專利名稱：消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而表達(dá)外源多肽的方法。
背景技術(shù)：
甲醇營養(yǎng)型酵母(包括Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis 等)表達(dá)系統(tǒng)由于其高效的外源多肽表達(dá)能力已經(jīng)在工業(yè)生產(chǎn)、制藥等領(lǐng)域被非常廣泛的運(yùn)用。其特點(diǎn)在于，它們擁有能夠被甲醇高效誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(A0X1啟動(dòng)子、DHAS啟動(dòng)子、FDH啟動(dòng)子、MOX啟動(dòng)子、A0X2啟動(dòng)子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-啟動(dòng)子等)，并且這些啟動(dòng)子嚴(yán)格依賴甲醇，其它碳源(如葡萄糖，甘油等)會(huì)抑制這些啟動(dòng)子的表達(dá)。隨著石油危機(jī)的爆發(fā)，利用甲醇生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，成本變高。之所以利用甲基營 養(yǎng)型母酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)如此之多的外源多肽，是因?yàn)槠渚哂衅渌磉_(dá)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢基因操作簡單，外源多肽表達(dá)量高，既可以胞內(nèi)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)；外源多肽基因遺傳穩(wěn)定；作為真核表達(dá)系統(tǒng)，具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；⒌鞍琢姿峄确g后修飾加工功能；由于被利用的范圍越來越廣，在實(shí)際的發(fā)酵放大過程中遇到很多問題(1)表達(dá)所用的啟動(dòng)子需要甲醇的誘導(dǎo)，甲醇有毒易燃，在大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵中需要進(jìn)行特別的防暴設(shè)計(jì)；(2)甲醇發(fā)酵強(qiáng)耗氧，一般靠增大空氣的通氣量和提高轉(zhuǎn)速很難滿足氧氣的需求而需要通純氧，甲醇代謝需要氧氣的量是葡萄糖為碳源所需氧氣量的三至四倍。消耗的甲醇越多需要的純氧越多，這給實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)帶來很大的麻煩。另外消耗的甲醇越多所產(chǎn)的熱量也越大，所需設(shè)備的冷卻能力要求越高；(3)甲醇作為一種石油化學(xué)產(chǎn)品，不適合于一些食品領(lǐng)域添加劑的生產(chǎn)；(4)甲醇代謝會(huì)產(chǎn)生H2O2，會(huì)導(dǎo)致所表達(dá)多肽的水解。因此，如果得到一種能夠利用非甲醇誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)的方法，使原本依賴甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的高效轉(zhuǎn)錄不依賴于甲醇，而可用其他碳源來誘導(dǎo)這些啟動(dòng)子的表達(dá)，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)工業(yè)上利用非甲醇高效表達(dá)外源多肽具有積極意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽的方法。本發(fā)明的另一目的還在于提供重組的甲醇營養(yǎng)型酵母，其可以利用消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性來表達(dá)外源多肽。在本發(fā)明的第一方面，提供一種消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)外源多肽編碼基因表達(dá)的方法，包括(I)提供甲醇營養(yǎng)型酵母，所述甲醇營養(yǎng)型酵母含有表達(dá)盒1，其表達(dá)外源的Mitl多肽；以及表達(dá)盒2，包括甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及與之操作性連接的外源多肽編碼基因；
(2)在無甲醇條件或非單一甲醇碳源條件下培養(yǎng)(I)的甲醇營養(yǎng)型酵母。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的Mitl多肽是轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)因子，使得原本依賴甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子不再依賴甲醇也可表達(dá)外源多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的Mitl多肽的功能為激活甲醇代謝中需要甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的Mitl是PpMitl。在另一優(yōu)選例中，所述表達(dá)盒2在甲醇營養(yǎng)型酵母中以單拷貝或多拷貝存在，例如 1-20 拷貝，如 15，10，8，6，5，3，2 拷貝。 在另一優(yōu)選例中，所述的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括(但不限于)A0X1啟動(dòng)子、DHAS啟動(dòng)子、DAS啟動(dòng)子、FDH啟動(dòng)子、FMDH啟動(dòng)子、MOX啟動(dòng)子、A0X2啟動(dòng)子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-啟動(dòng)子、PMP20啟動(dòng)子、PMP47啟動(dòng)子、AODl啟動(dòng)子、A0D2啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，所述的甲醇營養(yǎng)型酵母包括(但不限于)畢赤酵母(Pichia),漢遜酵母(Hansenula),假絲酵母(Candida),球擬酵母(Torulopsis);較佳地，所述的畢赤酵母(Pichia)包括(但不限于)GS115，MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母(Amigl Amig2)，NRGl基因、MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母(Amigl Amig2 Δ nrgl),或HXSl基因不表達(dá)的畢赤酵母菌株。在另一優(yōu)選例中，述的Mitl多肽選自下組(a) SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1_30個(gè)，更佳地1_20個(gè)，更佳地1-15個(gè)，更佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)或1-3個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有利用非甲醇碳源誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)與(a)限定的序列在具有70%以上(較佳地80%以上，更佳地90%以上，更佳地95%以上，更佳地98%以上，如99%或更高)的序列相同性的，且具有利用非甲醇碳源誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽功能的由(a)衍生的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的Mitl多肽的編碼基因的NCBI Reference Sequence為XM_002493021. I。