專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定豬優(yōu)良肉質(zhì)基因和/或營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定影響豬肉質(zhì)性狀的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和豬肉質(zhì)調(diào)控基因的方法及組合物，特別涉及一種鑒定影響豬肉質(zhì)性狀的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和調(diào)控豬優(yōu)良肉質(zhì)的基因的方法，及其由特異組合的細(xì)胞模型和肉質(zhì)關(guān)鍵調(diào)控基因的引物對(duì)組成的組合物。
背景技術(shù)：
發(fā)展優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的養(yǎng)豬業(yè)是提高人民生活水平、增強(qiáng)我國(guó)豬肉產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力和確保養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。過(guò)去30多年來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)豬肉供應(yīng) 基本解決了吃肉難的問(wèn)題。隨著人民生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)豬肉風(fēng)味品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)和安全的要求越來(lái)越高，養(yǎng)豬業(yè)面臨著從量變向質(zhì)變轉(zhuǎn)化的過(guò)程。然而，由于養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期以來(lái)的努力目標(biāo)為“高產(chǎn)”，特別是近年來(lái)主要以引進(jìn)洋種豬、規(guī)?；暳橡B(yǎng)殖為方式的豬肉產(chǎn)量高增長(zhǎng)模式，導(dǎo)致了目前國(guó)內(nèi)主要供應(yīng)豬肉品種品質(zhì)的顯著下降。表現(xiàn)為豬肉主要品質(zhì)指標(biāo)明顯降低，風(fēng)味、口感和營(yíng)養(yǎng)水平下降，不僅引起廣大人民的生活質(zhì)量下降，而且造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，北京市場(chǎng)上洋種養(yǎng)殖豬肉價(jià)格僅為10-15元/500克，而肉質(zhì)優(yōu)良的土種豬北京黑豬的價(jià)格在25-35元/500克。此外，肉品質(zhì)低也嚴(yán)重影響了國(guó)產(chǎn)豬肉的進(jìn)出口貿(mào)易。因此，提高豬肉品質(zhì)，成為滿足人民日益增長(zhǎng)的對(duì)優(yōu)質(zhì)豬肉的需求、增強(qiáng)我國(guó)豬肉產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力和確保養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。經(jīng)過(guò)我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，豬肉的品質(zhì)性狀雖然包括通過(guò)很多指標(biāo)，包括嫩度、肉色、風(fēng)味、系水力和口感等，但從分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的角度來(lái)看，豬肉的品質(zhì)主要由肌纖維的發(fā)育和肌內(nèi)脂肪的沉積來(lái)決定。在豬的生長(zhǎng)和肥育過(guò)程中，如果體內(nèi)脂肪主要沉積到骨骼肌部位的細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)，將形成“大理石紋”或“雪花肉”，明顯提高肉的品質(zhì)；而如果脂肪沉積形成的皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪和腹脂是養(yǎng)豬生產(chǎn)中不想要的“廢棄脂肪”。如何在不增加“廢棄脂肪”沉積的同時(shí)(瘦肉型豬的“廢棄脂肪”已很少)增加肌內(nèi)脂肪是改善肉品質(zhì)的理論和技術(shù)瓶頸。研究發(fā)現(xiàn)，不同部位脂肪沉積和肉質(zhì)發(fā)育生理進(jìn)程的差異收到內(nèi)因(基因)和外因(營(yíng)養(yǎng))的綜合作用和調(diào)控。已經(jīng)報(bào)道的能夠?qū)w內(nèi)脂肪沉積和肉質(zhì)發(fā)育發(fā)揮調(diào)控的功能性基因包括FABP4 (脂肪酸結(jié)合蛋白)、LIPINl等，而較為公認(rèn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為甜菜堿等。然而，運(yùn)用傳統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)的這些基因和/或飼料添加劑，具有研究周期長(zhǎng)、需要大規(guī)模動(dòng)物實(shí)驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證、不能揭示作用機(jī)理和不能發(fā)掘綜合性效應(yīng)等缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿足當(dāng)前豬肉肉質(zhì)改良的要求。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序計(jì)劃的完成和芯片技術(shù)的發(fā)展，使用豬的Affymetrix(美國(guó)Affymetrix公司)寡核苷酸芯片，對(duì)不同肉質(zhì)種豬進(jìn)行高通量基因篩選的研究為肉質(zhì)改良提供了新思路。然而，基于芯片技術(shù)的方法存在以下缺點(diǎn)(1)篩選結(jié)果多為海量數(shù)據(jù)，分析困難，無(wú)法進(jìn)行應(yīng)用推廣；(2)其中存在大量假陽(yáng)性基因，不能對(duì)調(diào)控肉質(zhì)的關(guān)鍵基因進(jìn)行鑒定；(3)不適用與研究調(diào)控豬優(yōu)良肉質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)(含飼料添加劑等)。因此，迫切的需要開(kāi)發(fā)一種新型技術(shù)，可用于對(duì)芯片篩選方法獲得的能夠?qū)ωi的肉質(zhì)發(fā)育發(fā)揮重要作用的功能性基因的鑒定方法，以及適用于對(duì)傳統(tǒng)方法和多種豬的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)(含飼料添加劑等)對(duì)肉質(zhì)影響作用進(jìn)行篩選和鑒定的方法。該技術(shù)的創(chuàng)建，將為解決豬的肉質(zhì)改良問(wèn)題提供終極對(duì)策。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定能夠調(diào)控豬肉質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和功能基因的方法及組合物。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定豬營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和豬肉質(zhì)基因的組合物由3T3-L1細(xì)胞、C2C12細(xì)胞、特異于AMPK-α基因的引物對(duì)1，以及特異于PGC-I α基因的引物對(duì)2組成；所述特異于AMPK- α基因的引物對(duì)I由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成；所述特異于PGC-I α基因的引物對(duì)2由序列表中序列3和序列4所不的兩條單鏈DNA組成。
所述AMPK-α基因的GENBANK登陸號(hào)為ΝΜ_001013367. 3 ;所述PGC-I α基因的GENBANK登陸號(hào)為ΝΜ_008904. 2。序列I由18個(gè)核苷酸組成；序列2由18個(gè)核苷酸組成；序列3由18個(gè)核苷酸組成；序列4由18個(gè)核苷酸組成。含有上述組合物的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述組合物的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述組合物的制備方法包括將上述組合物中各細(xì)胞分別單獨(dú)包裝，以及將各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。上述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述試劑盒的制備方法包括如下步驟將所述組合物中各細(xì)胞分別單獨(dú)包裝，以及將所述組合物中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。