專利名稱：一種柿子脫澀相關基因的克隆與瞬時表達方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及了柿子脫澀相關基因的克隆表達，以及柿葉片基因瞬時表達的體系建立。
背景技術：
柿原產(chǎn)中國，其味道鮮美，對人類健康良好，是東亞地區(qū)(中國，日本，韓國等)最受歡迎的水果之一，柿子的獨特之處在于其果實在發(fā)育期間能累積單寧(PAs)，單寧是高分子物質(zhì)，其中可溶性單寧是柿果實澀味的主要呈現(xiàn)物質(zhì)。
柿子根據(jù)其脫澀類型以及種子是否影響果實的澀味及顏色可以分為四類完全甜柿(PCNA);完全澀柿(PCA);非完全甜柿(PVNA);非完全澀柿(PVA)。甜柿果實發(fā)育早期喪失合成單寧的能力，故其在樹上能自然脫澀，成熟采收時果實不呈澀味，可直接食用；澀柿果實采后需經(jīng)脫澀處理后方可食用。柿果的脫澀研究已經(jīng)取得了很大的成功，例如樹上乙醇蒸氣包裹果實，高濃度的二氧化碳或氮氣處理，溫水浸泡或者交替凍融等都能完成脫澀。而且研究表明高濃度的二氧化氮處理能夠使柿果在脫澀的同時保脆。關于柿果脫澀的機制很早以前就有人開始研究了。已有研究報道，脫澀處理過程中伴隨著大量的乙醛累積。Matsuo和Ito (1977)提出二氧化碳脫澀處理中涉及了兩個相對獨立的過程。首先，果實在二氧化碳處理條件下通過無氧呼吸累積大量的乙醛。其次，乙醛與可溶性單寧結合成一種不澀的不溶性物質(zhì)，促使果實脫澀。Matsuo等(1991)也證明了無氧呼吸中產(chǎn)生的乙醛直接參與了柿子的脫澀。因此乙醛介導的可溶性單寧縮合反應是柿果實脫澀的核心。Yamada等(2002)研究認為，ADH和PDC是柿果實內(nèi)乙醛合成的關鍵酶，但至今為止，ADH和PDC兩基因在柿果實脫澀研究中的調(diào)控機制仍未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種柿子脫澀相關基因的克隆與瞬時表達方法，通過以下步驟實現(xiàn)
I.柿果實中ADH和PDC基因家族成員3’端序列的獲得
首先進行柿子組織(果肉，莖，葉，和花)RNA的提取，3’⑶NA和5’⑶NA逆轉(zhuǎn)錄得到⑶NA模板，通過查找NCBI數(shù)據(jù)庫上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成員序列，然后用ClustalX (V 1.81)軟件比對找到保守區(qū)間并在其間設計兼并引物(SEQ ID NO 1 ；SEQ IDNO :2)，克隆 2 個 ADH 基因部分編碼片段(SEQ ID NO :39 ;SEQ ID NO :40);
根據(jù)前面兼并克隆到的ADH編碼區(qū)片段以及NCBI上已公布的ADH和TOC基因家族EST序列，設計引物(SEQ ID NO :3 16),利用 3’RACE( rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技術體系，PCR擴增，片段回收，連接，轉(zhuǎn)化，涂板，送測，最終分別獲得了 3個ADH和4個PDC基因家族成員的3’端序列(SEQ ID NO :41 47)。2.柿果實中ADH和PDC基因家族成員在柿果實脫澀處理中的基因表達分析首先完成柿子二氧化碳和乙烯脫澀處理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步驟2中得到的3’端序列的UTR區(qū)設計特異引物(SEQ ID NO :17 30)，引物特異性檢測，熔點曲線分析、凝膠電泳分析和定量PCR產(chǎn)物再測序確認序列的正確性。實時定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成員在處理與對照中的表達模式。3、柿果實中ADH和PDC基因家族成員全長序列的獲得以及柿葉片瞬時表達體系構建根據(jù)獲得的3’端序列設計5’RACE引物(SEQ ID NO :31 34)，以步驟I中得到的5’RACEQ)NA為模板,利用5’RACE ( rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技術體系,最終分別獲得了 I個ADH和I個TOC 5’端序列。