專利名稱：人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及細(xì)胞工程領(lǐng)域，特別涉及一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑。
背景技術(shù)：
人脂肪干細(xì)胞即人體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種成體干細(xì)胞，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能。ADSCs呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期的細(xì)胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在條件下傳代培養(yǎng)2-3天細(xì)胞增殖I倍。多次傳代(10-20代)后，細(xì)胞增殖速度無(wú)明顯減慢，在傳代6次后細(xì)胞群體中出現(xiàn)衰老細(xì)胞，第15代細(xì)胞群體中衰老細(xì)胞約占15%[3]。ADSCs具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本相同的細(xì)胞免疫表型，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析CD9，CD10, CD 13, C D29，CD44, CD49d, CD49e, CD54, CD55, CD59, CD90, CD105, CDl17，CD146, CD166, STRO-1 均為陽(yáng)性，而⑶31，⑶34，⑶45均為陰性。最大的區(qū)別是ADSCs表達(dá)⑶49d，不表達(dá)CD106;而正好相反，BMSCs表達(dá)CD106,不表達(dá)CD49d。目前常用的ADSCs分離培養(yǎng)方法是從脂肪組織分離獲取細(xì)胞，經(jīng)機(jī)械和酶處理方法除去紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞后，利用飼養(yǎng)層細(xì)胞與采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。這種培養(yǎng)干細(xì)胞方法的缺點(diǎn)是方法復(fù)雜，提取的干細(xì)胞數(shù)量少，純度不高，繼代增殖緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，用于提高繼代增殖效率。常用的培養(yǎng)干細(xì)胞方法的缺點(diǎn)是方法復(fù)雜，提取的干細(xì)胞數(shù)量少，純度不高，繼代增殖緩慢。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，其特征在于由胰島素、氫化可的松、甲狀旁腺激素、雌二醇、睪酮、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、白血病抑制因子、L-抗壞血酸、生物素、地塞米松、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-I和人干細(xì)胞因子SCF組成。在加入人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基后人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑中各成分作用濃度依次為胰島素濃度為O. ΓΙΟ μ g/mL,氫化可的松濃度為ΙΟ—10 5X 10_9mOl/L、甲狀旁腺激素濃度為2X 10_1(1 7X lO.mol/L、雌二醇濃度O. 2^3. 5ng/mL、睪酮濃度為O. 8 15ng/mL、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB濃度為8ng/mL、表皮生長(zhǎng)因子濃度為2 16ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為2 20ng/mL、L-谷氨酰胺優(yōu)選濃度為O. r4mmol/L,2-巰基乙醇濃度為O. 07、. 15mmol/L、白血病抑制因子濃度為l 7ng/mL、L-抗壞血酸濃度為10 80 μ g/mL、生物素濃度為1(Γ45 μ g/mL、地塞米松濃度為Kr8 5X l(T8mol/L、IGF-I濃度為I 10ng/mL和SCF濃度為O. 8 15ng/mL。其中胰島素最優(yōu)選濃度為6. 25 μ g/mL,氫化可的松最優(yōu)選濃度為I X 10_9mol/L,甲狀旁腺激素最優(yōu)選濃度為5X l(rlclmol/L,雌二醇最優(yōu)選濃度為Ing/mL,睪酮最優(yōu)選濃度為4ng/mL,血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB最優(yōu)選濃度為4ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子最優(yōu)選濃度為10ng/mL，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子最優(yōu)選濃度為10ng/mL,L-谷氨酰胺最優(yōu)選濃度為2mmol/L, 2-巰基乙醇最優(yōu)選濃度為O. lmmol/L,白血病抑制因子最優(yōu)選濃度為5ng/mL, L-抗壞血酸最優(yōu)選濃度為50 μ g/mL,生物素最優(yōu)選濃度為33 μ g/mL,地塞米松最優(yōu)選濃度為10_8mol/L, IGF-I最優(yōu)選濃度為5ng/mL, SCF組成最優(yōu)選濃度為5ng/mL。本發(fā)明提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素和各種生長(zhǎng)因子作用如下insulin胰島素能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸hydrocortisone氫化可的松刺激干細(xì)胞的生長(zhǎng)，保證細(xì)胞功能parathyroid hormone甲狀旁腺激素刺激干細(xì)胞的生長(zhǎng)estradiol雌二醇刺激干細(xì)胞的生長(zhǎng),保證細(xì)胞功能