本發(fā)明所提供的用上述組合物鑒定或輔助鑒定待測(cè)物質(zhì)是否為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)的方法，包括如下步驟將所述待測(cè)物質(zhì)分別與C2C12細(xì)胞和經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞共同孵育，檢測(cè)所述待測(cè)物質(zhì)是否抑制所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的成脂分化，檢測(cè)所述待測(cè)物質(zhì)是否促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化；若所述待測(cè)物質(zhì)同時(shí)滿足如下a)和b)對(duì)條件，則所述待測(cè)物質(zhì)為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或候選為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，若所述待測(cè)物質(zhì)不同時(shí)滿足如下a)和b)對(duì)條件，則所述待測(cè)物質(zhì)不為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)a)所述待測(cè)物質(zhì)抑制所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的成脂分化；b)所述待測(cè)物質(zhì)促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化。所述“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的方法包括如下步驟先用含有IBMX、胰島素和地塞米松的溶液I與待誘導(dǎo)細(xì)胞孵育2-4d，再用含有胰島素但不含IBMX和地塞米松的溶液2與所述細(xì)胞孵育2-3d ;所述溶液I中所述IBMX的終濃度為5 μ Μ，所述溶液I中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL,所述溶液I中所述地塞米松的終濃度為I μ M ;所述溶液2中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL所述方法還包括如下步驟將所述待測(cè)物質(zhì)分別與所述C2C12細(xì)胞和所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞共同孵育后，利用所述引物對(duì)I檢測(cè)所述3T3-L1細(xì)胞與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后AMPK- α基因相對(duì)于所述經(jīng)“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的表達(dá)量變化，利用所述引物對(duì)2檢測(cè)所述C2C12細(xì)胞與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后PGC-I α基因相對(duì)于所述C2C12細(xì)胞的表達(dá)量變化；若所述待測(cè)物質(zhì)同時(shí)滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)物質(zhì)可以確證為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，若所述待測(cè)物質(zhì)滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)物質(zhì)可以候選為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)c)和所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下3T3-L1細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照組)相t匕，與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后所述3T3-L1細(xì)胞中所述AMPK-α基因的表達(dá)量降低； d)和所述C2C12細(xì)胞組(陰性對(duì)照組)比，與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后所述C2C12細(xì)胞中所述PGC-Ia基因的表達(dá)量提高。本發(fā)明所提供的用上述組合物鑒定或輔助鑒定待測(cè)基因是否為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因的方法，包括如下步驟(I)將所述待測(cè)基因分別導(dǎo)入3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞使其表達(dá)；(2)對(duì)所述3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)，所述C2C12細(xì)胞不做處理；(3)檢測(cè)所述待測(cè)基因是否抑制所述3T3-L1細(xì)胞在“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下的成脂分化，檢測(cè)所述待測(cè)基因是否促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化；(4)按照如下方法確定所述待測(cè)基因是否為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因若所述待測(cè)基因同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則所述待測(cè)基因?yàn)樨i優(yōu)良肉質(zhì)基因或候選為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因，若所述待測(cè)基因不同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則所述待測(cè)基因不為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因a)所述待測(cè)基因抑制所述3T3-L1細(xì)胞在所述“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下的成脂分化；b)所述待測(cè)基因促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化。所述“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的方法包括如下步驟先用含有IBMX、胰島素和地塞米松的溶液I與待誘導(dǎo)細(xì)胞孵育2-4d，再用含有胰島素但不含IBMX和地塞米松的溶液2與所述細(xì)胞孵育2-3d ;所述溶液I中所述IBMX的終濃度為5 μ Μ，所述溶液I中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL,所述溶液I中所述地塞米松的終濃度為I μ M ;所述溶液2中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL。所述方法還包括如下步驟在上述方法的步驟(2)之后，同時(shí)利用所述引物對(duì)I檢測(cè)所述3T3-L1細(xì)胞中導(dǎo)入所述待測(cè)基因后AMPK-α基因相對(duì)于導(dǎo)入空質(zhì)粒組的表達(dá)量變化，利用所述引物對(duì)2檢測(cè)所述C2C12細(xì)胞中導(dǎo)入所述待測(cè)基因后PGC-I α基因相對(duì)于導(dǎo)入空質(zhì)粒組的表達(dá)量變化；若所述待測(cè)基因同時(shí)滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)基因可以確證為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因，若所述待測(cè)基因滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)基因可以候選為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因c)和導(dǎo)入空質(zhì)粒組相比，將所述待測(cè)基因?qū)胨?T3-L1細(xì)胞后所述ΑΜΡΚ-α基因的表達(dá)量降低；
d)和導(dǎo)入空質(zhì)粒組相比，將所述待測(cè)基因?qū)胨鯟2C12細(xì)胞后所述PGC-I α基因的表達(dá)量提聞。在上述各方法中，所有步驟(I)中將所述待測(cè)基因分別導(dǎo)入3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞的方法，具體為通過(guò)重組表達(dá)載體將所述待測(cè)基因分別導(dǎo)入所述3T3-L1細(xì)胞和所述C2C12細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述待測(cè)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為CMV啟動(dòng)子。更為具體的，所述重組表達(dá)載體為在真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. I的CMV啟動(dòng)子下游正向插入所述待測(cè)基因得到的重組質(zhì)粒。 在上述各方法中，所有將所述待測(cè)物質(zhì)分別與3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞共同孵育的時(shí)間均可為24h-48h。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具體為24h。在上述各方法中，所有所述檢測(cè)所述待測(cè)物質(zhì)(或所述待測(cè)基因)是否促進(jìn)所述3T3-L1細(xì)胞的成脂分化的方法，均可包括如下(I)和(2)的步驟(I)對(duì)所述3T3-L1細(xì)胞先用油紅O溶液(染脂肪)染色，再用蘇木素(染細(xì)胞核)復(fù)染；(2)按照如下方法確定結(jié)果若所述3T3-L1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，并且著紅色(脂肪)，則判定所述待測(cè)物質(zhì)(或所述待測(cè)基因)促進(jìn)所述3T3-L1細(xì)胞的成脂分化；反之，則判定所述待測(cè)物質(zhì)(或所述待測(cè)基因)不促進(jìn)所述3T3-L1細(xì)胞的成脂分化。