在另一優(yōu)選例中，所述的Mitl多肽的編碼基因具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的Mitl多肽的編碼基因在甲醇存在的情況下誘導(dǎo)表達(dá)，在甘油、葡萄糖等碳源存在的情況下不表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒I中，包括啟動(dòng)子以及與之操作性連接的Mitl多肽的編碼基因；較佳地，該啟動(dòng)子包括(但不限于)組成型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，組織或器官特異性啟動(dòng)子，時(shí)空特異性表達(dá)啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，表達(dá)盒I中，所述啟動(dòng)子包括(但不限于)GAP啟動(dòng)子、PGKl啟動(dòng)子、MITl啟動(dòng)子等任意能使MITl過表達(dá)的啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒I在甲醇營養(yǎng)型酵母中以單拷貝或多拷貝存在，例如1-20拷貝，如15，10，8，6，5，3，2拷貝。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用存在甘油和/或葡萄糖的酵母培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的另一方面，提供Mitl多肽或其編碼基因的用途，用于消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)外源多肽編碼基因表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組的甲醇營養(yǎng)型酵母，所述甲醇營養(yǎng)型酵母含有表達(dá)盒1，其能夠表達(dá)外源的Mitl多肽；以及表達(dá)盒2，包括甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及與之操作性連接的外源多肽編碼基因。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的甲醇營養(yǎng)型酵母包括(但不限于)畢赤酵母(Pichia),漢遜酵母(Hansenula),假絲酵母(Candida),球擬酵母(Torulopsis);較佳地，所述的畢赤酵母(Pichia)包括(但不限于)GS115，MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母(Amigl Amig2)，NRGl基因、MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母(Amigl Amig2 Δ nrgl),或HXSl基因不表達(dá)的畢赤酵母菌株。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的所述的MIGl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述的MIG2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；或所述的HXSl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。所述的NRGl基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示(NCBI ReferenceSequence:XM_002493138. I)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、pGAPZ a A的質(zhì)粒圖譜示意圖。圖2、載體pAG32的質(zhì)粒圖譜示意圖。圖3、野生型及GS115-MIT1分別在非甲醇或含甲醇(甘油+甲醇)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行Aox顯色反應(yīng)的結(jié)果。圖4、野生型及GS115-MIT1分別在非甲醇或含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行Aox酶活測定的結(jié)果。圖5、菌株GS115-MIT1-GFP在YND液體培養(yǎng)基中過夜預(yù)培養(yǎng)，然后分別轉(zhuǎn)移至非甲醇或含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣后用流式細(xì)胞儀檢測樣品中GFP的幾何平均熒光強(qiáng)度。圖6、野生型及Amigl Amig2-MIT1和Δ hxsl-MITl菌株分別在非甲醇或含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到對(duì)數(shù)生長期后取樣lml，在離心后的菌體中加入Aox酶活顯色液顯色。圖7、野生型及Amigl Amig2-MIT1和Δ hxsl_MITl菌株分別在非甲醇或含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到對(duì)數(shù)生長期后取樣提取總蛋白，經(jīng)Bradford法蛋白定量后進(jìn)行Aox酶活的測定。圖8、野生型及Amigl Amig2-MIT1和Δ hxsl-ΜΙΤΙ菌株分別在非甲醇或含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣后用流式細(xì)胞儀檢測樣品中GFP的幾何平均熒光強(qiáng)度。圖9、載體pPIC3. 5K的質(zhì)粒圖譜示意圖。圖10、載體pUC18的質(zhì)粒圖譜示意11、野生型及Amigl Amig2 Anrgl-MITl菌株分別在非甲醇或含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到對(duì)數(shù)生長期后取樣提取總蛋白，經(jīng)Bradford法蛋白定量后進(jìn)行Aox酶活的測定。圖12、野生型及Amigl Amig2 Anrgl-MITl菌株分別在非甲醇或含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣后用流式細(xì)胞儀檢測樣品中GFP的幾何平均熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式為了克服目前甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在發(fā)酵時(shí)對(duì)于甲醇誘導(dǎo)的依賴性，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，揭示了一種消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性的方法，通過在甲醇營養(yǎng)型酵母細(xì)胞內(nèi)增加Mitl (甲醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子I ^ethanol Induced TranscriptionFactor I)多肽的表達(dá)量，激活甲醇代謝中需要單一甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)，以此使得原本依賴甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子不再依賴甲醇也可表達(dá)外源多肽。