生產(chǎn)輔酶q10工程菌的構(gòu)建方法、工程菌與應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種生產(chǎn)輔酶Q10工程菌的構(gòu)建方法、工程菌與應(yīng)用方法，構(gòu)建方法如下：a.從類球紅細(xì)菌中提取基因組DNA；b.用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增出bchG的同源基因；c.用擴增出的同源基因與廣宿主質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組載體；d.重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1中；e.將大腸桿菌S17-1與所述類球紅細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移，即得敲除了葉綠素合成基因bchG的工程菌。本發(fā)明提供一種通過敲除類球紅細(xì)菌葉綠素合成基因提高輔酶Q10產(chǎn)量的方法，能將輔酶Q10的合成能力提高約15%，適合輔酶Q10的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】生產(chǎn)輔酶Q10工程菌的構(gòu)建方法、工程菌與應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種生產(chǎn)輔酶QlO工程菌的構(gòu)建方法、工程菌與應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]輔酶Q是生物體內(nèi)廣泛存在的脂溶性醌類化合物，不同來源的輔酶Q其側(cè)鏈異戊烯單位的數(shù)目不同，人類和哺乳動物是10個異戊烯單位，故稱輔酶QlO (CoQIO)。如式
(I)所示:
[0003]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下: 從類球紅細(xì)菌中提取基因組DNA ； 用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增出bchG的同源基因； 用擴增出的同源基因與廣宿主質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組載體； 重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1中； 將大腸桿菌S17-1與所述類球紅細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移，即得敲除了葉綠素合成基因bchG的工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的bchG基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述廣宿主質(zhì)粒為克隆載體pK18mobsacB。
4.一株利用如權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建方法得到的工程菌，其特征在于，該菌為類球紅細(xì)菌，拉丁文學(xué)名為sphaeroides ;命名為NHU-ZAA菌株；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間:2012年4月13日；保藏編號:CGMCC N0.5999。
5.利用如權(quán)利要求4所述的工程菌生產(chǎn)輔酶QlO的方法，其特征在于，具體步驟如下: 挑取所述NHU-ZAA菌株單克隆接種于含IOmL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200rpm，在26-34°C培養(yǎng)23h，獲得一級種子； 將一級種子按1%的比例轉(zhuǎn)接至含20mL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，在26_34°C，200rpm的條件下培養(yǎng)23h，獲得二級種子； 將二級種子以1%的比例接種至含IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL中，在26_34°C，200rpm的條件下培養(yǎng)120h，收集菌液；菌液中提取輔酶Q10。
6.利用如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)輔酶QlO的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基每1OOmL中含有=(NH4)2SO4 0.25g，玉米漿0.05g，酵母提取物0.14g, NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO4 0.01g, CoCl2 0.003g, MnSO4.0.0OOlg, CaCO3 0.8g，維生素 BI 0.1y g，維生素 K 0.1y g，維生素 A 0.15 y g ;pH 調(diào)節(jié)為.7.2。
7.利用如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)輔酶QlO的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基每1OOmL 種含有:(NH4)2SCM 0.3g, NaCl 0.28g，葡萄糖 4g, KH2PO4 0.15g，味精 0.3g, MgSO4.0.63g，玉米漿 0.4g，F(xiàn)eSO4 0.12g，CoCl2 0.005g, CaCO3 0.6g，維生素 BI 0.1u g,維生素 K.0.1u g,維生素 A 0.15u g ；pH 調(diào)節(jié)為 7.2。
【文檔編號】C12N15/09GK103509728SQ201210201141
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】于洪巍, 陸文強, 石一軍 申請人:浙江新和成股份有限公司, 上虞新和成生物化工有限公司