在上述各方法中，所有所述檢測(cè)所述待測(cè)物質(zhì)(或所述待測(cè)基因)是否促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化的方法，均可包括如下(I)和(2)的步驟(I)對(duì)所述C2C12細(xì)胞用吉姆薩溶液(染肌管)染色；(2)按照如下方法確定結(jié)果若所述C2C12細(xì)胞的形狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)部分(肌管)被染成紫藍(lán)色，則判定所述待測(cè)物質(zhì)(或所述待測(cè)基因)促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化；反之，則判定所述待測(cè)物質(zhì)(或所述待測(cè)基因)不促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化。在上述各方法中，所有所述利用所述引物對(duì)I檢測(cè)所述3T3-L1細(xì)胞中導(dǎo)入所述待測(cè)基因前后ΑΜΡΚ-α基因的表達(dá)量變化的方法，以及所有所述利用所述引物對(duì)2檢測(cè)所述C2C12細(xì)胞中導(dǎo)入所述待測(cè)基因前后PGC-Ια基因的表達(dá)量變化的方法，均具體為反轉(zhuǎn)錄PCR的方法，以18S rRNA作為內(nèi)參。上述組合物，或試劑盒，或任一所述方法在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍(a)研制能夠改善豬肉質(zhì)的飼料或飼料添加劑；(b)發(fā)掘能夠改善豬肉質(zhì)的基因；( c)培育肉質(zhì)改善的豬品種。在實(shí)際應(yīng)用中，可采用通過(guò)上述方法鑒定得到的豬營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)作為改善豬肉質(zhì)的飼料或飼料添加劑的原料。本發(fā)明開(kāi)展了豬優(yōu)良肉質(zhì)的關(guān)鍵控制基因和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控模式的鑒定工作，與其他方法比，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)體外無(wú)創(chuàng)、可以同時(shí)篩選和鑒定營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)和/或優(yōu)良肉質(zhì)基因、成本低、推廣性強(qiáng)等特點(diǎn)。本發(fā)明將有助于建立肌內(nèi)脂肪高效沉積的優(yōu)良肉質(zhì)基因的核心豬群，同時(shí)引導(dǎo)規(guī)模化豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶采用促進(jìn)肉質(zhì)改良的飼料營(yíng)養(yǎng)組分和飼喂模式，從而推動(dòng)養(yǎng)豬業(yè)能夠在短時(shí)間內(nèi)，實(shí)現(xiàn)在高產(chǎn)的基礎(chǔ)上，培育出高品質(zhì)豬肉的“優(yōu)質(zhì)”目標(biāo)。本發(fā)明對(duì)節(jié)約飼料成本，及我國(guó)地方豬種優(yōu)良肉質(zhì)基因資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)具有重要作用。


圖I為甜菜堿(營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì))或DLKl (關(guān)鍵調(diào)控基因)誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的油紅O染色和蘇木素復(fù)染結(jié)果。其中，A為陰性對(duì)照組(未經(jīng)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞);B為三聯(lián)誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照組 <為甜菜堿處理組山為空質(zhì)粒pcDNA3. I組；E為質(zhì)粒pcDNA3. I-DLKl組。(注C、D、E同時(shí)進(jìn)行了三聯(lián)誘導(dǎo))。圖2為甜菜堿(營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì))或DLKl (關(guān)鍵調(diào)控基因)誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成肌分化的吉姆薩染色結(jié)果。其中，A為陰性對(duì)照組(未經(jīng)誘導(dǎo)的C2C12 細(xì)胞)；B為馬血清陽(yáng)性對(duì)照組；C為甜菜堿處理組；D為空質(zhì)粒pcDNA3. I組；E為質(zhì)粒pcDNA3. I-DLKl組。圖3為甜菜堿(營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì))或DLKl (關(guān)鍵調(diào)控基因)誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂分化中ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。其中，“對(duì)照組”為陰性對(duì)照組(未經(jīng)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞)；“三聯(lián)誘導(dǎo)”為三聯(lián)誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照組；“P⑶B”為空質(zhì)粒pcDNA3. I組；“DLK1”為質(zhì)粒pcDNA3. I-DLKl組。(注甜菜堿、PCDB和DLKl均同時(shí)進(jìn)行了三聯(lián)誘導(dǎo))圖4為甜菜堿(營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì))或DLKl (關(guān)鍵調(diào)控基因)誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成肌分化中ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。其中，“對(duì)照組”為陰性對(duì)照組(未經(jīng)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞)；“馬血清”為馬血清誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照組；“PCDB”為空質(zhì)粒pcDNA3. I組；“DLK1”為質(zhì)粒 pcDNA3. I-DLKl 組。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。3T3-L1細(xì)胞(產(chǎn)品目錄號(hào)為Prod#CL_173)和C2C12細(xì)胞(產(chǎn)品目錄號(hào)為Prod#CRL-1772)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。蘇木素染色液以及脂肪分化試劑包括IBMX、胰島素和地塞米松均購(gòu)自Sigma公司。油紅O和吉姆薩染料購(gòu)自北京西美杰科技有限公司。DMEM/F-12不完全培養(yǎng)基(液體)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清、馬血清和胰酶購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Gibco公司。甜菜堿購(gòu)自力德士(北京)化學(xué)技術(shù)有限公司。實(shí)施例1、3T3-L1前纖維細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化細(xì)胞模型的建立I、試劑配制PBS 溶液稱(chēng)取 8. OOg NaCl、O. 20g KCl,3. 12g Na2HPO4 · 12H20 和 O. 20g KH2PO4 溶于800mL超純水中，加超純水定容至1L。以5. 6%的無(wú)菌NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至7. 2，4°C貯存?zhèn)溆谩?%多聚甲醛溶液稱(chēng)取4g多聚甲醛溶于80mL PBS溶液中，加入少量NaOH，加熱；待完全溶解后定容至lOOmL。以HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 2，4°C貯存?zhèn)溆谩. 5%油紅O溶液稱(chēng)取O. 05g油紅粉劑溶于IOmL異丙醇中，配成儲(chǔ)存液。使用前將儲(chǔ)存液6mL用蒸餾水稀釋至10mL，配成使用液,過(guò)濾后使用。75%冷乙醇將750mL無(wú)水乙醇與250mL PBS混合均勻，并置于4°C 48h，至液體澄
清透明。分化試劑配制
