專利名稱：擬南芥AtJAZ7蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物葉片衰老中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種擬南芥AtJAZ7蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物葉片衰老中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
衰老是植物生長發(fā)育、形態(tài)建成和對環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)中ー個必要的、主動的過程，是受內(nèi)外因子直接或間接影響的ー種器官或組織逐步走向功能衰退和死亡的變化過程，認識衰老原因，推遲衰老起始或延緩衰老進程，尤其防止早衰發(fā)生具有重要意義。葉片是植物進行光合作用的重要器官，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用。植物的葉片衰老是ー種程序性的細胞死亡(Programmed Cell Death, P⑶)，是葉片發(fā)育的最終階段。這ー過程對于植物營養(yǎng)物質(zhì)從葉子到發(fā)育的種子中重新分配至關(guān)重要。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，作物的衰老與產(chǎn)量 有著密切的關(guān)系，研究裳老相關(guān)的功能基因?qū)τ谔崧勛魑飶V量具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供擬南芥AtJAZ7蛋白的新用途，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表序列2所示，所述新用途為序列表序列2所示蛋白可用于調(diào)控目的植物葉片的衰老進程，或調(diào)節(jié)序列表序列2所示蛋白表達量的物質(zhì)或方法可用于調(diào)控目的植物葉片的衰老進程。本發(fā)明的另ー個目的是提供一種延緩植物葉片衰老的方法，是將序列表序列2所示蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到葉片衰老程度低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。在上述方法中，所述葉片衰老程度低于所述目的植物表現(xiàn)為經(jīng)黑暗誘導(dǎo)的所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片中葉綠素含量高于經(jīng)所述黑暗誘導(dǎo)的所述目的植物，和/或經(jīng)所述黑暗誘導(dǎo)的所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片中過氧化氫含量低于經(jīng)所述黑暗誘導(dǎo)的所述目的植物；所述黑暗誘導(dǎo)具體可為進行連續(xù)黑暗培養(yǎng)，所述連續(xù)黑暗培養(yǎng)的時間根據(jù)目的植物及其發(fā)育時期以及處理方法的不同而不同，在本發(fā)明的實施例中，采用連續(xù)黑暗培養(yǎng)幼苗時期的擬南芥植株120小時(即5天)或在連續(xù)黑暗條件下用水浸泡苗期的擬南芥離體葉片168小時(即7天)。在上述方法中，所述序列表序列2所示蛋白的編碼基因為如下I)或2)或3)的基因I)其核苷酸序列是序列表序列I所示的DNA分子；2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列2所示蛋白的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列2所示蛋白的DNA分子。
所述嚴格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, O. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，O. 5XSSC,O. 1%SDS 中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，O. I X SSC,O. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65。。，O. 1XSSC,0. 1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2X SSC, O. 1%SDS 和 1XSSC,0. 1%SDS 各洗膜一次。在上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。在上述方法中，所述雙子葉植物為擬南芥。在本發(fā)明的實施例中，所述目的植物為擬南芥純合T-DNA插入AtJAZ7基因的突變體 jaz7。
實驗證明，黑暗培養(yǎng)5天后，擬南芥純合T-DNA插入AtJAZ7基因的突變體jaz7的葉片顏色變黃程度較其它株系顯著，而過表達株系葉片變黃程度較野生型擬南芥WT輕，將AtJAZ7基因?qū)胪蛔凅wjaz7獲得的表達AtJAZ7基因的補償體與WT無顯著差異；無論在正常光照還是在黑暗培養(yǎng)條件下，突變體jaz7葉片中的H2O2含量都明顯高于野生型WT葉片中的H2O2含量。突變體jaz7的離體葉片經(jīng)黑暗處理7天，葉綠素含量為WT的60%，補償體和過表達株系與WT無顯著差異。本發(fā)明為提高作物產(chǎn)量和培育抗早衰植物提供了ー種新的途徑，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。


