專利名稱：一種檢測組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的核酸適配體分子信標(biāo)探針及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的核酸適配體分子信標(biāo)探針及利用該探針進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽重組蛋白檢測的方法。
背景技術(shù)：
蛋白表達(dá)系統(tǒng)及其重組蛋白已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個學(xué)科研究，已經(jīng)成為生物學(xué)有力的研究手段和工具。然而，從原生生物資源中分離和純化重組蛋白的過程是非常復(fù)雜和耗時。為了簡化這一過程，多種蛋白質(zhì)親和標(biāo)簽，如幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和多聚組氨酸標(biāo)簽，被廣泛用于重組蛋白分離和純化。其中最常用的是在重組蛋白的N-或C-末端添加六個組氨酸殘基的組氨酸標(biāo)簽?！づc其它蛋白標(biāo)簽方法相比，組氨酸標(biāo)簽具有以下優(yōu)點(diǎn)1.分子量小，對目標(biāo)蛋白功能、結(jié)構(gòu)及活性的干擾作用較小，在后續(xù)應(yīng)用中通常不需移除；2.表達(dá)方便，商品化含組氨酸標(biāo)簽的載體可在大腸桿菌、酵母、哺乳動物、昆蟲和植物等不同表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)且純化條件溫和；3.無免疫原性，重組蛋白可以直接用來注射動物制備抗體，不影響免疫學(xué)分析；
4.在高濃度尿素或胍等變性條件下，組氨酸標(biāo)簽仍保持結(jié)合能力。因此，目前組氨酸標(biāo)簽被廣泛用于蛋白表達(dá)系統(tǒng)和蛋白質(zhì)分析。準(zhǔn)確定量組氨酸標(biāo)簽重組蛋白將有助于表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)的評估及重組蛋白的應(yīng)用。目前，檢測組氨酸標(biāo)簽蛋白的探針主要有兩類抗組氨酸標(biāo)簽抗體和金屬離子探針。但是這兩類探針在應(yīng)用上卻受到了一定限制。組氨酸標(biāo)簽抗體抗體制備昂貴，檢測時需要較長時間且缺乏準(zhǔn)確定量能力。與抗體檢測探針相比，金屬離子探針價格低廉，但同樣耗時和缺少準(zhǔn)確定量能力。最重要的是，這兩種方法都不能直接對細(xì)胞裂解物中組氨酸標(biāo)簽蛋白進(jìn)行檢測和定量分析。核酸適配體是一種通過SELEX技術(shù)篩選獲得的單鏈核酸。通過折疊成特定的空間三維結(jié)構(gòu)，核酸適配體能高親和性和高特異性的結(jié)合多種目標(biāo)物，例如金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)和細(xì)胞。另外，核酸適配體還具有制備簡單、容易修飾和保存時間長等優(yōu)點(diǎn)。因此核酸適配體被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域，如抗組氨酸標(biāo)簽核酸適配體 6H5 (5J-GGCTTCAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGT GTACG-3’)被作為一種親和探針檢測與純化組氨酸標(biāo)記蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的核酸適配體分子信標(biāo)探針及利用該探針檢測細(xì)胞裂解物中含組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的直接通用方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為
所述檢測組氨酸標(biāo)簽的核酸適配體分子信標(biāo)探針包含SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的序列；SEQ ID NO. I所示序列的3’端與SEQ ID NO. 2所示序列的5’端通過PEG36橋聯(lián)；SEQ ID NO. I所示序列5’端修飾有熒光素FAM ；SEQ ID NO. 2所示序列3’端修飾有淬滅基團(tuán)Dabcyl。當(dāng)所述探針未與組氨酸標(biāo)記蛋白結(jié)合時,整個探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在這結(jié)構(gòu)中，探針中FAM基團(tuán)的熒光信號被Dabcyl基團(tuán)猝滅。當(dāng)所述核酸適配體分子信標(biāo)探針與含組氨酸標(biāo)簽重組蛋白結(jié)合時，探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)改變，熒光基團(tuán)FAM遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)Dabcyl，使得FAM基團(tuán)的熒光信號可以被檢測到?；谏鲜龊怂徇m配體分子信標(biāo)探針檢測細(xì)胞裂解物中組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的方法，包括如下步驟