術(shù)語 如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5，端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。在本文中，所述的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)包括啟動(dòng)子的活性變異體，該變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。所述變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本文所用，所述的“甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”是與甲醇代謝有關(guān)的酶的啟動(dòng)子。在現(xiàn)有技術(shù)中，這些啟動(dòng)子通過向生長培養(yǎng)基中添加甲醇，可以控制外源多肽由所述啟動(dòng)子的表達(dá)。所述的“甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)從酵母中分離獲得。如本文所用，所述的“單一甲醇(碳源)誘導(dǎo)”是指啟動(dòng)子需要以甲醇為唯一碳源進(jìn)行誘導(dǎo)來驅(qū)動(dòng)與之操作性連接的基因的表達(dá)，在非甲醇為唯一碳源(如甲醇+葡萄糖)的條件下不能驅(qū)動(dòng)與之操作性連接的基因的表達(dá)。所述的“消除單一甲醇誘導(dǎo)”是指使得啟動(dòng)子在不以甲醇為唯一碳源(如甲醇+葡萄糖，或葡萄糖，或甘油)的條件下就可驅(qū)動(dòng)與之操作性連接的基因的表達(dá)?！胺菃我患状?碳源)誘導(dǎo)”是指除了甲醇碳源外，還存在至少一種非甲醇的碳源。如本文所用，所述的“組成型啟動(dòng)子”是指在其調(diào)控下不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒有明顯差異的一類啟動(dòng)子。如本文所用，所述的“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”可根據(jù)需要在特定細(xì)胞生長階段或特定生長環(huán)境下，快速誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的“開”與“關(guān)”或者“高”與“低”。根據(jù)來源，可將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子分為天然存在的啟動(dòng)子和人工構(gòu)建的啟動(dòng)子。如本文所用，所述的“組織或器官特異性啟動(dòng)子”是指基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中的啟動(dòng)子。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于該目的基因來說是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。如本文所用，所述的“表達(dá)盒”是指包含有表達(dá)目的多肽(本發(fā)明中為外源多肽或Mitl多肽)所需的所有必要元件的基因表達(dá)系統(tǒng)，通常其包括一下元件啟動(dòng)子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號(hào)肽編碼序列等。這些元件是操作性相連的。如本文所用，所述的“甲醇營養(yǎng)型酵母”是指可利用甲醇作為唯一碳源的酵母。包括來自漢遜酵母屬(Hansenula),畢赤酵母屬(Pichia),球擬酵母屬(Torulopsis),假絲酵母屬(Candida)等的酵母。如本文所用，所述的“可操作性連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指(I)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O. 2 X SSC, O. 1%SDS, 600C ;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，O. 1%小牛血清/0. l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。Mitl 多肽本發(fā)明揭示了 Mitl多肽在消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)外源多肽編碼基因表達(dá)中的應(yīng)用。在對(duì)依賴甲醇控制外源多肽表達(dá)的啟動(dòng)子(甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的研究工作中，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)Mitl多肽可以解除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)于甲醇的依賴性，使其可利用非單一甲醇碳源或非甲醇碳源進(jìn)行外源多肽的表達(dá)。本發(fā)明還包括所述的Mitl多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的MITl多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或
(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“Mitl多肽”指具有利用非甲醇碳源誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽功能的SEQ ID N0:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有利用非甲醇碳源誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽功能的、SEQ ID N0:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)或1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又t匕如，在C末端和/或N末端添加或減少一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與編碼Mitl多肽的DNA雜交的DNA所編碼的多肽、以及利用抗Mitl多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含Mitl多肽或其片段的融合多肽。本發(fā)明還提供Mitl多肽或多肽的類似物。