圖I為重組載體PCAMBIA 1300-AtJAZ7的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖。其中，JAZ7代表序列表序列I的基因，LB和RB分別代表T-DNA的左臂和右臂，Nos Term代表胭脂堿合酶終止子,35s promoter代表花椰菜花葉病毒35s啟動子，Hygromycin代表潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。圖2為擬南芥T-DNA插入突變體WiscDsLox7Hll的插入位置示意圖。其中，灰色粗框為AtJAZ7基因的外顯子片段。圖3為T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中AtJAZ7基因相對表達量結(jié)果。圖4為T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的黑暗誘導(dǎo)表型。左側(cè)兩排培養(yǎng)缽為正常光照條件下的對照處理表型，右側(cè)兩排的培養(yǎng)缽為黑暗誘導(dǎo)5天處理表型；從上到下四排培養(yǎng)缽依次為突變體jaz7、補償體、WT和過表達株系植株。圖5為突變體jaz7和WT擬南芥植株經(jīng)黑暗誘導(dǎo)后葉片中的H2O2含量測定結(jié)果。圖6為T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株離體葉片經(jīng)黑暗誘導(dǎo)后的葉片表型。其中，圖A為各株系植株離體葉片在黑暗誘導(dǎo)60小時和168小時的表型，圖B為各株系植株離體葉片在黑暗誘導(dǎo)60小時和168小時后的DAB染色表型。圖7為T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株離體葉片經(jīng)黑暗誘導(dǎo)后的葉綠素含量測定結(jié)果O
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、利用擬南芥AtJAZ7蛋白及其編碼基因延緩植物葉片的衰老I、擬南芥AtJAZ7基因的獲得用50 μ mol/L茉莉酮酸甲酷(MeJA) 水溶液噴淋幼苗時期的野生哥倫比亞生態(tài)型擬南芥Col-O (https://abrc. osu. edu/)，6小時后，取植株莖葉利用TRIZOL試劑提取總RNA,并以總RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此cDNA為模板，在弓丨物CDS-PF和引物CDS-PR的引導(dǎo)下，進行PCR擴增，將獲得的擴增產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化450bp左右的DNA片段，對該片段進行測序，結(jié)果表明，該DNA片段含有序列表序列I所示的核苷酸序列。序列表序列I所示的447bp核苷酸序列為擬南芥AtJAZ7蛋白的開放閱讀框，編碼序列表序列2所示的由148個氨基酸組成的擬南芥AtJAZ7蛋白，自氨基端(N端)第61-89位氨基酸殘基為TIFY功能域，第120-144位氨基酸殘基為JAS功能域，這兩個保守的功能域?qū)τ贘AZ行使其功能起決定性作用。序列表序列I所示的核苷酸序列所對應(yīng)的擬南芥基因組DNA序列為擬南芥第二號染色體從14，580，159bp到14，580，935bp位核苷酸序列。上述引物⑶S-PF和引物⑶S-PR的序列如下引物CDS-PF 5，-GCTCTAGAATGATCATCATCATCAAAAACTGC-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XbaI識別位點及保護堿基)；引物CDS-PR 5，-GGGGTACCCTATCGGTAACGGTGGTAAG-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶KpnI識別位點及保護堿基)。2、擬南芥AtJAZ7基因重組表達載體的構(gòu)建取步驟I回收并純化的450bp左右的DNA片段，用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI雙酶切，與經(jīng)XbaI和KpnI雙酶切的載體pCAMBIA 1300的骨架片段連接，獲得重組載體pCAMBIA1300-AtJAZ7,經(jīng)測序證實，重組載體 pCAMBIA 1300_AtJAZ7 為載體 pCAMBIA1300 的 XbaI 和KpnI位點間插入了序列表序列I所示核苷酸序列，重組載體pCAMBIA1300-AtJAZ7的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖如圖I所示。3、重組農(nóng)桿菌的獲得取步驟2制備得到的重組載體pCAMBIA 1300_AtJAZ7轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細胞(中國質(zhì)粒載體菌株細胞株基因保藏中心)，28°C于含100 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平的YEB固體培養(yǎng)中篩選培養(yǎng)；挑取陽性克隆提質(zhì)粒，用步驟I不含下劃線堿基的引物⑶S-PF和引物⑶S-PR進行PCR檢測；PCR鑒定呈陽性的克隆即為含有重組載體PCAMBIA 1300-AtJAZ7 的重組農(nóng)桿菌，命名為 GV3101/PCAMBIA 1300_AtJAZ7。