專利名稱：霍亂弧菌(vc)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及致病菌的生物檢測(cè)技術(shù)，具體涉及將特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)中使用的引物、探針及相關(guān)試劑盒。
背景技術(shù)：
霍亂弧菌(V. cholera)是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚 高，屬于國(guó)際檢疫傳染病。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過(guò)污染的水源或食物尤其是水產(chǎn)品經(jīng)口感染。近年來(lái)隨著國(guó)家貿(mào)易全球化的不斷加劇，我國(guó)的進(jìn)出口貿(mào)易逐年增長(zhǎng)。而在進(jìn)口的食品中，出現(xiàn)問(wèn)題最多的是鮮活或冰凍的水產(chǎn)品。例如，2005年和2006年進(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢出率為9%左右，霍亂弧菌的檢出率為2% 3%,其他的弧菌如創(chuàng)傷弧菌等也時(shí)有檢出。而且我國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)所形成的飲食習(xí)慣，對(duì)一些水產(chǎn)品如龍蝦、象拔蛘和三文魚等一般生吃，從而對(duì)消費(fèi)者的健康造成潛在威脅，所以有必要加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品中常見致病性弧菌的檢測(cè)?；魜y弧菌包含多種毒力相關(guān)因子，其中霍亂毒素(CT)是其主要的致病因子。自環(huán)境中分離出的霍亂弧菌多數(shù)不產(chǎn)生CT。01群和0139群霍亂弧菌是引起疾病發(fā)生的兩種主要血清型，另外，近年來(lái)的研究顯示部分非01、非0139的霍亂弧菌也可以產(chǎn)生CT。因此，分離鑒定食品中的霍亂弧菌對(duì)保護(hù)人民健康，保障水產(chǎn)品的安全具有重要的意義。目前常用的霍亂弧菌檢測(cè)方法包括1)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法?？傮w可分為4個(gè)階段或步驟。預(yù)增菌，選擇性增菌，分離，生化鑒定。需要4 7天，才能得出明確的診斷結(jié)果。2)免疫標(biāo)記技術(shù)。利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，并結(jié)合一些生物化學(xué)或物理學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，但該方法的靈敏度和特異性均較差。3)分子生物學(xué)檢測(cè)方法。目前有PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和LAMP方法。以上幾種方法易引起擴(kuò)增物的污染，常造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象，并且不能區(qū)分活菌和死菌，阻礙了其大規(guī)模推廣使用。實(shí)時(shí)突光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(SimultaneousAmplification and Testing,簡(jiǎn)稱SAT)是一種直接快速檢測(cè)RNA的方法，與檢測(cè)DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR相比，不同之處，前者檢測(cè)體系多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟，核酸擴(kuò)增在一個(gè)溫度下進(jìn)行(42°C )，無(wú)需熱循環(huán)。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA多聚酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增，相對(duì)于其它核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)抑制物更少，能有效減少假陰性結(jié)果。然而，SAT技術(shù)在不同種類致病菌的檢測(cè)中應(yīng)用所面臨的問(wèn)題各不相同，需要具體分析致病菌的特性進(jìn)行專門設(shè)計(jì)。目前尚無(wú)針對(duì)霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有的霍亂弧菌(VC)檢測(cè)方法靈敏度較低，檢測(cè)周期長(zhǎng)、易引起擴(kuò)增物的污染造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性以及檢測(cè)成本較高的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)周期短、高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定以及檢測(cè)成本低、易于推廣應(yīng)用的霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，包括專用引物、探針、試劑盒及其使用。本發(fā)明所提供的霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包含有一條捕獲探針，一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測(cè)引物17和nT7，和一條用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VC檢測(cè)探針。所述捕獲探針可與如序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列特異結(jié)合，在有VC內(nèi)標(biāo)(VC IC RNA)時(shí)，其最好還可與該VC內(nèi)標(biāo)序列特異結(jié)合，所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC檢測(cè)引物由T7引物和n!7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述VC檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。進(jìn)一步，所述試劑盒還包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄 酶和I7RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述17弓丨物、nT7引物和VC檢測(cè)探針存在于一 VC檢測(cè)液中。再進(jìn)一步所述試劑盒還包含有VC內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；所述VC內(nèi)標(biāo)為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并與VC靶標(biāo)核苷酸(VC RNA)使用同一對(duì)引物(17和nT7)，VC內(nèi)標(biāo)由序列表中序列7所示的VC IC RNA ;所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示,5’端標(biāo)記HEX突光基團(tuán),3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)，且所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于VC檢測(cè)液中。