3、本發(fā)明的核心是利用核酸外切酶III (exoneclease III)可以逐步移除雙鏈DNA 3’端的單個核苷酸，而對單鏈DNA無活性的特性，使得與端粒酶延伸序列特異結合的 分子信標(molec μ Lar beacons,MBs)不斷被激活-移除,然后新的MBs重新與目標序列結合-激活-移除，從而使MBs信號(熒光，顯色反應等)被不斷的擴增，達到能被檢測到的程度。檢測信號的強度直接反映了端粒酶延伸產(chǎn)物的多少，從而間接反映了細胞內(nèi)端粒酶活性的強弱。該技術步驟簡單，耗時短，并且避免了 PCR反應帶來的可能的假陽性或假陰性結果。另外，該技術
4、本試劑盒所需的儀器耗材價格低廉，具有用于大規(guī)模檢測端粒酶活性的商業(yè)化潛力。


圖I.應用MBs對靶序列進行定量分析的原理。在無靶序列的情況下，MBs呈發(fā)夾型結構，其熒光基團在淬滅基團的作用下，不發(fā)射熒光；在與靶序列雜交后，MBs的熒光基團與淬滅基團分離，產(chǎn)生能夠被檢測到的熒光信號。圖2.應用ExoIII的特性檢測端粒酶活性的原理。I. MBs與靶序列，即端粒酶延伸產(chǎn)物雜交，產(chǎn)生熒光信號，并在其3’ -OH端形成3’縮進末端，從而成為ExoIII外切酶活性的底物；2.在ExoIII逐步移除MBs 3’ -OH端的寡核苷酸后，MBs與延伸產(chǎn)物分離；分離后的延伸產(chǎn)物可以重新與完整的MBs結合，并重復之前的步驟，使得熒光信號得到增強。圖3. HeLa細胞端粒酶活性。從約8000個HeLa細胞中提取的樣品中端粒酶活性所對應的熒光強度比空白對照(Lysis buffer)或滅活后的HeLa細胞樣品對應的熒光信號強 40% 左右(P < 0.05)。圖4.不同細胞中端粒酶活性檢測結果。與空白對照(Lysis buffer)或已知無端粒酶活性的WI-38細胞所的信號強度相比，HeLa細胞或HeLa+WI_38細胞樣品中信號強度顯著增強(P〈0.05)。圖5.使用傳統(tǒng)TRAP法檢測端粒酶活性結果。其中A為1-3泳道電泳，B為4_5電泳圖；在空白對照(Lysis buffer)、滅活HeLa細胞及無端粒酶活性的WI-38細胞中(泳道2、3、5)，沒有觀察到端粒酶延伸反應產(chǎn)生的端粒重復序列片段條帯，而在已知有端粒酶活性的HeLa細胞或HeLa+WI_38細胞樣品中(泳道I、4),可以觀察到間接反應端粒酶活性的端粒重復片段條帶。圖6為本發(fā)明示意圖，其中5為盒體，1-4分別為第一至第四試劑管。
具體實施例方式ExoIII 和 NEB Buffer I 購自 New England Biolabs 公司，所有突光集団/淬滅集團標記的MBs (LNA-DNA)及寡核苷酸引物由生エ生物工程(上海)公司合成，由HPLC純化，并由質(zhì)譜測序。其中熒光基團為CAL Fluor Red 610 (FR610)，淬滅基團為black holequencher (BHQ)0用于檢測端粒酶活性的LNA-DNA嵌合體MB序列為5’- (FR610)
GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T- (BHQ) -AA CCC TAA CCT TT-3’(斜體字母代表鎖核酸LNA);端粒酶延伸反應引物為5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’。腫瘤細胞(HeLa細胞株，購自ATCC)和人胚肺二倍體成纖維細胞(WI-38細胞株，購自ATCC)培養(yǎng)條件參照ATCC提供的培養(yǎng)方法。實施例I.