4、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得用步驟3的重組農(nóng)桿菌GV3101/PCAMBIA 1300_AtJAZ7浸花法分別侵染野生哥倫比亞生態(tài)型擬南芥Col-O (https://abrc.osu.edu/)(簡稱為WT)和擬南芥純合T-DNA插入AtJAZ7基因的突變體jaz7 (簡稱為jaz7)，獲得T3代純合轉(zhuǎn)PCAMBIA 1300_AtJAZ7的WT株系(簡稱為過表達株系)和T3代純合轉(zhuǎn)PCAMBIA 1300_AtJAZ7的jaz7株系(簡稱為補償體株系)，具體轉(zhuǎn)化方法如下I)將WT和jaz7的種子培養(yǎng)至植株開花后，剪去主枝頂端，促進側(cè)枝發(fā)展。
2)取步驟3的重組農(nóng)桿菌GV3101/PCAMBIA 1300_AtJAZ7接種于5ml YEB液體培養(yǎng)基(含100 V- g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平)中，搖菌過夜,第二天轉(zhuǎn)瓶至500mlYEB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)至OD6tltl為I. 5-3. O ;離心收集菌體，用10%蔗糖溶液稀釋至OD6tltl為O. 8-1.0，得到侵染液。3)將步驟I)剪枝后4 6天的擬南芥植株倒置于侵染液中浸泡；取出種植盤，用充滿氣的黑色塑料袋包住，平放，21°C下暗培養(yǎng)24小時后去掉塑料袋將種植缽直立?；謴?fù)光照和溫度按正常方法培養(yǎng)植株至結(jié)實，收獲成熟的T1代種子。4) \代種子消毒后，用無菌水清洗6— 7次，平鋪于含50mg/L卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上在正常條件下培養(yǎng)，獲得卡那霉素抗性植株(抗性表現(xiàn)為正常生長，敏感表現(xiàn)為死亡)，單株收獲抗性植株上的種子繼續(xù)按照同樣的方法篩選，最后得到T3代不再產(chǎn)生卡那霉素抗性分離的純合過表達株系8個和補償體株系4個，用步驟I中不含下劃線堿基的引物⑶S-PF和引物⑶S-PR進行PCR檢測，結(jié)果均呈陽性。 T1代表示轉(zhuǎn)化當代植株自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株；T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株；τ3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。上述擬南芥純合T-DNA插入At JAZ7基因的突變體jaz7的獲得方法如下I)在 TIAR 網(wǎng)站(http://www. arabidopsis. org/)查找 AT2G34600 的突變體，選擇T-DNA插入突變體WiscDsLox7Hll (圖2)，種子編號CS849196，從擬南芥資源庫ABRC購買該突變體種子。2)突變體種植種子經(jīng)10%次氯酸鈉消毒15min，再用無菌水洗滌5次，種在MS培養(yǎng)基上，4度春化3天后，在溫室中培養(yǎng)10天左右(溫室條件溫度18-22度，光照120umol/(m2 · s)，相対濕度65%)，將幼苗轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土 蛭石=1 1中生長。3)待幼苗生長3周左右，單株剪葉片，提取基因組DNA。采用SALK網(wǎng)站(http://signal, salk. edu/)提供的引物鑒定突變體T-DNA是否在兩條染色體上都有插入，即是否為純合插入突變體。引物RP (5，-ACCCATTTTAGGAGACCGTTG-3’ )總是被設(shè)定位于T-DNA插入片段的3’端在該基因上的一段核苷酸序列，引物L(fēng)P (5’ -GGTACACCGCGGATTAAAATC-3’)位于基因另一端,LP+RP用以擴增該基因片段；引物L(fēng)B(5’-AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3’)位于T-DNA左端的一段核苷酸序列，LB+RP用以檢測是否有T-DNA插入基因組。因此，若該株突變體用兩對引物擴增，只有LB+RP擴增到目的DNA片段，說明該株幼苗為純合體；若只有LP+RP能擴增到目的DNA，說明該株幼苗為野生型；若二者都能擴增得到DNA片段，則該株幼苗為雜合體。保留純合體繼續(xù)生長繁種，得到擬南芥純合T-DNA插入AtJAZ7基因的突變體jaz7。5、轉(zhuǎn)基因擬南芥株系植株的實時熒光定量PCR鑒定取同一正常培養(yǎng)環(huán)境中生長四周的、步驟4獲得的T3代純合轉(zhuǎn)基因株系過表達和補償體植株以及jaz7和WT植株的葉片，用TRIZOL試劑分別提取總RNA，LiCl沉淀純化后測定濃度及0D260/280和0D260/230值，嚴格定量后進行反轉(zhuǎn)錄，稀釋得到濃度為2ng/μ I的cDNA，再以此cDNA為模板，以AtJAZ7基因特異引物MJZ5-F和MJZ5-R為引物進行實時熒光定量PCR擴增，分析各株系植株內(nèi)AtJAZ7基因的表達情況，以18sRNA為內(nèi)參基因，引物為18s-F和18s-R。