更進(jìn)一步，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、VC反應(yīng)液、VC檢測(cè)液、SAT酶液、VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)，其中裂解液含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕獲探針和磁珠；洗滌液含NaCl和SDS ；VC 反應(yīng)液含 dNTP 和 NTP ；VC檢測(cè)液含T7引物、nT7引物、VC檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；SAT酶液含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶；VC陽(yáng)性對(duì)照；含霍亂弧菌(VC) toxR基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；VC陰性對(duì)照不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液,如生理鹽水；VC內(nèi)標(biāo)含VC內(nèi)標(biāo)RNA(序列如序列表中序列I所示)稀釋物。具體的，所述試劑盒中一個(gè)反應(yīng)單位中上述各種試劑組成如下(I)裂解液HEPES 25-250mM, (NH4) 2S045_50mM ;(2)核酸提取液HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM，捕獲探針1-50 u M (優(yōu)選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1% SDS, EDTA I-IOmM ；(4) VC 反應(yīng)液Tris 10_50mM, MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(優(yōu)選為 0. 5_5mM)，NTP l-20mM(優(yōu)選為 1-lOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
(5)VC檢測(cè)液將VC檢測(cè)引物和VC檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-15pmol/反應(yīng)均可；其中17引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，n!7引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，VC檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)；(6) SAT 酶液=M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應(yīng))、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1000U/ 反應(yīng))、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L_cysteine、0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) VC陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
⑶VC陰性對(duì)照不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液；(9) VC內(nèi)標(biāo)含IO5-IO8拷貝/mL VC IC RNA (序列如序列表中序列7所示)體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物。另一種更具體形式，所述試劑盒由A盒即標(biāo)本處理單元和B盒即核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述VC反應(yīng)液、VC檢測(cè)液、SAT酶液、VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照及VC內(nèi)標(biāo)。所述VC陽(yáng)性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的VC RNA以下述方法制備I)用化學(xué)合成法合成VC toxR中無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構(gòu)建VC陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；3) VC陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-VC菌株，貯存于-70。。4)從pGEM -T-VC菌株中提取pGEM -T-VC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。所述VC內(nèi)標(biāo)中的體外轉(zhuǎn)錄的VC IC RNA以下述方法制備I)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同VC靶標(biāo)序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；2)將片段克隆至ljpGEM -T載體中，構(gòu)建VC內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；3)VC內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM _T_VC IC菌株，貯存于-70。。； 4)從pGEM -T-VC IC菌株中提取pGEM -T-VC IC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。所述霍亂弧菌(VC)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中的專用試劑，為以下表示的物質(zhì)之一(I)可與序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；(2)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測(cè)引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；(3)用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VC檢測(cè)探針，所述VC檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)；(4)內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，內(nèi)標(biāo)為VC核苷酸序列(VC RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物(T7和n!7引物)，內(nèi)標(biāo)的核苷酸序列如序列表中序列7所示VC IC RNA,內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。所述試劑盒的使用方法，用于霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，包括以下操作
I)用裂解液裂解待測(cè)樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液；2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內(nèi)存在VC內(nèi)標(biāo)時(shí)，同時(shí)加入VC內(nèi)標(biāo)，使捕獲探針與靶標(biāo)或內(nèi)標(biāo)核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得到霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ；3)將步驟2)提取的霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA加入由VC反應(yīng)液和VC檢測(cè)液組成的第一階段反應(yīng)物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應(yīng)物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測(cè)儀同步記錄熒光信號(hào)的變化；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比為3 I ；4)根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度參照VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。本發(fā)明提供了一種霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，使用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，與現(xiàn)有的VC檢測(cè)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)高特異性、高純度、低污染針對(duì)VC靶核酸設(shè)計(jì)的優(yōu)選捕獲探針，可高效、特異性捕獲VC的RNA。同時(shí)，由于采取封閉式的恒溫放大檢測(cè)系統(tǒng)，整個(gè)過(guò)程中無(wú)需打開反應(yīng)體系，因而避免了擴(kuò)增子的污染。(2)快速檢測(cè)將核酸的擴(kuò)增與檢測(cè)在同一封閉體系中同步進(jìn)行，而且整個(gè)過(guò)程中沒有溫度的升降及循環(huán)，因而所需時(shí)間大大縮短，擴(kuò)增檢測(cè)只需要50分鐘。(3)污染易控與實(shí)時(shí)熒光PCR相比，本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物是RNA，RNA在自然界中極易降解，所以污染控制較容易。(4)設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，本發(fā)明所用的儀器無(wú)需升降溫循環(huán)，因而設(shè)計(jì)和生產(chǎn)成本大幅降低。綜上所述，本發(fā)明試劑盒能夠檢測(cè)食品中的VC RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達(dá)100CFU/ml)、污染低(擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及快速檢測(cè)(50分鐘完成擴(kuò)增檢測(cè))的特點(diǎn)，將在霍亂弧菌快速檢測(cè)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖I顯示靈敏度的檢測(cè)結(jié)果圖2顯示陰性特異性參考品的檢測(cè)結(jié)果圖3為食品樣本的靶標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果圖4為食品樣本的內(nèi)標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式本發(fā)明霍亂弧菌(VC)檢測(cè)技術(shù)，將特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增(SAT)技術(shù)結(jié)合而形成。由于霍亂弧菌包括的亞型較多，如常見的01、0139，所以要覆蓋如此多的亞型，在 檢測(cè)靶標(biāo)的選擇上就必須考慮試劑盒對(duì)各亞型檢測(cè)的通用性，因此必須選擇在各個(gè)亞型之間保守性較強(qiáng)的基因作為檢測(cè)靶標(biāo)。霍亂弧菌各亞型之間保守性強(qiáng)的基因?yàn)閠oxR，因此本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)研究分析確定了 toxR上一段保守性強(qiáng)的序列作為檢測(cè)靶標(biāo)。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)專用的捕獲探針，高效、特異性捕獲VC的RNA;核酸擴(kuò)增使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA多聚酶來(lái)同時(shí)實(shí)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生靶標(biāo)核酸RNA的一個(gè)DNA拷貝，17 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化檢測(cè)探針和擴(kuò)增后產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號(hào)可由檢測(cè)儀器捕獲。本發(fā)明中的專用引物和探針包括(I)捕獲探針一條可與序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標(biāo)核酸(VCRNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO，Target Capture Oligo)，在有VC內(nèi)標(biāo)(VC IC RNA)時(shí)，其還可與該VC內(nèi)標(biāo)序列特異結(jié)合；所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示。(2) VC檢測(cè)引物一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測(cè)引物，所述VC檢測(cè)引物由T7引物和nT7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；(3) VC檢測(cè)探針一條用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VC靶標(biāo)核酸(VCRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VC檢測(cè)探針，所述VC檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM熒光標(biāo)記，3’端用DABCYL熒光標(biāo)記。為便于進(jìn)行結(jié)果分析，還包括(4) 一條內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針和VC內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為在使用VC內(nèi)標(biāo)時(shí)與該內(nèi)標(biāo)配合使用的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)；VC內(nèi)標(biāo)為VC核苷酸序列(VC RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，同時(shí)與所述捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物CT7和n!7引物)。VC內(nèi)標(biāo)的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名為VC IC RNAdC含義為內(nèi)標(biāo))。