這些類似物與天然Mitl多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明Mitl多肽或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或 人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO: I序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:2序列或其變異形式的蛋白，但與SEQ IDNO: I中的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述多核苷酸同源的多核苷酸，它們是與上述多核苷酸具有至少50%，較佳地至少60%，更佳地至少70%，更佳地至少80%相，更佳地至少90% ;更佳地至少95% ;更佳地至少98%或99%相同性的多核苷酸。這些多核苷酸所編碼的蛋白也具有與前述多核苷酸所編碼的多肽相同的利用非甲醇碳源誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽的功倉泛。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。本發(fā)明的Mitl多肽核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，可進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。本發(fā)明中，編碼Mitl多肽的多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含Mitl多肽編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。增加Mitl多肽表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可通過轉(zhuǎn)入攜帶Mitl多肽編碼基因的表達(dá)構(gòu)建物使酵母細(xì)胞過表達(dá)Mitl多肽；或可通過用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)Mitl多肽的表達(dá)；或者通過增強(qiáng)子來增強(qiáng)該Mitl多肽的表達(dá)。甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
在現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)中，所述的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子依賴于在培養(yǎng)基中添加甲醇，從而控制外源多肽由所述啟動(dòng)子的表達(dá)。而本發(fā)明人利用Mitl多肽解除了甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)于甲醇的依賴。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉甲醇依賴型啟動(dòng)子，可使用常規(guī)技術(shù)從酵母中分離獲得。由于甲醇依賴型啟動(dòng)子具有基本相同的工作機(jī)制和工作原理，本發(fā)明對(duì)于甲醇依賴型啟動(dòng)子的種類沒有特別的限制。例如，所述的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于=AOXl啟動(dòng)子、DHAS啟動(dòng)子(或者DAS啟動(dòng)子)、FDH啟動(dòng)子(或者FMDH啟動(dòng)子)、MOX啟動(dòng)子、A0X2啟動(dòng)子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-啟動(dòng)子、PMP20 啟動(dòng)子、PMP47 啟動(dòng)子、AODl 啟動(dòng)子、A0D2 啟動(dòng)子。本發(fā)明還包括與上述啟動(dòng)子的多核苷酸序列具有至少70%,更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子在引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的位置上是嚴(yán)格保守的。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述甲醇依賴型啟動(dòng)子的核苷酸序列可雜交的多核苷酸，且該多核苷酸也具有野生型甲醇依賴型啟動(dòng)子的功能。消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)外源多肽編碼基因表達(dá)的方法本發(fā)明還提供了一種消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)外源多肽編碼基因表達(dá)的方法，包括(I)提供甲醇營養(yǎng)型酵母，所述甲醇營養(yǎng)型酵母含有表達(dá)盒1，其能夠表達(dá)外源的Mitl多肽；以及表達(dá)盒2，包括甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及與之操作性連接的外源多肽編碼基因；(2)在無甲醇條件或非單一甲醇碳源條件培養(yǎng)(I)的甲醇營養(yǎng)型酵母。所述的表達(dá)盒I和表達(dá)盒2可以存在于同一表達(dá)載體中，也可以存在于不同的表達(dá)載體中。所述表達(dá)盒I在甲醇營養(yǎng)型酵母中以單拷貝或多拷貝存在，例如1-20拷貝，如15，10，8，6，5，3，2拷貝。所述的表達(dá)盒2在甲醇營養(yǎng)型酵母中也可以單拷貝或多拷貝存在，例如 1-20 拷貝，如 15，10，8，6，5，3，2 拷貝。所述的表達(dá)盒2中，包括啟動(dòng)子以及與之操作性連接的Mitl多肽的編碼基因。應(yīng)理解，任何可使得Mitl多肽在甲醇營養(yǎng)型酵母中重組表達(dá)的啟動(dòng)子都可用于本發(fā)明。不限于組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或特異性啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所需達(dá)到的目的進(jìn)行合適的選擇，例如當(dāng)希望通過一定的條件干預(yù)來控制Mitl多肽的表達(dá)或不表達(dá)，則可以選擇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。較佳地，表達(dá)盒2中，所述啟動(dòng)子包括GAP啟動(dòng)子、PGKl啟動(dòng)子、MITl啟動(dòng)子等任意能夠使得MITl過表達(dá)的啟動(dòng)子。步驟(2)中，“無甲醇的條件”是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于建立的，也即，在常規(guī)應(yīng)用的甲醇營養(yǎng)型酵母培養(yǎng)基中，不加入甲醇作為碳源，取代以其它類型的碳源，常用的碳源是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如但不限于甘油、葡萄糖、淀粉(含淀粉水解液，木薯淀粉，玉米淀粉，纖維素類水解液等)、蔗糖、麥芽糖等。較佳地，采用以甘油和/或葡萄糖為碳源的酵母培養(yǎng)基。類似地，“非單一甲醇碳源條件”也是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于建立的。 重組甲醇營養(yǎng)型酵母基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了一種重組的甲醇營養(yǎng)型酵母，所述甲醇營養(yǎng)型酵母含有表達(dá)盒1，其能夠表達(dá)外源的MITl多肽；以及表達(dá)盒2，包括甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及與之操作性連接的外源多肽編碼基因。附加條件是，所述的表達(dá)盒I和表達(dá)盒2可以存在于同一表達(dá)載體中，也可以存在于不同的表達(dá)載體中。任何甲醇營養(yǎng)型酵母均可被應(yīng)用于本發(fā)明中，以構(gòu)建上述重組的甲醇營養(yǎng)型酵母。例如，所述的甲醇營養(yǎng)型酵母包括但不限于畢赤酵母(Pichia)，漢遜酵母(Hansenula),假絲酵母(Candida),球擬酵母(Torulopsis);較佳地，所述的畢赤酵母(Pichia)包括GS115，MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母(Λ migl Λ mig2)，NRGl基因、MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母(AmiglAmig2Anrgl)，或基因HXSl不表達(dá)的畢赤酵母菌株。