分別設計跨起始子和終止子的上游引物和下游引物(SEQ ID NO :35 38)，以步驟2中得到的CDNA為模板，克隆并得到ADH和PDC的全長基因(SEQ ID NO 48 ；SEQ ID NO 49),選取公司返回的帶有ADH和TOC的全長基因的質(zhì)粒用于下面的雙酶切，構建表達載體，電導轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌制備，甘油菌零下80°C保存，將保存的甘油菌接種至LB (kan50)平板，28 0C培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)移至新的LB (kan50)平
板培養(yǎng)I天(帶至北京)，實驗的前一天，再轉(zhuǎn)移至新LB平板培養(yǎng)，帶至實驗現(xiàn)場(北京房山磨盤柿第一村)將LB (kan50)平板上的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到裝有注射的50ml的離心管里(注·射液配制10 mM MgCl2和O. 5 mM乙酰丁香酮)，搖勻。選擇成熟度一致的“磨盤柿”葉片，葉片背面以葉脈為對稱軸，兩邊分別注射帶有SK和目的基因(DkADHl (SEQ ID NO 48)或DkPDC2 (SEQ ID NO :49)基因)的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液。三天后采摘葉片，帶回實驗室，沿葉片注射的邊緣剪下，用液氮速凍分別取樣。樣品保存在零下80°C下供下一步實驗用。每個基因各注射10片柿葉。對樣品進行可溶性單寧含量測定，分析葉片瞬時表達的效應。本發(fā)明利用擬南芥和番茄等其他植物上已知的乙醇脫氫酶和丙酮酸脫氫酶基因堿基序列，在相對保守區(qū)域設計兼并引物克隆ADH和PDC部分編碼區(qū)，結合NCBI上公布的柿子ADH和PDC基因的EST序列，再利用3’RACE技術克隆出ADH和PDC基因的3’端序列，在3’端序列的UTR區(qū)設計特異引物，進行ADH和PDC基因家族各成員的表達分析，然后利用5’RACE技術克隆出ADH和PDC基因的全長序列，表達載體構建，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，進而進行了柿子葉片的瞬時表達驗證基因功能。本發(fā)明方法是克隆出柿子脫澀相關的基因家族成員，分析這些家族成員在柿子脫澀處理中的表達模式，最后通過柿子葉片的瞬時表達驗證目的基因的功能。這從分子機制上闡明了柿子采后脫澀的調(diào)控機制，有利用進一步開展柿子采后脫澀機制的功能驗證(轉(zhuǎn)基因，基因互作等)研究。


圖I是柿子果實中ADH基因家族成員在柿果實二氧化碳脫澀處理中的基因表達模式。圖2是柿子果實中PDC基因家族成員在柿果實二氧化碳脫澀處理中的基因表達模式。圖3是柿子果實中ADH基因家族成員在柿果實乙烯脫澀處理基因表達模式。圖4是柿子果實中PDC基因家族成員在柿果實乙烯脫澀處理基因表達模式。圖5是柿子葉片瞬時表達結果柿子葉片可溶性單寧含量分析。
具體實施例方式下面結合具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步闡述，但實施例不限制本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實驗指南》(第三版)。
實施例I :實時定量熒光PCR分析柿子中ADH和PDC家族成員不同處理中的表達模式；
(一)實驗方法
I、柿子果實總RNA提取
在設計好的取樣點，對照，乙烯和二氧化碳處理的果實果肉分別用液氮冷凍，保存于-80°C。提取RNA時,稱取2g凍樣加液氮充分研磨后,分別加入兩管加有4ml β -巰基乙醇/CTAB (80ul/4ml)提取緩沖液的離心管中，65°C加熱，渦旋混合使細胞徹底破裂，65°C再次加熱l_2min ;然后往離心管中加入4ml氯仿異戊醇(24 :1)抽提液，迅速渦旋混合均勻；15°C IOOOOrpm離心IOmin,吸取上清液到新的離心管,用氯仿異戍醇(24 1)重新抽提一次，吸取上清液約3ml，兩管合一管，加入1/4體積的lOmol/Ι的LiCl2,4°C冰箱過夜；40C IOOOOrpm離心30min，倒掉上清液，將離心管再次短暫離心一下，吸掉底部多余的溶液，加入400 μ I 65°C