(1)制備核酸適配體分子信標(biāo)探針在ABIDNA synthersizer上合成所述的核酸適配體分子信標(biāo)探針；
(2)將待測細(xì)胞裂解物加入到含有步驟(I)所述核酸適配體分子信標(biāo)探針的緩沖溶液中，通過檢測探針熒光強(qiáng)度的變化檢測細(xì)胞裂解物中的含組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白。
當(dāng)溶液中沒有含組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白存在時，核酸適配體分子信標(biāo)探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，此時FAM基團(tuán)的熒光信號被Dabcyl基團(tuán)猝滅；當(dāng)溶液中存在可以與探針結(jié)合的組氨酸標(biāo)簽重組蛋白時，探針莖部會改變物理結(jié)構(gòu)使得熒光基團(tuán)FAM遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)Dabcyl，進(jìn)而使得熒光信號可以被檢測到。下面對本發(fā)明的探針及檢測方法作進(jìn)一步的說明
本發(fā)明的抗組氨酸標(biāo)記核酸適配體分子信標(biāo)探針，是一種可以對多種目標(biāo)進(jìn)行識別的 新型分子信標(biāo)。本發(fā)明選用6H5核酸適配體，其可以特異性識別組氨酸標(biāo)記蛋白，通過對一系列可能的6H5序列長度及短鏈cDNA的比較最終確定探針結(jié)構(gòu)如下5’ -FAM-CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG - (CH2CH20) 36-CAACCTG-Dabcyl_3，，其中，CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG (SEQ ID NO. I)為核酸適配體6H5，即，組氨酸標(biāo)簽識別序列；核酸片段cDNA CAACCTG (SEQ ID NO. 2)是與核酸適配體6H5中CAGGTTG的互補(bǔ)序列；PEG36為橋聯(lián)分子；FAM為六羧基熒光素，作為熒光報(bào)告基團(tuán)；Dabcyl作為猝滅基團(tuán)。其中核酸適配體分子信標(biāo)探針中雙鏈互補(bǔ)雜交的能力弱于核酸適配體探針與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的能力。本發(fā)明檢測細(xì)胞裂解物中組氨酸標(biāo)記蛋白的方法包括如下步驟
(1)制備核酸適配體分子信標(biāo)探針在ABIDNA synthersizer上合成所述的核酸適配體分子信標(biāo)探針；
(2)取納摩的物質(zhì)的量的核酸適配體分子信標(biāo)探針溶于微升結(jié)合緩沖溶液中，其最終濃度為25納摩。取一定量該溶液于95度加熱10分鐘后，緩慢冷卻至室溫。于室溫由 Fluorolog spectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄該探針的突光強(qiáng)度。往已淬火的探針溶液中加入待測細(xì)胞裂解物。室溫孵育一小時后，于室溫由FlUOTOlOgspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄探針溶液的突光變化。利用本發(fā)明的核酸適配體分子信標(biāo)探針檢測細(xì)胞裂解物中組氨酸標(biāo)記蛋白的原理如下
當(dāng)溶液中不存在組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)時，核酸適配體分子信標(biāo)探針的部分堿基(CAGGTTG)與cDNA (CAACCTG)雜交形成雙鏈，整個分子呈一種莖環(huán)的結(jié)構(gòu)，在這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)AM熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)Dabcyl相互靠近，因此FAM基團(tuán)的光信號被Dabcyl基團(tuán)猝滅；當(dāng)溶液中有組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)存在時，核酸適體分子信標(biāo)探針中整個核酸適體適配體序列參與結(jié)合，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被迫打開，導(dǎo)致熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)使得熒光信號恢復(fù)。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)
I、探針制備簡單，價格低廉。2、能夠快速檢測并定量分析。3、相較于抗體對蛋白質(zhì)有更好的親和能力。4、不需蛋白質(zhì)標(biāo)記，可以直接檢測細(xì)胞裂解液中組氨酸標(biāo)記蛋白。


圖I為核酸適配體分子信標(biāo)探針的示意圖；