在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，提供了四株能夠利用非甲醇碳源誘導(dǎo)AOXl啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽的菌株，GS115-MIT1、Amigl Amig2-MITU Ahxsl-MITl 和Amigl Amig2 Anrgl-MITl0在畢赤酵母野生菌株GS115、畢赤酵母雙缺失菌株Amigl Amig2、畢赤酵母缺失菌株Ahxsl和畢赤酵母三缺失菌株Δmigl Δmig2 Δnrgl中分別過表達(dá)了轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)基因MIT1，構(gòu)建了基因過表達(dá)菌株GS115-MIT1、Amigl Amig2-MIT1> Δmigl Δmig2 Δnrgl-MITl 和 Δhxsl-MITl 經(jīng) Aoxl 酶活檢測發(fā)現(xiàn)，甘油可以誘導(dǎo)GSl 15-ΜΙΤ1的AOXl啟動(dòng)子的表達(dá)，甘油或者葡萄糖均能誘導(dǎo)Amigl Amig2-MIT1> Ahxsl-MITl 和 Amigl Amig2 Anrgl-MITl 的 AOXl 啟動(dòng)子表達(dá)。并且用流式細(xì)胞儀檢測了綠色熒光蛋白GFP以AOXl為啟動(dòng)子時(shí)在非甲醇碳源中的誘導(dǎo)表達(dá)量。所述的Ahxsl菌株中，與釀酒酵母己糖感應(yīng)體Snf3/Rgt2有很高相似性的一個(gè)基因HXSl (GenBank登錄號(hào)8197942)的編碼區(qū)缺失。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。材料畢赤酵母總蛋白提取技術(shù)參照冷泉港公司提供的酵母蛋白提取手冊(cè)。
所使用的工具酶均購自TaKaRa生物公司(大連，中國)，具體的反應(yīng)條件和使用的方法均參考商品說明書。下面的商品化質(zhì)粒和囷株用于基因克隆和蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ α A、質(zhì)粒pPIC3. 5k、大腸桿菌ToplO、畢赤酵母菌株GS115均購自Invitrogen公司。質(zhì)粒pAG32由質(zhì)粒pRDM054在酶切位點(diǎn)Bgl II處切除PAm-BFP_SKL表達(dá)體系得到；質(zhì)粒PRDM05獲自加州大學(xué)圣地亞哥分校。YPD培養(yǎng)基2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖，2%瓊脂粉；YNB培養(yǎng)基0. 67%YNB ；MGY培養(yǎng)基1%甘油，O. 67%YNB ；YND液體培養(yǎng)基1%葡萄糖，O. 67%YNB。配制以上培養(yǎng)基時(shí)，葡萄糖115° C高壓滅菌20min，甲醇在使用時(shí)添加。其它成分121° C高壓滅菌20min。固體培養(yǎng)基加2%瓊脂粉。
實(shí)施例I、甘油可誘導(dǎo)AOXl啟動(dòng)子表達(dá)的畢赤酵母菌株GS115-MIT1I. PpMITl過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用PCR，酶切連接的方法，以pGAPZ a A (圖I)為載體在GAP啟動(dòng)子下游的AsuII/Sal I兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入PpMITl基因(SEQ ID NO: 1，基因全長2667bp)，得到的重組質(zhì)粒稱為PGM質(zhì)粒。以M1-GAP5和M1-A0X1TT為引物(表I)，通過PCR的方法從pGM質(zhì)粒上擴(kuò)增得到pGAP-PpMITl-AOXITT 的表達(dá)體系(全長 3615bp)，以 pAG32 (圖 2)為載體在 Sac I/Spe I處插入該表達(dá)體系。得到重組質(zhì)粒為pGMhph。表I.引物列表
引物 SEQiD序列
NO:
MI-GAP5 4 S’-CGAGCTCAGATCTTTTTTGTAGAAATGTC-S’
MI-AOXITT 5__5’- GACTAGTGCACAAACGAAGGTCTC-3’
HXS1-C-5 6__5- CCGGAATTCTAGTCACGGATTGCTTC -3
HXS1-C-37 5- ACATGCATGCGTTCCCAATAGATTTCACAA -32.電轉(zhuǎn)畢赤酵母和GS115-MIT1菌株的篩選將PpMITl過表達(dá)質(zhì)粒(pGMhph)電轉(zhuǎn)畢赤酵母菌株GS115，涂于4塊加潮霉素的YPD固體培養(yǎng)基上，放在30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72小時(shí)。將平板上長出的單克隆挑至IOmlYPD+潮霉素液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)后，提基因組用PCR驗(yàn)證。把PCR檢驗(yàn)及測序驗(yàn)證后正確的畢赤酵母菌株命名為GS115-MIT1。3. Aox顯色反應(yīng)將各菌株分別在O. 5%(v/v)甲醇，1%甘油，1%甘油+0. 5%(v/v)甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到對(duì)數(shù)生長期后取樣1ml，在離心后的菌體中加入Aoxl酶活顯色液顯色(參見 Stasyk O. V. , T. Y. Nazarko, and A. A. Sibirny. 2008. Methods of PlatePexophagy Monitoring and Positive Selection for ATG Gene Cloning in Yeasts.Methods in enzymology. 451:229-239。顯色底物為 o-dianisidine)。結(jié)果如圖3，可以看到在含有甘油的培養(yǎng)基中生長后，只有菌株GS115-MIT1中有Aox酶活，野生菌株中均沒有酶活。4. Aox酶活的測定將各菌株在MGY液體培養(yǎng)基中過夜預(yù)培養(yǎng)，然后分別轉(zhuǎn)移到含有O. 5%(v/v)甲醇，1%甘油，1%甘油+0. 5%(v/v)甲醇，O. 5%(v/v) 甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10小時(shí)后取樣提取總蛋白，經(jīng)Bradford法蛋白定量后進(jìn)行Aoxl酶活的測定(方法參見Verduyn, C. , J. P. van Dijken, and ff. A. Scheffers. 