IBMX 工作液(100 X，現(xiàn)用現(xiàn)配)11. 5mg ΙΒΜΧ+940 μ L ddH20+60 μ L lmol/LKOH,O. 22 μ m過(guò)濾除菌，終濃度為O. 5mmol/L ；胰島素工作液(100X):lmg/mL HCl(O. 01mol/L HCl=O. 042mL濃HCl+50mLdd H2O),O. 22 μ m過(guò)濾除菌，終濃度為10 μ g/mL, _20°C貯存?zhèn)溆?；地塞米松貯存液稱(chēng)取3. 925mg地塞米松溶入到ImL無(wú)水乙醇中，濃度為10mmol/L, _20°C貯存?zhèn)溆茫还ぷ饕?1000 X ):用PBS稀釋貯存液至終濃度為lmmol/L。2、細(xì)胞培養(yǎng) 將3T3-L1細(xì)胞接種到IOOmm培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM，置于370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合時(shí)傳代，平均2 3d傳代一次。取待傳代細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕棄培養(yǎng)液，預(yù)溫PBS少許輕洗一遍，棄去PBS ;加少許0. 25%胰酶，置于培養(yǎng)箱約lmin，鏡下觀察細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞突起縮短；棄去消化液，加2 5mL新鮮培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打，待成單細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移至15mL尖底離心管，IOOOrpm 4°C離心5min，用ImL新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按一定比例接種至含有培養(yǎng)液的IOOmm培養(yǎng)皿中。3、3T3_L1前纖維細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化程序細(xì)胞接種密度為30%，當(dāng)達(dá)到100%匯合時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)2d，即接觸抑制2d。經(jīng)典“雞尾酒”法誘導(dǎo)3d，即“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)(步驟I中所述IBMX工作液和所述胰島素工作液的加量均為培養(yǎng)液總體積的I/100 ;所述地塞米松工作液的加量為培養(yǎng)液總體積的1/1000 ;輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng))。換液，胰島素單獨(dú)誘導(dǎo)2d (步驟I中所述胰島素工作液的加量為培養(yǎng)液總體積的1/100 ;輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng))，此時(shí)細(xì)胞貼壁不緊，易成片脫落，所以換液時(shí)動(dòng)作要輕柔。此后，換入正常的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2d換液。自誘導(dǎo)第6d (顯微鏡下觀察開(kāi)始出現(xiàn)又圓又亮的脂滴)后開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化情況，并計(jì)算分化率。分化率=(油紅著色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞核數(shù))X 100%4、油紅染色步驟小心抽去6孔培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液。每孔加入400 μ LPBS溶液，清洗生長(zhǎng)中的細(xì)胞表面。小心抽去每孔里的PBS溶液。每孔加入400 μ L4%多聚甲醛溶液，覆蓋整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面。室溫下孵育lOmin。小心抽去多聚甲醛溶液。每孔加入400 μ L PBS溶液，清洗生長(zhǎng)中的細(xì)胞表面。小心抽去PBS溶液，并重復(fù)操作一次。小心加入400 μ L75%冷乙醇，覆蓋整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面，室溫靜置5min。小心抽去75%冷乙醇，重復(fù)此步驟一次。小心加入400 μ L0. 5%油紅O溶液，覆蓋整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面，室溫下靜置15分鐘，可見(jiàn)部分細(xì)胞呈紅色。小心抽去0. 5%油紅O溶液，室溫下加入400 μ LPBS溶液，并孵育2min。小心抽去PBS溶液。5、蘇木素復(fù)染處理用PBS溶液清洗細(xì)胞生長(zhǎng)表面數(shù)次，直至液體清亮，無(wú)明顯紅色。加入蘇木素染色液，覆蓋整個(gè)培養(yǎng)板，約lmin。小心抽去染液，并用PBS溶液清洗至液體清亮。6、顯微鏡下觀察拍照使用Olympus細(xì)胞培養(yǎng)用顯微鏡(CK40型，Olympus公司，日本)，使用40倍物鏡觀察，選定代表性視野后，用彩色CCD進(jìn)行拍照。結(jié)果如圖I中B所示，部分3T3-L1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，并且脂肪被油紅O溶液染成紅色，基本所有3T3-L1細(xì)胞的細(xì)胞核都被蘇木素溶液染成了藍(lán)色。另外，自誘導(dǎo)后第ClOd，可以達(dá)到80%或以上的分化率。實(shí)施例2、C2C12前肌肉細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化細(xì)胞模型的建立I、染液制備稱(chēng)取O. 5g吉姆薩粉和22ml甘油；取少量甘油與吉姆薩粉在研缽內(nèi)充分混合，研磨至無(wú)顆粒；將剩余的甘油倒入研缽，于56°C保溫2h ;加入33ml純甲醇混勻，即為吉姆薩母液，將其保存于棕色試劑瓶?jī)?nèi)；取9份pH 6. 8-7. 3的PBS緩沖液和I份吉姆薩母液混合即得染色液。2、細(xì)胞培養(yǎng)將C2C12細(xì)胞按I X IO4細(xì)胞/cm2接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入DMEM/F-12完全培養(yǎng)基(即DMEM/F-12不完全培養(yǎng)基中加入體積終濃度為10%的胎牛血清)，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后，每天換DMEM/F-12完全培養(yǎng)基一次。C2C12細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3飛d，待細(xì)胞8(Γ90%融合后，棄去DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，加入細(xì)胞分化培養(yǎng)基(在液體DMEM/F-12不完全培養(yǎng)基中加入體積終濃度為2%的馬血清)，每天換新鮮細(xì)胞分化培養(yǎng)基一次。自誘導(dǎo)第2-3d (C2C12細(xì)胞分化為肌管)后開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)分化情況。3、貼壁細(xì)胞染色去除培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS溶液反復(fù)漂洗單層培養(yǎng)物2次；加入PBS溶液，再逐滴加入等體積甲醇，邊加邊混合，靜置IOmin ;將50%體積的甲醇-PBS混合液丟棄，力口入新鮮的甲醇液浸泡固定細(xì)胞IOmin,然后用甲醇漂洗細(xì)胞I次；將瓶?jī)?nèi)細(xì)胞干燥后儲(chǔ)存或直接染色；按2ml/cm2的比例滴加吉姆薩染液，覆蓋細(xì)胞層，染色2min ;移除染液，用自來(lái)水沖洗掉粉紅色背景后，再用去離子水沖洗細(xì)胞；用顯微鏡觀察單層潮濕細(xì)胞。若細(xì)胞已干，可重新使細(xì)胞潮濕后再觀察。結(jié)果如圖2中B所示，C2C12細(xì)胞的形狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)部分(肌管被染成紫藍(lán)色。實(shí)施例3、脂肪和肌肉組織中脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵性基因的分子探針設(shè)計(jì)一般而言，北京黑豬的肌內(nèi)脂肪沉積量約為3.0%_4.5%，約為瘦肉型豬的兩倍。利用豬的Affymetrix寡核苷酸芯片(Porcine Genome Array,基因有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)900623)，對(duì)北京黑豬和杜長(zhǎng)大商品瘦肉型豬(北京超市里均有銷(xiāo)售)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜進(jìn)行掃描，得到若干DNA片段備選。結(jié)合文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)豬的肉品質(zhì)決定是一個(gè)復(fù)雜的生理進(jìn)程，主要涉及到的細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程包括肌肉細(xì)胞的發(fā)生和脂質(zhì)沉積、脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)沉積等，但其中發(fā)揮主要調(diào)控作用的信號(hào)通路為PI3K和cGMP等?；谝陨仙钊胙芯拷Y(jié)果，對(duì)傳統(tǒng)方法和芯片方法進(jìn)行改進(jìn)，本發(fā)明選定這兩條關(guān)鍵信號(hào)通路的決定性基因 ΑΜΡΚ-α 和 PGCl-α (ΑΜΡΚ-α 基因的 GENBANK NM_001013367. 3 ；PGC-1 α 基因的GENBANK NM_008904. 2)，開(kāi)發(fā)出組合分子引物探針，用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)收集的細(xì)胞標(biāo)本中的AMPK- α和PGCI - α基因的mRNA表達(dá)水平。