實時熒光定量PCR在ABI PRISM* 7000實時熒光定量PCR儀上進行，一次平行試驗設(shè)3次重復(fù)。利用Livak KJ和SchmittgenTD (2001)報道的方法，即2_Δ Δετ計算相對表達量。Δ Δ Ct- (CT.Target — Ct Actin) Timex — (CT.Target — CT.Actin) Time0Time x表示任意時間點，Time ^表示經(jīng)actin校正后I倍量的目標基因表達。AtJAZ7基因的特異引物序列如下(靶序列為序列表序列I的第325-426位)MJZ5-F :5’ -ATCCCAAACAATTC GACTCG-3’(序列表序列 3 所示)；MJZ5-R :5’ -GGAAGTTGCTTGAATCCGAA-3’(序列表序列 4 所示)；18sRNA基因的特異引物序列如下18s-F :5，-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3，；18s-R :5’-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3’。結(jié)果如圖3所示，AtJAZ7基因的突變體jaz7不表達AtJAZ7基因，補償體與WT的AtJAZ7基因相對表達量接近，過表達株系的AtJAZ7基因相對表達量明顯高于其他株系。6、轉(zhuǎn)基因擬南芥株系植株的葉片衰老表型鑒定I)黑暗誘導(dǎo)下的葉片衰老實驗將jaz7和WT以及步驟4獲得的T3代純合轉(zhuǎn)基因株系過表達和補償體的植株在同一正常條件下(光照16小時，黑暗8小時，溫度為21°C)培養(yǎng)，苗期放置于完全避光的黑暗條件下培養(yǎng)5天，以正常光照培養(yǎng)的處理為對照，觀察表型(如圖4所示)，同時用Amplex Red過氧化氫/過氧化氫酶檢測試劑盒(Invitrogen,商品目錄編號A22188)檢測各處理不同株系植株蓮座葉片中H2O2含量(結(jié)果如表I和圖5所示)，每個處理3-4次重復(fù)，每個重復(fù)內(nèi)每個株系測4-5株。表I. T3代純合轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)黑暗誘導(dǎo)5天葉片中H2O2含量測定結(jié)果(単位μ M/mg)
權(quán)利要求
1.序列表序列2所示蛋白在調(diào)控目的植物葉片衰老進程中的應(yīng)用。
2.一種延緩植物葉片衰老的方法，是將序列表序列2所示蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫饺~片衰老程度低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述葉片衰老程度低于所述目的植物表現(xiàn)為經(jīng)黑暗誘導(dǎo)的所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片中葉綠素含量高于經(jīng)所述黑暗誘導(dǎo)的所述目的植物，和/或經(jīng)所述黑暗誘導(dǎo)的所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片中過氧化氫含量低于經(jīng)所述黑暗誘導(dǎo)的所述目的植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述序 列表序列2所示蛋白的編碼基因為如下I)或2)或3)的基因 1)其核苷酸序列是序列表序列I所示的DNA分子； 2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列2所示蛋白的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列2所示蛋白的DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種擬南芥AtJAZ7蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物葉片衰老中的應(yīng)用。實驗證明，黑暗培養(yǎng)5天后，擬南芥純合T-DNA插入AtJAZ7基因的突變體jaz7的葉片顏色變黃程度較其它株系顯著，而過表達株系葉片變黃程度較野生型擬南芥WT輕，將AtJAZ7基因?qū)胪蛔凅wjaz7獲得的表達AtJAZ7基因的補償體與WT無顯著差異；無論在正常光照還是在黑暗培養(yǎng)條件下，突變體jaz7葉片中的H2O2含量都明顯高于野生型WT葉片中的H2O2含量。突變體jaz7的離體葉片經(jīng)黑暗處理7天，葉綠素含量為WT的60%，補償體和過表達株系與WT無顯著差異。本發(fā)明為提高作物產(chǎn)量和培育抗早衰植物提供了一種新的途徑，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
文檔編號C12N15/84GK102732559SQ20121019337
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者于娟, 張群蓮, 徐文英, 蘇震, 邸超 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)