1984. Colorometric alcohol assayswith alcohol oxidase. J. Microbiol. Methods 2:15-25。顯色底物為 2，2，-azino_di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonate), ABTS)。由圖4可知，菌株GSl 15-MIT1在含有甘油的培養(yǎng)基中均可以誘導(dǎo)Aoxl的表達(dá)，野生菌株均不能誘導(dǎo)Aox的表達(dá)。5、畢赤酵母GFP單拷貝表達(dá)菌株的篩選在載體pPIC3. 5k(圖9)的AOXl啟動(dòng)子下游的SnaB I酶切位點(diǎn)處插入GFP基因(全長714bp)，得到GFP表達(dá)載體pP-GFP。6、畢赤酵母GFP單拷貝表達(dá)菌株的篩選分別將表達(dá)載體pP-GFP電轉(zhuǎn)GS115-MIT1菌株，涂于不含組氨酸的YND平板，放在30 0C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72小時(shí)。將平板上長出的單克隆挑至液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)后提基因組，用real-time PCR驗(yàn)證GFP拷貝數(shù)(方法參見Xuan，Y. J.，X.S. Zhou, ff. ff. Zhang, X. Zhang, Z. ff. Song, and Y. X. Zhang. 2009. An upstream activationsequence controls the expression of AOXl gene in Pichia pastoris. FEMS YeastRes. 9:1271-1282)。把real-time PCR檢驗(yàn)為單拷貝的畢赤酵母GFP表達(dá)菌株分別命名為GS115-MIT1-GFP。同理構(gòu)建了表達(dá)菌株AmiglAmig2-MITl-GFP 和 Λ hxsl_MITl_GFP。表達(dá)菌株Amigl Amig2-MIT1-GFP構(gòu)建方法具體如下將表達(dá)載體pP_GFP和表達(dá)載體pGMhph共轉(zhuǎn)Amigl Λ mig2菌株(參見中國公開專利CN101857845A)。表達(dá)菌株Ahxsl-MITl-GFP構(gòu)建方法具體如下將表達(dá)載體pP_GFP和表達(dá)載體pGMhph 共轉(zhuǎn) Ahxsl-MITl 菌株。7、流式細(xì)胞儀檢測GFP表達(dá)量將菌株GS115-MIT1-GFP在YND液體培養(yǎng)基中過夜預(yù)培養(yǎng)，然后分別轉(zhuǎn)移含有O. 5%(v/v)甲醇，1%甘油，1%甘油+0. 5%(v/v)甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣后用流式細(xì)胞儀檢測樣品中GFP的幾何平均熒光強(qiáng)度。如圖5所示，GS 115-MIT1可以在甘油存在的情況下誘導(dǎo)外源多肽GFP表達(dá)。實(shí)施例2、甘油或者葡萄糖可誘導(dǎo)AOXl啟動(dòng)子表達(dá)的畢赤酵母菌株I. HXSl基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建用BamH I和Sal I酶將Zeocin抗性基因Sh ble片段從質(zhì)粒pGAPZ a A上切下，以PUC18質(zhì)粒(圖10)為載體，在BamH I和Sal I處酶切連接插入了 Zeocin抗性基因Sh ble片段，命名為pUC18-ble質(zhì)粒。以GS115基因組為模板，首先使用引物HS1-5F/HS1-5R擴(kuò)增PpHXSl基因的5’端外圍啟動(dòng)子區(qū)域(起始密碼子ATG上游)，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為728bp。引物HS1-3F/HS1-3R用于擴(kuò)增PpHXSl基因的3’端的區(qū)域(終止密碼子下游)，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為1011 bp，分別切膠回收目的大小片段。將回收的PpHXSl基因的5’端外圍啟動(dòng)子DNA片段，用EcoRI和BamHI雙酶切后，回收片段。pUC18-ble質(zhì)粒、用EcoRI和BamHI雙酶切，回收片段。將回收的兩片段連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR驗(yàn)證陽性克隆，命名為pUC18-(HS15’ -ble)。將上一步構(gòu)建好質(zhì)粒SalI和SphI雙酶切，回收片段。PpHXSl基因的3’端區(qū)域DNA片段也用SalI和SphI雙酶切。兩片段連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR陽性菌株，陽性菌株命名為 pUC18-(HS15’ -ble-HS13，)。
表2、PpHXSl敲除使用的引物
引物 SEQID
序列
名稱 NO:_
HS1-5F 1155-CCGGAATTCTAG TC ACGG ATTGCTTd
HS1-5R 12 S5-CGCGG ATCC AGTCTG a a Ataggctcagacat-S'
HS1-3F 13 S^ACGCGTCGACATGCCTATTGAACAAGACTATT-a5 HS1-3R 14 5,-ACATGCATGCGTTCCCAATAGATTTCACAA-3 2. Ahxsl基因缺失菌株的構(gòu)建將pUC18_(HSl 5，-ble-HSl 3’)質(zhì)粒用EcoRI和SphI雙酶切，膠回收大小為3350bp 的 PpHXSl 敲除片段 HSl 5，-ble-HSl 3，。將回收的20μ1 PpHXSl 敲除片段 HSl 5’ -ble-HSl 3’(濃度大于 50ng/μ I)與80μ I畢赤酵母GS115感受態(tài)在冰上混勻，按照實(shí)驗(yàn)步驟提供的方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。將50 μ I復(fù)蘇的電轉(zhuǎn)化菌液涂于添加Zeocin抗生素的YP+Glycerol固體培養(yǎng)基平板,將篩選平板倒置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 3天，當(dāng)有肉眼可見菌落長出時(shí)，將菌落挑至含Zeocin的YP+GlyceroI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 3天。PCR驗(yàn)證PpHXSI敲除的陽性菌株，命名為Λ hxsI。3. Amigl Amig2-MIT1 和 Ahxsl-MITl 的構(gòu)建將質(zhì)粒pGMhph電轉(zhuǎn)畢赤酵母菌株AmiglAmig2和Δ hxsl,涂于4塊加潮霉素的YPD平板，放在30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72小時(shí)。將平板上長出的單克隆挑至IOml YPD+潮霉素液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)后，抽提基因組用PCR驗(yàn)證。把PCR檢驗(yàn)及測序驗(yàn)證后正確的畢赤酵母菌株分別命名為AmiglAmig2-MITl和Ahxsl_MITl。4. Aox顯色反應(yīng)將AmiglAmig2-MITl 和 Λhxsl-MITl 分別在 1%甘油，1%甘油+0. 5%(v/v)甲醇，1%葡萄糖，1%葡萄糖+0. 5%(v/v)甲醇和O. 5%(v/v)甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到對(duì)數(shù)生長期后取樣1ml，在離心后的菌體中加入Aoxl酶活顯色液顯色。結(jié)果如圖6，可以看到在含有甘油或者葡萄糖的培養(yǎng)基中，只有菌株Amigl Amig2-MIT1 和 Ahxsl-MITl 中有酶活。3. Aox酶活的測定