其中，特異于AMPK- α基因的引物序列為如下Al和Α2 ;特異于PGC-Ia基因的引物序列為如下Pl和Ρ2。Al和Α2擴(kuò)增片段為138堿基；P1和P2擴(kuò)增片段為158堿基。Al :5，-agttcctggagaaagatg-3，(序列 1，為 GENBANK NM_001013367. 3 的第 21-38位)A2:5，-tccggtcaactcgtgctt-3’(序列 2，為 GENBANK NM_001013367. 3 的第141-158位的反向互補(bǔ)序列)Pl :5，-catagagtgtgctgctct-3，(序列 3，為 GENBANK NM_008904. 2 的第 181-198位)P2 :5，-actggttggatatgattt-3，(序列 4，為 GENBANK NM_008904. 2 的第 321-338位的反向互補(bǔ)序列)實(shí)施例4、優(yōu)良肉質(zhì)影響因素鑒定模型和分子探針的實(shí)際應(yīng)用舉例一、用于鑒定豬營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和優(yōu)良肉質(zhì)基因的組合物本實(shí)施例中用于鑒定或輔助鑒定豬營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和優(yōu)良肉質(zhì)基因的組合物由實(shí)施例I中所述的3T3-L1細(xì)胞、實(shí)施例2中所述的C2C12細(xì)胞、以及實(shí)施例3中設(shè)計(jì)的特異于ΑΜΡΚ-α基因的引物對(duì)和特異于PGC-I α基因的引物對(duì)組成。二、鑒定或輔助鑒定待測(cè)物質(zhì)是否為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)(一)操作方法及結(jié)果判斷Α.操作方法具體如下I、參照實(shí)施例I的方法，用不同濃度的待測(cè)物質(zhì)溶液與“ΙΒΜΧ+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)成脂分化的3T3-L1細(xì)胞共孵育24h，其余步驟均與實(shí)施例I步驟相同。2、參照實(shí)施例2的方法，用不同濃度的待測(cè)物質(zhì)替代細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的“馬血清”與C2C12細(xì)胞共孵育24h，進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化，其余步驟均與實(shí)施例2步驟相同。
3、步驟I和步驟2細(xì)胞分化結(jié)束后，分別收集細(xì)胞，按照如下方法提取總RNA 為防止RNA降解，在液氮中將樣品研磨至粉末，待液氮汽化后加入RNA提取試劑Trizol (每O. Ig樣品加Iml Trizol )，室溫放置5分鐘，使組織和細(xì)胞充分裂解。12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄沉淀。按每Iml Trizol加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，振蕩混勻后室溫靜置15分鐘。在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分鐘尚心15分鐘,使油相與水相分尚，吸取上層水相(不要接觸一點(diǎn)油相)至另一離心管中。按每Iml Trizol加入0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇混勻，在室溫下靜置10分鐘使RNA沉淀。在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，只留沉于管底的RNA。按每Iml Trizol加入Iml乙醇的比例加入75%的乙醇，溫和振蕩離心管，使沉淀懸浮。在4°C條件下8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后，在避免丟失RNA沉淀的前提下盡量多地棄去上清液，然后將沉淀干燥，得到樣品RNA。4、mRNA反轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR :使用北京百泰克生物制品公司的2 X SYBRRT-PCR 試劑盒，按照使用說(shuō)明書(shū)提示的操作方法，在冰上配置PCR反應(yīng)液。主要組分為2 X Pr emi X IO μ I，上游引物(AI或PI)和下游引物(A2或P2 )各2 μ mo I，提取的總RNA模板O. lng，然后使用滅菌蒸餾水將總體積補(bǔ)充至20 μ I。使用BioTek熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀，按照兩步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)程序。95°C起始模板變性2分鐘，然后進(jìn)行以下反應(yīng)25個(gè)循環(huán)95°C模板變性15秒，65°C退火延伸40秒。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR儀繪制的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，得出各個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的mRNA含量的相對(duì)值。其中，以18S rRNA為內(nèi)參對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。B.結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下經(jīng)步驟A中I和2的染色后，若所述待測(cè)物質(zhì)同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則初步判斷所述待測(cè)物質(zhì)為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或候選為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)；接著進(jìn)行步驟A中3和4的基因表達(dá)檢測(cè)，若所述待測(cè)物質(zhì)同時(shí)滿足如下c)和d)的條件，則可以確定證實(shí)所述待測(cè)物質(zhì)為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)；經(jīng)步驟A中I和2的染色后，若所述待測(cè)物質(zhì)不同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則判斷所述待測(cè)物質(zhì)不為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)；經(jīng)步驟A中I和2的染色后，若所述待測(cè)物質(zhì)在滿足如下a)和b)條件的前提下，進(jìn)一步進(jìn)行步驟A中3和4的基因表達(dá)檢測(cè)，但不同時(shí)滿足如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)物質(zhì)可以候選為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)。a)所述待測(cè)物質(zhì)抑制經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的成脂分化；b)所述待測(cè)物質(zhì)促進(jìn)C2C12細(xì)胞的成肌分化；
c)和所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下3T3-L1細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照組)相t匕，與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后所述3T3-L1細(xì)胞中所述ΑΜΡΚ-α基因的表達(dá)量降低；d)和所述C2C12細(xì)胞(陰性對(duì)照組)比，與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后所述C2C12細(xì)胞中所述PGC-Ia基因的表達(dá)量提高。(二)實(shí)際應(yīng)用甜菜堿是較為公認(rèn)的豬營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，以下將以甜菜堿作為待測(cè)物質(zhì)，驗(yàn)證步驟(一)所述方法的準(zhǔn)確性。甜菜堿與3T3-L1細(xì)胞共孵育時(shí)的工作濃度梯度具體為4mmol/L ;甜菜堿與C2C12細(xì)胞共孵育時(shí)的工作濃度梯度具體為4mmol/L。其余操作步驟參見(jiàn)步驟(一)。同時(shí)，對(duì)于3T3-L1細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化，以實(shí)施例I以三聯(lián)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的3T3-L1成脂分化細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照；以未經(jīng)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞作為陰性對(duì)照。對(duì)于C2C12細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)分化，以實(shí)施例2以馬血清方法誘導(dǎo)的C2C12成肌分化細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照；以未經(jīng)誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞作為陰性對(duì)照。每組處理兩個(gè)重復(fù)。