SSTE，用手指彈動管壁使沉淀充分溶解，將液體轉(zhuǎn)入到I. 5ml離心管中，再加入400 μ I氯仿異戍醇(24 1)抽提液,潤旋混合；2(TC IOOOOrpm離心IOmin,吸取 上清液到新的離心管中，加入2倍體積的_20°C預冷的無水乙醇，上下顛倒混勻，_80°C放置30min-lhour ；4°C IOOOOrpm離心20min，倒掉上清液，短暫離心后吸出殘余液體，將沉淀在通風櫥晾干(約IOmin);每管加入15-30 μ I DEPC水溶解沉淀，得到粗RNA樣品；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得樣品質(zhì)量，好的RNA結果顯示樣品有兩條帶，亮度為上條下條 2 :1。用紫外分光光度計檢測所得樣品純度，吸取1μ I RNA樣品加入69μ I DEPC水混合均勻，檢測OD26tl和OD28tl,分析得到OD26tZOD28tl=L 8-2. O,說明RNA純度符合標準。根據(jù)公式OD26tlX 40(RNA濃度系數(shù))Χ70 (樣品稀釋倍數(shù))即可計算出樣品RNA的濃度(ng/μ 1)，以備下一步實驗用。2、柿子ADH和PDC家族成員表達模式分析
首先米用 TURBO DNase (Ambion, Applied Biosystems)去除基因組 DNA 污染，米用iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;然后將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA吸取5 μ I稀釋10倍，內(nèi)參基因的上下游擴增引物DkACtin-FP和DkACtin-RP分別稀釋至成 2. 5 μ M ;將 SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (10 μ I/ 每反應)、DkACtin_FP (I μ I/每反應)和DkACtin-RP (I μ I/每反應)，水(6 μ I/每反應)配制成混合工作液，充分混勻，分裝到每個反應管；再于各反應管內(nèi)加入對應的稀釋10倍的cDNA模板(2 μ I);短暫離心將反應液收集于管底，進行Q-PCR ;反應程序為95°C預變性3min ;95°C變性10sec，60°C退火30sec，95°C延伸10sec，45個熱循環(huán)；熔解曲線分析65°C到95°C。根據(jù)每個模板對應的Ct值(Cycle threshold),再次對模板原液進行調(diào)整，使所有模板Ct值均為23_24之間。將柿子ADH和PDC各家族成員實時定量PCR引物分別稀釋至2. 5 μ M，按照前面DkACtin基因的方法配制工作液，⑶NA模板為調(diào)整好的CT值的工作液，每個模板都要設置ACtin對照基因和陰性對照。Q-PCR程序與之前一致；反應結束后，根據(jù)每個模板得到的Ct值，運用公式2-(et2-etl)即可得到該基因的相對表達量。(二)實驗結果
2、實時定量熒光PCR結果顯示，在二氧化碳處理和乙烯處理中DkADHl (SEQ ID NO:41)和DkPDCl (SEQ ID NO 44),DkPDC2 (SEQ ID NO :45)與果實的澀味脫除成正相關，即隨著柿果實脫澀處理的進行，可溶性單寧逐漸變低，DKADHl (SEQ ID NO :41)和DkPDCl (SEQID NO 44),DkPDC2 (SEQ ID NO :45)的相對表達量逐漸上升，處理移除后，再有不同程度的下調(diào)(圖1，圖2，圖3，圖4)。實施例2 :柿葉片瞬時表達體系構建。(一)實驗方法柿果實中ADH和PDC基因家族成員全長序列的獲得