基于以上設(shè)計(jì)，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。該試劑盒，至少包含所述捕獲探針(序列2)，一對(duì)所述T7引物(序列3)和n!7引物(序列4)，以及一條所述VC檢測(cè)探針(序列5)。進(jìn)一步，所述試劑盒還可包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述17引物、nT7引物和VC檢測(cè)探針存在于VC檢測(cè)液中。再進(jìn)一步，所述試劑盒還可包含競(jìng)爭(zhēng)性VC內(nèi)標(biāo)(序列7)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針(序列6)，所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于VC檢測(cè)液中。更具體來(lái)講，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、VC反應(yīng)液、VC檢測(cè)液、SAT酶液、VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)，各組分說(shuō)明如下(I)裂解液用于裂解和保存待測(cè)樣品中的霍亂弧菌(VC)，為含有去垢劑和HEPES緩沖液的溶液，去垢劑主要為硫酸銨((NH4)2S04，優(yōu)選為5-50mM)；
(2)核酸提取液用于提取和純化VC菌體RNA，為含捕獲探針1-50 iiM(優(yōu)選為5-25 u M)和磁珠50-500mg/L(優(yōu)選為50_250mg/L)的水溶液；(3)洗滌液用于磁珠清洗，為含Iwt % SDS的水溶液。(4) VC反應(yīng)液SAT擴(kuò)增所需組分，含dNTP 0. I-IOmM(優(yōu)選為0. 5_5mM)和NTPl-20mM(優(yōu)選為I-IOmM)的水溶液；(5) VC檢測(cè)液含SAT擴(kuò)增所需引物和探針的水溶液，各引物或探針的濃度在5-15pmol/反應(yīng)均可，其中17引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為
12.5pmol/反應(yīng),VC檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)；(6) SAT酶液SAT擴(kuò)增所需多酶反應(yīng)體系，主要含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1500U/反應(yīng))、I7RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng))；(7) VC陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；⑶VC陰性對(duì)照不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液，如生理鹽水；(9) VC內(nèi)標(biāo)含IO5-IO8拷貝/mL VC內(nèi)標(biāo)RNA (序列7)，是VC核苷酸序列(VC RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，為體外轉(zhuǎn)錄RNA(VC IC RNA)稀釋物。以上所述試劑盒中各組成的進(jìn)一步說(shuō)明如下裂解液的主要有效成分是去垢劑，高濃度去垢劑的存在能夠使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分離法進(jìn)行核酸提取，其主要成分為磁性顆粒和捕獲探針。捕獲探針一端與靶標(biāo)互補(bǔ)，一端與磁性顆?；パa(bǔ)連接，在核酸提取過(guò)程中，細(xì)菌裂解釋放出的核酸與核酸提取液中的磁性顆粒特異結(jié)合，在不需要傳統(tǒng)的離心操作的情況下，通過(guò)洗滌液清洗磁性顆粒而獲得純凈的細(xì)菌靶標(biāo)核酸(RNA)。細(xì)菌RNA的提取通過(guò)特異性吸附原理來(lái)實(shí)現(xiàn)。VC檢測(cè)液中VC檢測(cè)探針為分子信標(biāo)，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端分別共價(jià)標(biāo)記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發(fā)夾型或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)的環(huán)部分和靶標(biāo)互補(bǔ)，兩頭由于互補(bǔ)而成為莖，分子信標(biāo)探針與線性的TaqMan探針相t匕，因其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。由于SAT擴(kuò)增易受多種因素影響而使擴(kuò)增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯(cuò)誤的結(jié)論，本發(fā)明的試劑盒中設(shè)置了 VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)。其中，IVA陽(yáng)性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)為體外轉(zhuǎn)錄的RNA，不具有生物學(xué)活性。通過(guò)檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照，可證明試劑盒檢測(cè)方法及材料無(wú)誤，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)可以監(jiān)測(cè)每次檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性及試劑盒批次間的差異。VC內(nèi)標(biāo)作為VC RNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，其最主要的作用就是控制假陰性結(jié)果的發(fā)生，通過(guò)檢測(cè)加入有內(nèi)標(biāo)的樣本，可了解整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系是否受抑制，更好的提示假陰性。陰性對(duì)照可排除假陽(yáng)性，在正確使用試劑盒檢測(cè)方法和材料情況下，可保證檢測(cè)的特異性。利用以上試劑盒對(duì)霍亂弧菌(VC)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，包括以下步驟(I)用裂解液裂解待測(cè)樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液； (2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內(nèi)存在VC內(nèi)標(biāo)時(shí)，同時(shí)加入VC內(nèi)標(biāo)，使捕獲探針與靶標(biāo)或內(nèi)標(biāo)核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得到霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ；(3)將步驟2)提取的霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA加入由VC反應(yīng)液和VC檢測(cè)液組成的第一階段反應(yīng)物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應(yīng)物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測(cè)儀同步記錄熒光信號(hào)的變化；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比為3 I ；(4)根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度參照VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。