誘導(dǎo)到時(shí)間后，其中一組執(zhí)行實(shí)施例I中的油紅O染色和蘇木素復(fù)染(3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化)或?qū)嵤├?中的吉姆薩染色(C2C12細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化)，然后在顯微鏡下采集代表性圖片；另外一組收集誘導(dǎo)后的3T3-L1細(xì)胞或C2C12細(xì)胞，按照步驟(一)中方法對(duì)AMPK- α和PGCl- α基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以陰性對(duì)照組AMPK- α或PGCl-α基因的表達(dá)量為I。3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化的油紅O染色和蘇木素復(fù)染結(jié)果如圖I所示，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，甜菜堿處理組只有部分細(xì)胞被油紅O著色，這表明甜菜堿相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組具有抑制前脂肪細(xì)胞成脂分化的作用。另外，AMPK-α或PGCl-α基因mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，在三聯(lián)誘導(dǎo)分化的3T3-L1細(xì)胞中，甜菜堿相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，抑制AMPK-α基因的表達(dá)，而對(duì)PGCl-α基因的表達(dá)沒(méi)有作用。C2C12細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化的吉姆薩染色結(jié)果如圖2所示，與陽(yáng)性對(duì)照組相類(lèi)似，甜菜堿處理組細(xì)胞的形狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)部分(肌管)被染成紫藍(lán)色。這表明甜菜堿具有促進(jìn)前成肌細(xì)胞成肌分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-a基因mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，在分化的C2C12細(xì)胞中，甜菜堿促進(jìn)PGCl-a基因的表達(dá)，而對(duì)AMPK-α基因的表達(dá)沒(méi)有作用。結(jié)合以上兩方面數(shù)據(jù)，可以看出一方面，甜菜堿可以通過(guò)激活成肌細(xì)胞中PGCl-a基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的成肌分化；另一方面，甜菜堿可以通過(guò)抑制成脂細(xì)胞中ΑΜΡΚ-α基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制機(jī)體脂肪細(xì)胞的成脂分化。因此，甜菜堿具有促進(jìn)動(dòng)物肌內(nèi)脂肪沉積的作用，因此可以鑒定甜菜堿為對(duì)豬的優(yōu)良肉質(zhì)具有調(diào)控作用的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)。三、鑒定或輔助鑒定待測(cè)基因是否為豬的優(yōu)良肉質(zhì)基因(一)操作方法及結(jié)果判斷Α.操作方法具體如下I、參照實(shí)施例I的方法，用攜帶有待測(cè)基因的真核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞(轉(zhuǎn)染方法為使用BTX公司的ΒΤΧ-Τ820方波電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)。具體操作為將3T3-L1細(xì)胞用無(wú)血清RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋為調(diào)細(xì)胞密度為6-10 X 106/ml，取350 μ I/樣品，加入IOyg質(zhì)粒DNA混勻。電轉(zhuǎn)條件為300V 5msο詳細(xì)方法參照Ma X，et al. , CREBL2, interactingwith CREB，induces adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. Biochem J.2011 Oct I； 439 (I) :27-38),轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h，采用“IBMX+胰島素+地塞米松”進(jìn)行3T3-L1細(xì)胞的三聯(lián)成脂誘導(dǎo)分化，其余步驟均與實(shí)施例I步驟相同。使用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為ΑΜΡΚ-α基因鑒定的陰性對(duì)照(記為P⑶B組)。2、參照實(shí)施例2的方法，用攜帶有待測(cè)基因的真核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞(轉(zhuǎn)染方法為使用BTX公司的ΒΤΧ-Τ820方波電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)。具體操作為將C2C12細(xì)胞稀釋為2 X IO6細(xì)胞/350 μ I不完全培養(yǎng)基，加入10 μ g質(zhì)粒DNA混勻。電轉(zhuǎn)條件為120V 20ms),轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2-3d，觀察C2C12細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)分化，其余步驟均與實(shí)施例2步驟相同。使用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為PGC-I α基因鑒定的陰性對(duì)照(記為P⑶B組)。3、步驟I和步驟2細(xì)胞分化結(jié)束后，分別收集細(xì)胞，按照如下方法提取總RNA :為防止RNA降解，在液氮中將樣品研磨至粉末，待液氮汽化后加入RNA提取試劑Trizol (每
O.Ig樣品加Iml Trizol )，室溫放置5分鐘，使組織和細(xì)胞充分裂解。12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄沉淀。按每Iml Trizol加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，振蕩混勻后室溫靜置15分鐘。在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分鐘尚心15分鐘,使油相與水相分尚，吸取上層水相(不要接觸一點(diǎn)油相)至另一離心管中。按每Iml Trizol加入O. 5ml異丙醇的比例加入異丙醇混勻，在室溫下靜置10分鐘使RNA沉淀。在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，只留沉于管底的RNA。按每Iml Trizol加入Iml乙醇的比例加入75%的乙醇，溫和振蕩離心管，使沉淀懸浮。在4°C條件下8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后，在避免丟失RNA沉淀的前提下盡量多地棄去上清液，然后將沉淀干燥，得到樣品RNA。4、mRNA反轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR :使用北京百泰克生物制品公司的2 X SYBRRT-PCR 試劑盒，按照使用說(shuō)明書(shū)提示的操作方法，在冰上配置PCR反應(yīng)液。主要組分為2 X Pr emi X IO μ I，上游引物(AI或PI)和下游引物(A2或P2 )各2 μ mo I，提取的總RNA模板
O.lng，然后使用滅菌蒸餾水將總體積補(bǔ)充至20 μ I。使用BioTek熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀，按照兩步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)程序。95°C起始模板變性2分鐘，然后進(jìn)行以下反應(yīng)25個(gè)循環(huán)95°C模板變性15秒，65°C退火延伸40秒。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR儀繪制的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，得出各個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的mRNA含量的相對(duì)值。其中，以18S rRNA為內(nèi)參對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。B.結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下經(jīng)步驟A中I和2的染色后，若所述待測(cè)基因同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則初步判斷所述待測(cè)基因?yàn)樨i優(yōu)良肉質(zhì)基因或候選為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因；接著進(jìn)行步驟A中3和4的基因表達(dá)檢測(cè)，若所述待測(cè)基因同時(shí)滿足如下c)和d)的條件，則可以確定證實(shí)所述待測(cè)基因?yàn)樨i優(yōu)良肉質(zhì)基因。經(jīng)步驟A中I和2的染色后，若所述待測(cè)基因不同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則判斷所述待測(cè)基因不為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因；經(jīng)步驟A中I和2的染色后，若所述待測(cè)基因在滿足如下a)和b)條件的前提下，進(jìn)一步進(jìn)行步驟A中3和4的基因表達(dá)檢測(cè)，但不同時(shí)滿足如下c)和d)的條件，則判斷所述待測(cè)基因可以候選為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因。a)所述待測(cè)基因抑制所述3T3-L1細(xì)胞在所述“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下的成脂分化；b)所述待測(cè)基因促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化。