首先根據(jù)獲得的3’端序列設計5’ RACE引物，以5’ RACE CDNA為模板，利用5’ RACE(rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技術體系，最終獲得了 ADH和F1DC基因家族成員5’端序列。然后以5’端序列為模板，分別設計跨起始子和終止子的上游引物和下游引物，以組織CDNA為模板，PCR反應體系模板CDNA: lul, DNTP mix (2. 5mM) : I. 6ul，上游引物(IOmM) :O. 8ul,下游引物(IOmM) :O. 8ul, Pyrobest DNA Polymerase: O. lul,IOXpyrobest Buffer: 2. Oul，DEPC 水13. 7ul。通過 PCR 擴增94°C 預變性 5min，35個循環(huán)(95°C 30 s，55°C 30 s，72V 180s)，最后72°C延伸10m，回收PCR目的產(chǎn)物，回收產(chǎn)物加 A,步驟如下10XA-Tail Buffer 2. 5ul, DNTP mixture (2. 5mM) 2ul, A-TailingEnzyme :0. 25ul。然后把上述回收到的DNA片段2. 5ul，DEPC水17. 25ul混合均勻，72°C·20min,冰上 2min。產(chǎn)物連接到 pGEM-Teasy 載體(Promega, A1360)上，連接體系2XRapidLigation Buffer 5uI,PGEM-T EASY Vetor :lul,上述產(chǎn)物3ul, T4 DNA ligase lul。4°C連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞中，進行抗性篩選，菌液檢測，將連有目的片段的單菌落搖送公司測序(Invitrogen),序列分析并確認ADH和F1DC的全長基因。柿葉片瞬時表達體系構建柿葉片瞬時表達載體構建選取公司返回的正確的質(zhì)粒用于下面的雙酶切，雙酶切體系Notl lul ；Spel lul ；10XH Buffer 2ul ；0. 1%BSA 2ul ;質(zhì)粒3ul ;DEPC水llul。酶切產(chǎn)物電泳檢測，回收。連接體系酶切后的pGreenll0029 62-SK :lul，酶切后的質(zhì)粒4ul，Solution :5ul。4°C連接過夜，產(chǎn)物電導轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，涂板，抗性篩選，單菌落菌液檢測，選擇轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌加1:1的甘油，零下80°C保存，待下一步實驗用。將上述保存的甘油菌接種至LB (kan50)平板，28 0C培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)移至新的LB(kan50)平板培養(yǎng)I天(帶至北京)，實驗的前一天，再轉(zhuǎn)移至新平板培養(yǎng)，帶至實驗現(xiàn)場(北京房山磨盤柿第一村)，將LB(kan50)平板上的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到裝有注射液(10 mM MgCl2 ；0. 5mM acetosyringone 50ml)的離心管里充分搖勻。選擇成熟度一致的磨盤柿葉片，葉片背面以葉脈為對稱軸，兩邊分別注射帶有SK和目的基因(DkADHl (SEQ ID NO 48) *DkPDC2SEQ ID NO :49)的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液，每個基因各注射10片柿葉，三天后采摘葉片，帶回實驗室，沿葉片注射的邊緣剪下，用液氮速凍分別取樣。樣品保存在零下80°C下，對樣品進行可溶性單寧含量測定，分析葉片瞬時表達的效應(參見圖5)。對于本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種柿子脫澀相關基因的克隆與瞬時表達方法，通過以下步驟實現(xiàn) (1)柿果實中ADH和PDC基因家族成員3’端序列的獲得首先進行柿子組織RNA的提取，3’⑶NA和5’⑶NA逆轉(zhuǎn)錄得到⑶NA模板，通過查找NCBI數(shù)據(jù)庫上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成員序列，然后用ClustalX v I. 81軟件比對找到保守區(qū)間并在其間設計兼并引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，克隆2個ADH基因部分編碼片段SEQ ID NO:39和SEQ ID NO 40 ;根據(jù)前面兼并克隆到的ADH編碼區(qū)片段以及NCBI上已公布的ADH和PDC基因家族EST序列，設計引物SEQ ID NO :3 16，利用3，RACE克隆技術體系，PCR擴增，片段回收，連接，轉(zhuǎn)化，涂板，送測，最終分別獲得了 3個ADH和4個PDC基因家族成員的3’端序列 SEQ ID NO :41 47 ； (2)柿果實中ADH和PDC基因家族成員在柿果實脫澀處理中的基因表達分析首先完成柿子二氧化碳和乙烯脫澀處理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步驟(2)中得到的3’端序列的UTR區(qū)設計特異引物SEQ ID NO : 17 30，引物特異性檢測，熔點曲線分析、凝膠電泳分析和定量PCR產(chǎn)物再測序確認序列的正確性，實時定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成 員在處理與對照中的表達模式； (3)柿果實中ADH和PDC基因家族成員全長序列的獲得以及柿葉片瞬時表達體系構建根據(jù)獲得的3’端序列設計5’ RACE引物SEQ ID NO :31 34，以步驟(I)中得到的5’ RACECDNA為模板，利用5’RACE克隆技術體系，最終分別獲得I個ADH和I個TOC 5’端序列，分別設計跨起始子和終止子的上游引物和下游引物，SEQ ID NO :35 38，以步驟(2)中得到的CDNA為模板，克隆并得到ADH和PDC的目的基因SEQ ID N0:48和SEQ ID NO 49,選取公司返回的帶有ADH和roc的全長基因的質(zhì)粒用于下面的雙酶切，構建表達載體，電導轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌制備，甘油菌零下80°C保存，將保存的甘油菌接種至kan50的LB平板，28 0C培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)移至kan50的LB平板培養(yǎng)I天，實驗的前一天，再轉(zhuǎn)移至新的LB平板培養(yǎng)，再將kan50的LB平板上的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到裝有注射夜的離心管里，搖勻，選擇成熟度一致的“磨盤柿”葉片，葉片背面以葉脈為對稱軸，兩邊分別注射帶有SK和目的基因SEQ ID N0:48或SEQ ID NO:49的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液，三天后采摘葉片，帶回實驗室，沿葉片注射的邊緣剪下，用液氮速凍分別取樣，樣品保存在零下80°C下供下一步實驗用，每個基因各注射10片柿葉，對樣品進行可溶性單寧含量測定，分析葉片瞬時表達的效應。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種柿子脫澀相關基因的克隆與瞬時表達方法，其特征在于，步驟(I)所述的柿子組織包括果肉，莖，葉，和花。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種柿子脫澀相關基因的克隆與瞬時表達方法，其特征在于，步驟(3)所述注射液由10 mM MgCl2和0.5 mM乙酰丁香酮配制而成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種柿子脫澀相關基因的克隆與瞬時表達方法，通過先獲得基因3’端序列，再通過3'RACE技術獲得柿果實中ADH和PDC基因家族成員3’端序列；采用Q-PCR技術分析ADH和PDC基因家族成員在柿果實脫澀處理中的基因表達；分離得到柿果實中ADH和PDC基因家族成員全長序列，然后建立柿葉片瞬時表達體系。本發(fā)明方法是克隆出柿子脫澀相關的基因家族成員，分析這些家族成員在柿子脫澀處理中的表達模式，最后通過柿子葉片的瞬時表達驗證目的基因的功能，從分子機制上闡明了柿子采后脫澀的調(diào)控機制，有利用進一步開展柿子采后脫澀機制的轉(zhuǎn)基因，基因互作等功能驗證研究。
文檔編號C12N15/10GK102732536SQ20121019542
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權日2012年6月14日
發(fā)明者孫崇德, 殷學仁, 閔婷, 陳昆松 申請人:浙江大學