所述步驟4)中的VC陽(yáng)性對(duì)照為含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC)toxR的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；VC陰性對(duì)照為不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液；VC內(nèi)標(biāo)為含IO5-IO8拷貝/mL VC內(nèi)標(biāo)RNA(序列7)稀釋物。實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例中所用主要原料SAT酶液、陽(yáng)性對(duì)照及內(nèi)標(biāo)的體外轉(zhuǎn)錄RNA由美國(guó)RD Biosciences公司提供，7500型PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，MX3005熒光定量?jī)x為Stratagene公司產(chǎn)品，NTPs、dNTPs等試劑和其他儀器均為常規(guī)可商購(gòu)產(chǎn)品。實(shí)施例I、用于實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)霍亂弧菌(VC)的專用引物和探針的設(shè)計(jì)本發(fā)明選擇VC細(xì)菌toxR中無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根據(jù)引物探針設(shè)計(jì)原理，使用DNA ATAR,DNAman軟件和人工設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)霍亂弧菌(VC)的專用引物和探針序列，得到如下具體序列(I) 一條可與如序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列為5’-GCCAGCUGGUAUCUUCGACUGACUUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(序列表中序列 2)；(2) 一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測(cè)引物，所述VC檢測(cè)引物由17引物和n!7弓丨物組成，17引物序列為5，-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATCACCTCGITTGGACGITGGGCCAGCA-3’ (序列表中序列 3)，n!7 引物序列為5’-TCCCCTAAGCAATACTCTGA3’ (序列表中序列 4)；(3) 一條用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VC檢測(cè)探針，所述VC檢測(cè)探針的核苷酸序列為5’-CGCAUAGUGAAGAGAUCAUUCGAGUGCG-3’ (序列表中序列5)，5’端用FAM熒光標(biāo)記，3’端用DABCYL熒光

(4)為便于進(jìn)行結(jié)果分析，還配合試劑盒中增加的競(jìng)爭(zhēng)性VC內(nèi)標(biāo)(序列7)，設(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，VC內(nèi)標(biāo)與VC靶標(biāo)核苷酸(VC RNA)擁有相同的引物結(jié)合區(qū)，兩引物之間的核酸序列或排列不同，使其不能與檢測(cè)探針結(jié)合，但能與內(nèi)標(biāo)探針結(jié)合，所述VC內(nèi)標(biāo)可通過(guò)VC靶標(biāo)模板定點(diǎn)突變構(gòu)建獲得，可與捕獲探針特異性結(jié)合，所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針為與VC檢測(cè)探針序列、突光標(biāo)記不同，但堿基數(shù)一致的探針,所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列為5’ -CGCUGGAGCGUGGUGAGCAGCG-3’ (序列表中序列6)，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。實(shí)施例2、制備霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒利用實(shí)施例I所提供的專用引物和探針，得到本發(fā)明霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包含有捕獲探針(TCO，Target Capture Oligo)、17引物、n!7引物、VC檢測(cè)探針、內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶。所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和VC檢測(cè)探針、內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于VC檢測(cè)液中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具體來(lái)講，所述試劑盒分為2-30°C儲(chǔ)存的A盒(標(biāo)本處理單元)和-15—-35°C儲(chǔ)存的B盒(核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗滌液，B盒包括VC反應(yīng)液、VC檢測(cè)液、SAT酶液、VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照，如果存在內(nèi)標(biāo)，B盒還包括VC內(nèi)標(biāo)，主要成分如下A盒(標(biāo)本處理單元)組成為裂解液；含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕獲探針1-50 uM(優(yōu)選為5-25 u M)和磁珠50_500mg/L (優(yōu)選為50-250mg/L)；洗滌液主要含Iwt % SDS。B盒(核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元)組成為VC 反應(yīng)液含 dNTP 0. I-IOmM (優(yōu)選為 0. 5_5mM)，NTP l_20mM(優(yōu)選為 I-IOmM)；VC檢測(cè)液含引物和探針，各引物和探針的濃度在5-15pmol/反應(yīng)均可，其中17引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，n!7引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，VC檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)；SAT 酶液含 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 400-4000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1500U/ 反應(yīng))，T7RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng));VC陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；VC陰性對(duì)照不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液,如生理鹽水；如果存在內(nèi)標(biāo)，VC內(nèi)標(biāo)含IO5-IO8拷貝/mL VC IC RNA稀釋物(序列表中序列7)。