ー種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于包括盒體5，4個試劑管；其中第一試劑管I裝有延伸反應混合物，第二試劑管2裝有標記的分子信標序列，第三試劑管3裝有ExoIII，第四試劑管4裝有Ix NEB Buffer I。ー種快速檢測端粒酶活性的試劑盒的應用，按如下步驟實現(xiàn)
一、細胞樣品中端粒酶的提取
分別收集腫瘤細胞(HeLa細胞株，購自ATCC)和人胚肺二倍體成纖維細胞(WI-38細胞株，購自ATCC)，離心后將細胞按200 yL/106細胞的比例重新懸浮于裂解液(lx CHAPSLysis buffer, ATCC)中，冰上靜置30 min ;之后于12000 g,4°C離心20 min ;收集上清于_80°C保存，獲得兩種含端粒酶上清，即HeLa細胞端粒酶上清和WI-38細胞端粒酶上清。ニ、端粒酶延伸反應
在2 UL (含總蛋白約5μ g/μ L)的兩種含端粒酶待測上清祥品中分別加入48 UL延伸反應混合物，30°C孵育I h，獲得延伸產(chǎn)物，即HeLa細胞延伸產(chǎn)物和WI-38細胞延伸產(chǎn)物；
其中延伸反應混合物成分為20 mM Tris-HCl, pH 8. 3 ；1. 5 mM MgCl2 ；63 mM KCl ；O.05% Tween 20 (w/v) ；1 mM EGTA ; 10 μ M dATP ; 10 μ M dGTP ; 10 μ M dCTP ； 10 μ M dUTP ；300 ηΜ延伸反應引物，其中引物核苷酸序列為5’ -AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’ ；0. I mg/ml BSA。端粒酶活性檢測
反應體系為50 μ L，將上述延伸產(chǎn)物，分別添加含Ix NEB Buffer 1,100 U ExoIII, 2μ M標記的分子信標序列；將反應混合物置于37 0C 2 h后，使用可見光分光光度計讀取結果λ ex=590 nm JAHeLa細胞中提取的樣品中端粒酶活性所對應的熒光強度比空白對照(Lysis buffer)或滅活后(即加熱處理后滅活后)的HeLa細胞樣品對應的熒光信號強40%左右(P < 0.05)，見圖3 ；
Xem=610 nm,與空白對照(Lysis buffer)或已知無端粒酶活性的WI-38細胞所的信號強度相比，HeLa細胞或HeLa+WI-38細胞樣品中信號強度顯著增強(P < 0.05)見(圖4)。所述的分子信標序列為5，-(熒光基團)GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAACCC T-(淬滅基團)-AA CCC TAA CCT TT-3’(斜體字母代表鎖核酸LNA);其中本例中的熒光基團為FR610，淬滅基團為3’ BHQ-I。電泳使用10%的non-denaturing PAGE膠，電泳條件為400 V, I. 5 h。電泳完成后使用溴こ唳溶液染色，于紫外燈下觀察結果；在空白對照(Lysis buffer)、滅活HeLa細胞及無端粒酶活性的WI-38細胞中(泳道2、3、5)，沒有觀察到端粒酶延伸反應產(chǎn)生的端粒重復序列片段條帶，而在已知有端粒酶活性的HeLa細胞或HeLa+WI-38細胞樣品中(泳道I、4)，可以觀察到間接反應端粒酶活性的端粒重復片段條帶(圖5)
對比例TRAP assay
該萬法使用 Trapeze Telomerase Detection Kit (Millipore)0I.在特定序列的引物 TS Primer(5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’)存在的條件下，獲得端粒酶延伸反應產(chǎn)物，并使用PCR擴增該延伸反應產(chǎn)物。 端粒酶基因延伸反應及后續(xù)PCR擴增延伸反應產(chǎn)物的反應混合物成分如下
權利要求
1.一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于包括盒體和4個試劑管；其中第一試劑管裝有延伸反應混合物，第二試劑管裝有標記的分子信標序列，第三試劑管裝有 ExoIII，第四試劑管裝有Ix NEB Buffer I。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于所述的反應混和物成分為20 mM Tris-HCl,pH 8. 3 ；1. 5 mM MgCl2 ；63 mM KCl ；0. 05% Tween 20 (w/v)； I mM EGTA ; 10 μ M dATP ；10 μ M dGTP ；10 μ M dCTP ；10 μ M dUTP ；300 nM 延伸反應引物；0. I mg/ml BSA ;其中所述的延伸反應引物序列為5’ -AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’ ； 所述的標記的分子信標序列為5’ -(熒光基團)-HG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬滅基團)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜體字母代表鎖核酸LNA。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于所述的熒光基團包括5’ 6-FAM、5’ TET、5’ HEX、5’ TAMRA、5’ CY5、中間 6-FAM_dT、3’ 6_FAM、3’ TAMRA、中間 TAMRA-dT、5，R0X、3，R0X、5，Texas Red、5，Cy3、中間 Cy3、3，Cy3、3，Cy5、 5，Cy5、5，Cy5. 5、5，AMCA、3，AMCA、5，J0E、3，JOE、Alexa Fluor 488、5，Methylene Blue、 3’ Methylene Blue、FR610 ;所述的淬滅基團包括3’ BHQ _1、3，BHQ _2、3，Dabcyl、5’ Dabcyl、3’ Eclipse。
4.根據(jù)權利要求1-3任意一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒的應用，其特征在于按步驟實現(xiàn)從細胞中提取含端粒酶的樣品；在2 μ L含端粒酶樣品中分別加入48 μ L延伸反應混合物，30°C孵育I h，獲得延伸產(chǎn)物；其中所述的延伸反應引物序列為5’ -AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’ ；將上述延伸產(chǎn)物，分別添加含Ix NEB Buffer 1,100 U ExoIII, 2 μ M標記的分子信標序列，將反應混合物置于37 V 2 h后，使用可見光分光光度計讀取結果；其中所述的標記的分子信標序列為5’_ (熒光基團)-以6 GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬滅基團)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜體字母代表鎖核酸LNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于包括盒體，4個試劑管；所述的試劑管分別裝有延伸反應混合物，標記的分子信標序列，ExoIII，1xNEBBuffer1。本試劑盒所需的儀器耗材價格低廉，具有用于大規(guī)模檢測端粒酶活性的商業(yè)化潛力。
文檔編號C12Q1/68GK102690886SQ20121019071
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權日2012年6月12日
發(fā)明者全利, 葉亞東, 葉汝章, 張娟, 朱兆云, 朱文華, 滕凌, 潘鸝, 胡娟, 路易斯伊格納羅, 郝小江 申請人:云南路易斯中藥現(xiàn)代化工程技術研究中心