圖2為核酸適配體分子信標(biāo)探針對P68蛋白和含組氨酸標(biāo)簽P68重組蛋白的動力學(xué)響應(yīng) 圖3為核酸適配體分子信標(biāo)探針對不同蛋白質(zhì)的熒光響應(yīng)圖；其中，F(xiàn)tl代表待檢分析物不存在時，探針的熒光強(qiáng)度^代表待檢分析物存在時，探針的熒光強(qiáng)度。其中牛血清蛋白質(zhì)(BSA*)濃度為10微摩，H6多肽濃度為8微摩，其余蛋白濃度均為200納摩；
圖4為核酸適配體分子信標(biāo)探針對不同濃度組氨標(biāo)簽P78重組蛋白熒光響應(yīng)圖。其中，自下至上濃度分別為0，6.25，13，25，50，100, 200, 400納摩；內(nèi)插圖為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出的F/匕和his-P78蛋白濃度的線性關(guān)系 圖5為核酸適配體分子信標(biāo)探針對20微克含his-p78重組蛋白的大腸桿菌裂解全蛋白的熒光響應(yīng)圖；其中，曲線I為加入裂解全蛋白后核酸適配體分子信標(biāo)探針熒光光譜圖，曲線2為加入裂解全蛋白前核酸適配體分子探針熒光光譜圖。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施案例I :核酸適配體分子信標(biāo)探針制備
一種如圖I所示的本發(fā)明檢測組氨酸標(biāo)簽的核酸適配體分子信標(biāo)探針，該探針包括核酸適配體分子信標(biāo)探針和分別連接5端和3端的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。核酸適配體分子信標(biāo)探針包括組氨酸標(biāo)簽識別序列(5，-CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG 3’)、接在3端與核酸適配體部分堿基互補(bǔ)的核酸片段cDNA {CAACCTG)以及連接兩個核酸片段的橋聯(lián)分子PEG36。其中核酸適配體分子信標(biāo)探針中雙鏈互補(bǔ)雜交的能力弱于核酸適配體與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的能力。本實(shí)施案例中核酸適配體分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)后于ABI DNAsynthersizer 上合成。實(shí)施例2 :核酸適配體分子信標(biāo)探針對組氨酸標(biāo)記蛋白的動力學(xué)響應(yīng)
取納摩的物質(zhì)的量的探針溶于微升結(jié)合緩沖溶液中，其最終濃度為25納摩。取兩管200微升該溶液于95度加熱10分鐘后，緩慢冷卻至室溫。加入含組氨酸標(biāo)簽P78重組蛋白或P78蛋白，使蛋白最終濃度均為300納摩。同時由Fluorolog spectrophotometer (JobinYvon Horiba)記錄核酸適配體分子探針的突光變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,在加入最終濃度為300納摩的組氨酸標(biāo)簽P78蛋白400秒后，核酸適配體分子信標(biāo)探針熒光急劇增強(qiáng)并隨著時間持續(xù)增大；而最終濃度為300納摩的無組氨酸標(biāo)簽P78蛋白幾乎不引起分子探針的熒光變化。該實(shí)施案例表明本專利提供的核酸適配體分子信標(biāo)探針能快速并特異性識別組氨酸標(biāo)簽重組蛋白。實(shí)施例3 :核酸適配體分子信標(biāo)探針對多種組氨酸標(biāo)記蛋白的特異性識別取納摩的物質(zhì)的量的探針溶于微升結(jié)合緩沖溶液中，其最終濃度為25納摩。取200微升該溶液于95度加熱10分鐘后，緩慢冷卻至室溫。于室溫由FlUOTologspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄該核酸適配體分子信標(biāo)探針的突光強(qiáng)度。往200微升已淬火的探針溶液中分別加入含組氨酸標(biāo)簽的P68重組蛋白(終濃度為200納摩)、含組氨酸標(biāo)簽的P78重組蛋白(終濃度為200納摩)、含組氨酸標(biāo)簽的GSTZ重組蛋白(終濃度為200納摩)、組氨酸標(biāo)簽多肽(終濃度為10微摩)、P68蛋白(終濃度為200納摩)、P78蛋白(終濃度為200納摩)、牛血清蛋白BSA (最終濃度為200納摩)和牛血清蛋白BSA* (最終濃度為10微摩)。室溫孵育一小時后，于室溫由Fluorolog spectrophotometer (JobinYvon Horiba)記錄探針溶液的熒光變化。如圖3所示，對于組氨酸標(biāo)簽多肽和含組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白(his-p68、his-p78和his-GSTZ)具有很強(qiáng)的識別性能力；然而對無組氨酸標(biāo)簽的p68、p78和濃度高達(dá)10微摩牛血清蛋白的響應(yīng)信號非常低。該實(shí)施案例說明本專利提供的分子信標(biāo)核酸適配體分子信標(biāo)探針能特異性識別與檢測含組氨酸標(biāo)簽蛋白。 實(shí)施例3 :核酸適配體分子信標(biāo)探針對不同濃度P78-組氨酸標(biāo)記蛋白的檢測比較 取納摩爾物質(zhì)的量的探針溶于微升結(jié)合緩沖溶液中，其最終濃度為25納摩。取