將各菌株分別在1%甘油，1%甘油+0. 5%(v/v)甲醇，1%葡萄糖，1%葡萄糖+0. 5%(v/v)甲醇和0.5%(v/v)甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到對(duì)數(shù)生長期后取樣提取總蛋白，經(jīng)Bradford法蛋白定量后進(jìn)行Aoxl酶活的測定。由圖7可知，菌株AmiglAmig2-MITl和Λ hxsl-MITl在含有甘油或者葡萄糖的培養(yǎng)基中均可以誘導(dǎo)Aoxl的表達(dá)，野生菌株均不能誘導(dǎo)Aox的表達(dá)。4.流式細(xì)胞儀檢測AmiglAmig2-MITl和Ahxsl-MITl的GFP表達(dá)量將AmiglAmig2-MITl-GFP和Δ hxsl_MITl_GFP在液體培養(yǎng)基中過夜預(yù)培養(yǎng)，然后分別轉(zhuǎn)移到含有O. 5%(v/v)甲醇，1%甘油，1%甘油+0. 5%(v/v)甲醇，1%葡萄糖和1%葡萄糖+0. 5%(v/v)甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中，取樣后用流式細(xì)胞儀檢測樣品中GFP的幾何平均熒光強(qiáng)度。如圖8所示，Amigl Amig2-MIT1和Ahxsl-MITl可以在甘油或者葡萄糖存在的 情況下誘導(dǎo)外源多肽GFP表達(dá)。實(shí)施例5、甘油或者葡萄糖可誘導(dǎo)AOXl啟動(dòng)子表達(dá)的畢赤酵母菌株Amigl AmigAnrgl-MITlI. NRGI基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建以GS115基因組為模板，使用引物5’ NRG1-F/5’ NRGl-R擴(kuò)增PpNIGl基因的5’端外圍區(qū)域得到大小為320bp片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物命名為5’NRG1，膠回收5’NRG1片段。以上所得到的5’NRG1片段用Sac I和Sma I雙酶切，與同樣Sac I和Sma I雙酶切的pUC18質(zhì)粒連接，構(gòu)成 pUC18(SacI-5’ NRGI-SmaI)。載體 pUC18 (Sacl_5’ NRGl-SmaI)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，菌落PCR篩選陽性克隆。然后，使用引物HYG-F和HYG-R，以質(zhì)粒pRDM054為模板，擴(kuò)增潮霉素B抗性基因HPH,大小為1648bp。以上所得HPH片段用Sma I和XbaI雙酶切，與同樣Sma I和XbaI雙酶切的載體 PUC18 (SacI-5，NRGl-SmaI)相連，構(gòu)成載體 pUC18 (SacI-5JNRGI-SmaI-HPH-XbaI)。pUC18(SacI-5’NRGl-SmaI-HPH-XbaI)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，菌落PCR篩選陽性克隆。用引物5’ NRG1-F/NRG1-A1 以質(zhì)粒 pUC18 (SacI-5，NRGl-Smal-HPH-Xbal)為模板擴(kuò)增得到片段Overlap-A。用引物NRG1_B2/3’NRG1_R，以GS115基因組為模板，擴(kuò)增得到片段Overlap-B。然后通過Overlap PCR的方法鏈接片段A、B，得到5’ NRG1-HPH-3’ NRGl片段。將該片段連接到PMD19-T載體上，得到敲除質(zhì)粒pMD19-T(SacI-5’NRGl-SmaI-HPH-3’NRGl-SphI)。2. Δ migl Δ mig2 Δ nrgl 菌株的構(gòu)建將得到的SacI-5’ NRGl-SmaI-HPH-3’ NRGl-SphI 片段與 Amigl Amig2 雙缺失菌株感受態(tài)共轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后迅速加入700ul預(yù)冷的lmol/L山梨醇，然后轉(zhuǎn)移至EP管中，并加Λ 700ul YH)液體培養(yǎng)基，30°C和200r/min搖床復(fù)蘇培養(yǎng)I 2h。最后將菌液涂于添加Zeocin, G418和Hygromycin抗生素的YPD固體平板。30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 3天。將陽性轉(zhuǎn)化子提基因組PCR驗(yàn)證，得到的陽性菌株命名為AmiglAmig2Anrgl。3.三缺失菌株中MITl過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以pPIC3. 5k為載體在Sac I/BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入GAP啟動(dòng)子得到pPG質(zhì)粒。再于BamH I/Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)間插入PpMPPl基因序列，得到的重組質(zhì)粒稱為pPGPPl質(zhì)粒。
4. Δ migl Δ mig Δ nrgl-MITl 的構(gòu)建將質(zhì)粒pPGPPl電轉(zhuǎn)畢赤酵母菌株Amigl Amig2 Anrgl,涂于4塊不加his的YND平板，放在30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72小時(shí)。將平板上長出的單克隆挑至IOml YND液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)后，抽提基因組用PCR驗(yàn)證。把PCR檢驗(yàn)及測序驗(yàn)證后正確的畢赤酵母菌株分別命名為 Amigl Amig2 Anrgl-MITl。5.畢赤酵母GFP單拷貝表達(dá)菌株的篩選分別將表達(dá)載體pP-GFP電轉(zhuǎn)GS11+-MIT1菌株，涂于不含組氨酸的YND平板，放在30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72小時(shí)。將平板上長出的單克隆挑至MGY液體培養(yǎng)基中，在熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光，有熒光的轉(zhuǎn)化子30°C搖床培養(yǎng)后提基因組，用real-timePCR 驗(yàn)證 GFP 拷貝數(shù)(方法參見 Xuan, Y. J.，X. S. Zhou, ff. ff. Zhang, X. Zhang, Z. ff. Song, andY. X. Zhang. 2009. An upstream activation sequence controls the expression of AOXlgene in Pichia pastoris. FEMS Yeast Res. 9:1271-1282)。