testosterone睪酮刺激干細(xì)胞的生長(zhǎng),保證細(xì)胞功能PDGF-AB血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB :促細(xì)胞分裂劑，可刺激成纖維細(xì)胞和其他多種細(xì)胞分裂增殖。EGF表皮生長(zhǎng)因子對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用bFGF堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能刺激細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)纖溶酶原激活物及膠原酶活性，是與肝素有高親和力的細(xì)胞促分裂原。L-Glutamine L-谷氨酰胺增加細(xì)胞的體積，促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)2-Mercaptoethanol 2_巰基乙醇可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的巰基不被氧化，促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖。LIF白血病抑制因子具有抑制干細(xì)胞分化等功能，用于維持培養(yǎng)中的干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。L-ascorbic acid L-抗壞血酸抗氧化劑皆能促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加成活率。biotin生物素生物素又被稱作維生素H，屬于水溶性B族維生素家族，參與幫助脂肪細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)正常的合成與代謝。促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)。Dexamethasone地塞米松屬于腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中起到生長(zhǎng)因子的作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化。IGF-I胰島素樣生長(zhǎng)因子是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子。在細(xì)胞的分化、增殖、個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的促進(jìn)作用。SCF人干細(xì)胞因子是一種廣泛表達(dá)的I型跨膜糖蛋白，可促進(jìn)干細(xì)胞成活、加速增殖。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供的一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，包含對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素和各種生長(zhǎng)因子，用于脂肪干細(xì)胞的增殖傳代培養(yǎng)，不但能特異性促進(jìn)脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)速度和擴(kuò)增數(shù)量呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，又要抑制其過(guò)早分化成熟，避免干細(xì)胞在培養(yǎng)中凋亡或早衰，保持脂肪干細(xì)胞旺盛活躍的分化的潛能，促進(jìn)提取出的干細(xì)胞成活。


圖I是本發(fā)明中添加人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與未添加人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；圖2是本發(fā)明中使用普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基組培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)6天時(shí)細(xì)胞的形態(tài)；
圖3是本發(fā)明中使用人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)6天時(shí)細(xì)胞的形態(tài)；圖4是本發(fā)明中使用人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞人脂肪干細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)所用器具儀器試劑皆可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例I :普通人脂肪干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制取900mL的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(從TAKARA BIO INC.購(gòu)得)加抗生素青霉素 90000U，鏈霉素 90000U。調(diào)pH值用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaHCO3調(diào)節(jié)pH到7. 2。過(guò)濾除菌采用孔徑O. 45μηι和O. 22μηι濾膜各一張，上層為O. 45 μ m,下層為O. 22um,以保證過(guò)濾效果。加小牛血清臨用前將加入小牛血清定容至IOOOmL (從TAKARA BIO INC.購(gòu)得)。實(shí)施例2 :制備一種含人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的增殖培養(yǎng)基A預(yù)定量為IOOOmL則取900mL的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(TAKARA BIO INC.)，加抗生素青霉素90000U，鏈霉素90000U。調(diào)pH值用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaHCO3調(diào)節(jié)pH到7. 2。加入增殖促進(jìn)劑按下表I所示成分與量稱量并依次加入到上述配制好的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中，振蕩或超聲助溶，不加熱助溶。表I
權(quán)利要求
1.一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，其特征在于由胰島素、氫化可的松、甲狀旁腺激素、雌二醇、睪酮、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、白血病抑制因子、L-抗壞血酸、生物素、地塞米松、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-I和人干細(xì)胞因子SCF組成。