200微升該溶液于95度加熱10分鐘后，緩慢冷卻至室溫。于室溫由FlUOTologspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄該分子信標(biāo)核酸適配體探針的突光強(qiáng)度。往200微升已淬火的探針溶液中分別加入不同終濃度(6. 25-400納摩)的含組氨酸標(biāo)簽的p78重組蛋白。室溫孵育一小時后，于室溫由Fluorolog spectrophotometer (Jobin YvonHoriba)記錄探針溶液的熒光變化。如圖4所示，不同濃度的含組氨酸標(biāo)簽的P78重組蛋白引起分子探針產(chǎn)生不同程度的熒光強(qiáng)度變化。該探針的檢測下限(基于3倍信噪比)可達(dá)4.2 nM。該實(shí)施案例表明該核酸適配體分子信標(biāo)探針可以用于檢測和量化組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)。。實(shí)施案例4 :核酸適配體分子信標(biāo)探針檢測細(xì)胞裂解液中的his_P78重組蛋白
取納摩的物質(zhì)的量的核酸適配體分子信標(biāo)探針溶于微升結(jié)合緩沖溶液中，其最終濃度為25納摩。取200微升該溶液于95度加熱10分鐘后，緩慢冷卻至室溫。于室溫由FlUOTologspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄該核酸適配體分子探針的突光強(qiáng)度。往200微升已淬火的探針溶液中加入20微克含his-p78重組蛋白的大腸桿菌裂解全蛋白。室溫孵育一小時后，于室溫由 Fluorolog spectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)記錄探針溶液的熒光變化。如圖5所示，20微克含his-p78重組蛋白的大腸桿菌裂解全蛋白導(dǎo)致分子探針明顯的熒光強(qiáng)度變化，根據(jù)圖4中探針熒光強(qiáng)度變化與his-P78重組蛋白濃度線性關(guān)系，his-P78重組蛋白在大腸桿菌裂全蛋白中濃度為178. 8納摩。
權(quán)利要求
1.一種檢測組氨酸標(biāo)簽的核酸適配體分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述探針包含SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的序列；SEQ ID NO. I所示序列的3’端與SEQ ID NO. 2所示序列的5’端通過PEG36橋聯(lián)；SEQ ID NO. I所示序列5’端修飾有熒光基團(tuán)FAM ；SEQ ID NO. 2所示序列3’端修飾有淬滅基團(tuán)Dabcyl。
2.如權(quán)利要求I所述的核酸適配體分子信標(biāo)探針，其特征在于，當(dāng)所述核酸適配體分子信標(biāo)探針未與組氨酸標(biāo)記蛋白結(jié)合時，探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，探針的FAM基團(tuán)的熒光信號被Dabcyl基團(tuán)猝滅；當(dāng)所述核酸適配體分子信標(biāo)探針與組氨酸標(biāo)記蛋白結(jié)合時，探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)改變，熒光基團(tuán)FAM遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)Dabcyl，使得FAM基團(tuán)的熒光信號恢復(fù)。
3.一種基于權(quán)利要求I或2所述的核酸適配體分子信標(biāo)探針檢測細(xì)胞裂解物中組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的方法，包括如下步驟 (1)制備核酸適配體分子信標(biāo)探針在ABIDNA synthersizer上合成權(quán)利要求I所述的核酸適配體分子信標(biāo)探針； (2)將待測細(xì)胞裂解物加入到含有步驟(I)所述探針的緩沖溶液中，通過檢測探針熒光強(qiáng)度的變化來檢測細(xì)胞裂解物中的組氨酸標(biāo)記蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測組氨酸標(biāo)簽的核酸適配體分子信標(biāo)探針及利用該探針檢測細(xì)胞裂解物中組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的直接通用方法。本發(fā)明的核酸適配體探針包含SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列；SEQIDNO.1所示序列的3’端與SEQIDNO.2所示序列的5’端通過PEG36橋聯(lián)；SEQIDNO.1所示序列5’端修飾有熒光素FAM；SEQIDNO.2所示序列3’端修飾有淬滅基團(tuán)Dabcy1。利用本發(fā)明的核酸適配體分子信標(biāo)探針，不需蛋白質(zhì)標(biāo)記并可快速定量分析細(xì)胞裂解液中組氨酸標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)表達(dá)，本發(fā)明的方法具有普遍、廉價并且可以簡單快速定量分析組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK102719430SQ20121019314
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者丁玎, 張曉兵, 譚曉紅, 譚蔚泓 申請人:湖南大學(xué)