c)和導(dǎo)入空質(zhì)粒組(P⑶B組)相比，將所述待測(cè)基因?qū)胨?T3-L1細(xì)胞后所述ΑΜΡΚ-α基因的表達(dá)量降低；d)和導(dǎo)入空質(zhì)粒組(P⑶B組)相比，將所述待測(cè)基因?qū)胨鯟2C12細(xì)胞后所述PGC-I α基因的表達(dá)量提高。(二)實(shí)際應(yīng)用DLKl 基因(pref-1 gene)是公認(rèn)的豬優(yōu)良肉質(zhì)基因(Smas CM, KachinskasD, Liu CM,Xie X,Dircks LK, Sul HS. Transcriptional control of thepref-1 gene in 3T3-Lladipocyte differentiation. Sequence requirementfor differentiation-dependent suppression.J Biol Chem.1998 Nov27; 273 (48) :31751-8.)，以下將以DLKl基因作為待測(cè)基因，驗(yàn)證步驟(一)所述方法的準(zhǔn)確性。攜帶有DLKl基因的真核重組表達(dá)載體具體為pcDNA3. I-DLKl (質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程詳見(jiàn)Yin D, Xie D, Sakajiri S，Miller Cff, Zhu H, Popoviciu ML, Said JW, Black KL, KoefflerHP. DLKl: increased expression in gliomas and associated with oncogenicactivities. Oncogene. 2006 Mar 23; 25 (13) : 1852-61.)。在重組表達(dá)載體 pcDNA3. 1-DLK1中啟動(dòng)所述待測(cè)基因DLKl基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為CMV啟動(dòng)子?；倦娹D(zhuǎn)步驟為用胰酶+EDTA消化細(xì)胞，無(wú)血清RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基洗細(xì)胞3遍，調(diào)細(xì)胞密度為6-10 X106/ml，取350 μ I/樣品。真核重組表達(dá)載體pcDNA3. I-DLKl的用量為10 μ g，采用2mm電轉(zhuǎn)杯，3T3-L1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件為300v，5ms ；C2C12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件為120v，20ms。電擊后，室溫靜置5_10分鐘，重鋪細(xì)胞于10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中。其余操作步驟參見(jiàn)步驟(一)。同時(shí)，對(duì)于3T3-L1細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化，以實(shí)施例I以三聯(lián)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的3T3-L1成脂分化細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照；以未經(jīng)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞作為陰性對(duì)照。對(duì)于C2C12細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)分化，以實(shí)施例2以馬血清方法誘導(dǎo)的C2C12成肌分化細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照；以未經(jīng)誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞作為陰性對(duì)照。每組處理兩個(gè)重復(fù)。誘導(dǎo)到時(shí)間后，其中一組執(zhí)行實(shí)施例I中的油紅O染色和蘇木素復(fù)染(3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化)或?qū)嵤├?中的吉姆薩染色(C2C12細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化)，然后在顯微鏡下采集代表性圖片；另外一組收集誘導(dǎo)后的3T3-L1細(xì)胞或C2C12細(xì)胞，按照步驟(一)中方法對(duì)ΑΜΡΚ-α和PGCl-α基因mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以陰性對(duì)照組AMPK-α或PGCl_a基因的表達(dá)量為I。
3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化的油紅O染色和蘇木素復(fù)染結(jié)果如圖I所示，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)入真核重組表達(dá)載體pcDNA3. I-DLKl的細(xì)胞被油紅O著色比例明顯降低，這表明DLKl基因相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，具有抑制前脂肪細(xì)胞成脂分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，在分化的3T3-L1細(xì)胞中，DLKl基因相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，抑制ΑΜΡΚ-α基因的表達(dá)，而對(duì)PGCl-α基因的表達(dá)沒(méi)有作用。C2C12細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化的吉姆薩染色結(jié)果如圖2所示，與陽(yáng)性對(duì)照組相類(lèi)似，轉(zhuǎn)入真核重組表達(dá)載體DLKl的C2C12細(xì)胞的形狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)部分(肌管)被染成紫藍(lán)色。這表明DLKl基因具有促進(jìn)前成肌細(xì)胞成肌分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-a基因mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，在分化的C 2C12細(xì)胞中，DLKI基因促進(jìn)PGCl-α基因的表達(dá)，而對(duì)AMPK-α基因的表達(dá)沒(méi)有作用。結(jié)合以上兩方面數(shù)據(jù)，可以看出一方面，DLKl基因可以通過(guò)激活成肌細(xì)胞中PGCl-α基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的成肌分化；另一方面，DLKl基因可以通過(guò)抑制成脂細(xì)胞中AMPK-α基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制機(jī)體脂肪細(xì)胞的成脂分化。因此，DLKl基因具有促進(jìn)動(dòng)物肌內(nèi)脂肪沉積的作用，因此可以鑒定DLKl基因?yàn)閷?duì)豬的優(yōu)良肉質(zhì)具有調(diào)控作用的基因。
權(quán)利要求
1.用于鑒定或輔助鑒定豬營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和豬肉質(zhì)基因的組合物，其特征在于所述組合物由3T3-L1細(xì)胞、C2C12細(xì)胞、特異于AMPK-a基因的引物對(duì)1，以及特異于PGC-I a基因的引物對(duì)2組成； 所述特異于AMPK-a基因的引物對(duì)I由序列表中序列I和序列2所不的兩條單鏈DNA組成；所述特異于PGC-I a基因的引物對(duì)2由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成。
2.含有權(quán)利要求I所述組合物的試劑盒。
3.權(quán)利要求I所述組合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權(quán)利要求I所述組合物中各細(xì)胞分別單獨(dú)包裝，以及將各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
4.權(quán)利要求3所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I所述組合物中各細(xì)胞分別單獨(dú)包裝，以及將所述組合物中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