把 real-time PCR 檢驗(yàn)為單 拷貝的畢赤酵母GFP表達(dá)菌株命名為Amigl Amig2 Anrgl-MITI-GFP。6. Aox酶活的測定將Amigl Amig2 Anrgl-MITl 菌株分別在 1% 甘油，1% 甘油+0. 5%(v/v)甲醇，1%葡萄糖，1%葡萄糖+0. 5%(v/v)甲醇和O. 5%(v/v)甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到對(duì)數(shù)生長期后取樣提取總蛋白，經(jīng)Bradford法蛋白定量后進(jìn)行AoxI酶活的測定。由圖11可知，菌株Λ migl Λ mig2 Λ nrgl-MITl在含有甘油或者葡萄糖的培養(yǎng)基中均可以誘導(dǎo)Aoxl的表達(dá),野生菌株均不能誘導(dǎo)Aox的表達(dá)。7.流式細(xì)胞儀檢測Amigl Amig2 Anrgl-MITl的GFP表達(dá)量將Λ migl Δ mig2 Δ nrgl-MITI-GFP在液體培養(yǎng)基中過夜預(yù)培養(yǎng)，然后分別轉(zhuǎn)移到含有O. 5%(v/v)甲醇，1%甘油，1%甘油+0. 5%(v/v)甲醇，1%葡萄糖和1%葡萄糖+0. 5%(v/V)甲醇為碳源的YNB液體培養(yǎng)基中，取樣后用流式細(xì)胞儀檢測樣品中GFP的幾何平均熒光強(qiáng)度。如圖12所示，Amigl Λ mig2 Anrgl-MITl可以在甘油或者葡萄糖存在的情況下誘導(dǎo)外源多肽GFP表達(dá)。表3、PpNIGl敲除使用的引物
權(quán)利要求
1.一種消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)外源多肽編碼基因表達(dá)的方法，包括 (1)提供甲醇營養(yǎng)型酵母，所述甲醇營養(yǎng)型酵母含有 表達(dá)盒1，其表達(dá)外源的Mitl多肽；以及 表達(dá)盒2，包括甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及與之操作性連接的外源多肽編碼基因； (2)在無甲醇條件或非單一甲醇碳源條件下培養(yǎng)(I)的甲醇營養(yǎng)型酵母。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括=AOXl啟動(dòng)子、DHAS啟動(dòng)子、DAS啟動(dòng)子、FDH啟動(dòng)子、FMDH啟動(dòng)子、MOX啟動(dòng)子、A0X2啟動(dòng)子、ZZAl、PEX5-、PEX8-、PEX14-啟動(dòng)子、PMP20啟動(dòng)子、PMP47啟動(dòng)子、AODl啟動(dòng)子、A0D2啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的甲醇營養(yǎng)型酵母包括畢赤酵母(Pichia),漢遜酵母(Hansenula),假絲酵母(Candida),球擬酵母(Torulopsis);較佳地，所述的畢赤酵母包括GS115，MIG1基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母，NRGl基因、MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母，或HXSl基因不表達(dá)的畢赤酵母菌株。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的Mitl多肽選自下組 (a)SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽；或 (b)將SEQID N0:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有利用非甲醇碳源誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽功能的由(a)衍生的多肽； (C)與(a)限定的序列在具有70%以上的序列相同性的，且具有利用非甲醇碳源誘導(dǎo)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)外源多肽功能的由(a)衍生的多肽。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)盒I中，包括啟動(dòng)子以及與之操作性連接的Mitl多肽的編碼基因；較佳地，該啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，組織或器官特異性啟動(dòng)子，時(shí)空特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用存在甘油和/或葡萄糖的酵母培養(yǎng)基。
7.Mitl多肽或其編碼基因的用途，用于消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而驅(qū)動(dòng)外源多肽編碼基因表達(dá)。
8.—種重組的甲醇營養(yǎng)型酵母，所述甲醇營養(yǎng)型酵母含有 表達(dá)盒1，其能夠表達(dá)外源的Mitl多肽；以及 表達(dá)盒2，包括甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及與之操作性連接的外源多肽編碼基因。
9.如權(quán)利要求8所述的重組的甲醇營養(yǎng)型酵母，其特征在于，所述的甲醇營養(yǎng)型酵母包括畢赤酵母(Pichia),漢遜酵母(Hansenula),假絲酵母(Candida),球擬酵母(Torulopsis);較佳地，所述的畢赤酵母(Pichia)包括GS115，MIG1基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母，NRGl基因、MIGl基因和MIG2基因不表達(dá)的畢赤酵母，或HXSl基因不表達(dá)的畢赤酵母菌株。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的MIGl基因的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示； 所述的MIG2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；或 所述的HXSl基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。所述的NRGl基因的核苷酸序列 如SEQ ID N0:8所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種消除甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子單一甲醇碳源依賴性而表達(dá)外源多肽的方法。揭示了一種通過在甲醇營養(yǎng)型酵母細(xì)胞內(nèi)增加Mit1多肽的表達(dá)量，激活需要甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)，以此使得原本依賴甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子不再依賴單一甲醇也可表達(dá)外源多肽。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102757976SQ20121019686
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者周祥山, 張?jiān)d, 張平, 柏鵬, 王小龍, 王錦佳 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)