2.如權(quán)利要求I所述的人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，其特征在于各成分的比例為使得在加入人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基后人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑中各成分作用濃度依次為胰島素濃度為0. flOyg/mL、氫化可的松濃度為IO,飛X10_9mOl/L、甲狀旁腺激素濃度為2X1(T1CI 7Xl(rlclmol/L、雌二醇濃度0. 2 3. 5ng/mL、睪酮濃度為0. 8 15ng/mL、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB濃度為f8ng/mL、表皮生長(zhǎng)因子濃度為2 16ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為2 20ng/mL、L-谷氨酰胺優(yōu)選濃度為0. r4mmol/L、2-巰基乙醇濃度為0.07 0. 15mmol/L、白血病抑制因子濃度為I 7ng/mL、L-抗壞血酸濃度為10 80 y g/mL、生物素濃度為l(T45ii g/mL、地塞米松濃度為I(T8 5 X IO-8HioI/L、IGF-I濃度為l 10ng/mL和SCF 濃度為 0. 8 15ng/mL。
3.如權(quán)利要求I所述的人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，其特征在于各成分的比例為使得在加入人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基后人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑中各成分作用濃度依次為胰島素濃度為6. 25 u g/mL,氫化可的松濃度為lXl(T9mol/L,甲狀旁腺激素濃度為5 X雌二醇濃度為Ing/mL，睪酮濃度為4ng/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB濃度為4ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子濃度為10ng/mL，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為10ng/mL，L-谷氨酰胺濃度為2mmol/L, 2-巰基乙醇濃度為0. lmmol/L,白血病抑制因子濃度為5ng/mL, L-抗壞血酸濃度為50 ii g/mL,生物素濃度為33 u g/mL,地塞米松濃度為l(T8mol/L, IGF-I濃度為5ng/mL, SCF濃度為5ng/mL。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用方法，其特征在于將人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑各成分分別加入人脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用方法，其特征在于加入人脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基中使其培養(yǎng)的人脂肪干細(xì)胞迅速增殖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用方法，其特征在于人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑中各成分作用濃度依次為胰島素濃度為0. f IOy g/mL、氫化可的松濃度為IO, 5X IO-9HioI/L、甲狀旁腺激素濃度為2X10-1Q 7X10-1QmOl/L、雌二醇濃度0.2^3. 5ng/mL、睪酮濃度為0. 8 15ng/mL、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB濃度為f8ng/mL、表皮生長(zhǎng)因子濃度為2 16ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為2 20ng/mL、L-谷氨酰胺優(yōu)選濃度為0. r4mmol/L、2-巰基乙醇濃度為0. 07、. 15mmol/L、白血病抑制因子濃度為l 7ng/mL、L-抗壞血酸濃度為10 80 y g/mL、生物素濃度為10 45 y g/mL、地塞米松濃度為I(T8 5x1 (r8moI/L、IGF-I 濃度為 I 10ng/mL 和 SCF 濃度為 0. 8 15ng/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用方法，其特征在于胰島素最優(yōu)濃度為6. 25 V- g/mL,氫化可的松最優(yōu)濃度為I X 10_9mol/L,甲狀旁腺激素最優(yōu)濃度為5X l(rlclmol/L,雌二醇最優(yōu)濃度為Ing/mL,睪酮最優(yōu)濃度為4ng/mL,血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB最優(yōu)濃度為4ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子最優(yōu)濃度為10ng/mL，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子最優(yōu)濃度為10ng/mL, L-谷氨酰胺最優(yōu)濃度為2mmol/L, 2-巰基乙醇最優(yōu)濃度為0. Immol/L,白血病抑制因子最優(yōu)濃度為5ng/mL,L-抗壞血酸最優(yōu)濃度為50 y g/mL,生物素最優(yōu)濃度為33 ii g/mL,地塞米松最優(yōu)濃度為10_8mol/L，IGF-I最優(yōu)濃度為5ng/mL，SCF組成最優(yōu)濃度為 5ng/mLo
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用方法，其特征在于所述的人脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基。
全文摘要
本申請(qǐng)公開(kāi)了一種人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑及其應(yīng)用方法。所述的人脂肪干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑由胰島素、氫化可的松、甲狀旁腺激素、雌二醇、睪酮、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、白血病抑制因子、L-抗壞血酸、生物素、地塞米松、IGF-I和SCF組成。本發(fā)明應(yīng)用于脂肪干細(xì)胞的增殖傳代培養(yǎng)，不但能特異性促進(jìn)脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)速度和擴(kuò)增數(shù)量程幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，又能抑制其過(guò)早分化成熟，避免干細(xì)胞在培養(yǎng)中凋亡或早衰，保持脂肪干細(xì)胞旺盛活躍的分化潛能。在脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102757936SQ20121019741
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者焦陽(yáng) 申請(qǐng)人:江蘇瑞思坦生物科技有限公司