5.用權(quán)利要求I所述組合物鑒定或輔助鑒定待測(cè)物質(zhì)是否為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)的方法，包括如下步驟將所述待測(cè)物質(zhì)分別與C2C12細(xì)胞和經(jīng)“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞共同孵育，檢測(cè)所述待測(cè)物質(zhì)是否抑制所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的成脂分化，檢測(cè)所述待測(cè)物質(zhì)是否促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化；若所述待測(cè)物質(zhì)同時(shí)滿足如下a)和b)對(duì)條件，則所述待測(cè)物質(zhì)為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或候選為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，若所述待測(cè)物質(zhì)不同時(shí)滿足如下a)和b)對(duì)條件，則所述待測(cè)物質(zhì)不為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì) a)所述待測(cè)物質(zhì)抑制所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的成脂分化； b)所述待測(cè)物質(zhì)促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟將所述待測(cè)物質(zhì)分別與所述C2C12細(xì)胞和所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞共同孵育后，利用所述引物對(duì)I檢測(cè)所述3T3-L1細(xì)胞與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后AMPK-a基因相對(duì)于所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞的表達(dá)量變化，利用所述引物對(duì)2檢測(cè)所述C2C12細(xì)胞與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后PGC-I a基因相對(duì)于所述C2C12細(xì)胞的表達(dá)量變化；若所述待測(cè)物質(zhì)同時(shí)滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)物質(zhì)為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，若所述待測(cè)物質(zhì)滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)物質(zhì)候選為豬肉質(zhì)改良的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì) c)和所述經(jīng)“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下3T3-L1細(xì)胞相比，與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后所述3T3-L1細(xì)胞中所述AMPK-a基因的表達(dá)量降低； d)和所述C2C12細(xì)胞比，與所述待測(cè)物質(zhì)孵育后所述C2C12細(xì)胞中所述PGC-Ia基因的表達(dá)量提聞。
7.用權(quán)利要求I所述組合物鑒定或輔助鑒定待測(cè)基因是否為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因的方法，包括如下步驟 (1)將所述待測(cè)基因分別導(dǎo)入3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞使其表達(dá)； (2)對(duì)所述3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)；(3)檢測(cè)所述待測(cè)基因是否抑制所述3T3-L1細(xì)胞在“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下的成脂分化，檢測(cè)所述待測(cè)基因是否促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化； (4)按照如下方法確定所述待測(cè)基因是否為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因若所述待測(cè)基因同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則所述待測(cè)基因?yàn)樨i優(yōu)良肉質(zhì)基因或候選為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因，若所述待測(cè)基因不同時(shí)滿足如下a)和b)的條件，則所述待測(cè)基因不為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因 a)所述待測(cè)基因抑制所述3T3-L1細(xì)胞在所述“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯(lián)誘導(dǎo)下的成脂分化； b)所述待測(cè)基因促進(jìn)所述C2C12細(xì)胞的成肌分化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟在權(quán)利要求7步驟(2)之后，同時(shí)利用所述引物對(duì)I檢測(cè)所述3T3-L1細(xì)胞中導(dǎo)入所述待測(cè)基因后AMPK- a基因相對(duì)于導(dǎo)入空質(zhì)粒組的表達(dá)量變化，利用所述引物對(duì)2檢測(cè)所述C2C12細(xì)胞中導(dǎo)入所述待測(cè)基因后PGC-I a基因相對(duì)于導(dǎo)入空質(zhì)粒組的表達(dá)量變化；若所述待測(cè)基因同時(shí)滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)基因?yàn)樨i優(yōu)良肉質(zhì)基因，若所述待測(cè)基因滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測(cè)基因候選為豬優(yōu)良肉質(zhì)基因 c)和導(dǎo)入空質(zhì)粒組相比，將所述待測(cè)基因?qū)胨?T3-L1細(xì)胞后所述AMPK-a基因的表達(dá)量降低； d)和導(dǎo)入空質(zhì)粒組相比，將所述待測(cè)基因?qū)胨鯟2C12細(xì)胞后所述PGC-Ia基因的表達(dá)量提高。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于將所述待測(cè)基因分別導(dǎo)入所述3T3-L1細(xì)胞和所述C2C12細(xì)胞的方法，為通過(guò)重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)將所述待測(cè)基因分別導(dǎo)入所述3T3-L1細(xì)胞和所述C2C12細(xì)胞； 所述將所述待測(cè)物質(zhì)分別與3T3-L1細(xì)胞和C2C12細(xì)胞共同孵育的時(shí)間為24_48h。
10.權(quán)利要求I所述組合物，或權(quán)利要求2所述試劑盒，或權(quán)利要求5-9中任一所述的方法在如下任一中的應(yīng)用 (a)研制能夠改善豬肉質(zhì)的飼料或飼料添加劑； (b)發(fā)掘能夠改善豬肉質(zhì)的基因； (c)培育肉質(zhì)改善的豬品種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定影響豬肉質(zhì)性狀的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)或/和豬肉質(zhì)調(diào)控基因的方法及組合物。本發(fā)明所提供的組合物由3T3-L1細(xì)胞、C2C12細(xì)胞、特異于AMPK-α基因的引物對(duì)，以及特異于PGC-1α基因的引物對(duì)組成；所述特異于AMPK-α基因的引物對(duì)和所述特異于PGC-1α基因的引物對(duì)分別由序列1和序列2、序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成。本發(fā)明有助于建立肌內(nèi)脂肪高效沉積、而腹部和皮下等部位脂肪顯著降低的優(yōu)良肉質(zhì)基因的核心豬群，引導(dǎo)規(guī)?；i場(chǎng)和散養(yǎng)戶采用促進(jìn)肉質(zhì)改良的飼料營(yíng)養(yǎng)組分、配方和飼喂模式，推動(dòng)養(yǎng)豬業(yè)在短時(shí)間內(nèi)，實(shí)現(xiàn)在高產(chǎn)基礎(chǔ)上，培育出高品質(zhì)豬肉的“優(yōu)質(zhì)”目標(biāo)。本發(fā)明對(duì)節(jié)約飼料成本，及我國(guó)地方豬種優(yōu)良肉質(zhì)基因資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)具有重要作用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102776280SQ201210194859
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者劉玫, 劉璐, 張倩, 李德發(fā), 胡聲迪, 馬曦 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)