試劑盒中所包含的所有試劑均可按提示以常規(guī)方法制備取得或商業(yè)購(gòu)買得到。具體來(lái)講，每一反應(yīng)單位中，所述試劑盒各種試劑的具體組配如下(I)裂解液為裂解和保存樣本中的霍亂弧菌(VC)，含有硫酸銨和HEPES緩沖液的溶液，具體包含 HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液為提取霍亂弧菌(VC)RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特異結(jié)合靶標(biāo)核酸(VC RNA)的一段RNA序列的溶液，具體包含HEPES 50-400mM, EDTA40-200mM,LiCl 400-2000mM,捕獲探針 1-50 y M(優(yōu)選為 5_25u M)，磁珠 50_500mg/L(優(yōu)選為50-250mg/L)；(3)洗滌液為含 SDS、NaCl 的溶液，具體包含 HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1%SDS 1-lOmM, EDTA I-IOmM ；(4)VC反應(yīng)液為含dNTPs和NTPs擴(kuò)增所需組份，具體包含Tris 10_50mM，MgCl210-40mM, dNTP 0. l-10mM(優(yōu)選為 0. 5_5mM)，NT Pl_20mM(優(yōu)選為 1-lOmM)，PVP401-10%, KCl 5-40mM ；(5) VC檢測(cè)液將恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的VC檢測(cè)引物和VC檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探針濃度在5_15pmol/反應(yīng)均可， 其中T7引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，VC檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)’內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)；(6) SAT酶液為恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)必需的多酶組分體系，含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1500U/反應(yīng))、I7RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1000U/反應(yīng))、2_10mM HEPES pH7.5、IO-IOOmM N-acetyl-L-cysteine>0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose,40-200mM Tris-HCl pH8. 0、40_200mM KCU0. 01-0. 5mM EDTA、
0.1-1 % (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) VC陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；(8) VC陰性對(duì)照不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液，如生理鹽水；(9)如果存在內(nèi)標(biāo)，VC內(nèi)標(biāo)含IO5-IO8拷貝/mL VC內(nèi)標(biāo)RNA (序列表中序列7)。VC陽(yáng)性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的VC RNA，可以通過(guò)多種方法制備所得，其中一種制備方法如下I)用化學(xué)合成法合成VC toxR中無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構(gòu)建VC陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；3) VC陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-VC菌株，貯存于-70。。；4)從pGEM -T-VC菌株中提取pGEM -T-VC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。VC內(nèi)標(biāo)中的體外轉(zhuǎn)錄的VC IC RNA，可以通過(guò)多種方法制備所得，其中一種制備方法如下I)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同VC靶標(biāo)序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構(gòu)建VC內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒；3) VC內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM _T_VC IC菌株，貯存于-70。。；4)從pGEM -T-VCIC菌株中提取pGEM -T-VC IC質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。實(shí)施例3、霍亂弧菌的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)靈敏度用本發(fā)明試劑盒(組成見實(shí)施例2，試劑盒內(nèi)不存在VC內(nèi)標(biāo)和檢測(cè)液中的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針)檢測(cè)食品樣本中的霍亂弧菌(VC)，具體方法包括以下步驟(I)菌液稀釋測(cè)定濃度為I X 105CFU/mL的霍亂弧菌培養(yǎng)物，10倍梯度稀釋到lOcFU/mL作為霍亂弧菌線性靈敏度參考品。(2)核酸提取2. I在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入200 裂解液(含HEPES 35mM, (NH4) 2S0420mM)，200 ill菌液，用裂解液裂解待測(cè)樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液。2. 2在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入100 U I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM,捕獲探針10 u M，磁珠250mg/L)，混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。2. 3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復(fù)2次。2. 4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復(fù)合物，備用(此步應(yīng)清晰可見磁珠)。(3) SAT核酸擴(kuò)增檢測(cè)3. I向樣品處理管中加入40 U I反應(yīng)檢測(cè)液(40 U I VC反應(yīng)液+2. 5 VC檢測(cè)液)洗滌磁珠。VC 反應(yīng)液具體包含 Tris 30mM,MgCl2 IOmM, dNTP lmm, NTP 2mM,PVP405%,KC125mM ；VC檢測(cè)液中T7引物濃度為12. 5pmol, nT7引物濃度為12. 5pmol, VC檢測(cè)探針濃度為5pmol。3. 2取振蕩混勻的上述反應(yīng)檢測(cè)液30 U I加至潔凈微量反應(yīng)管，60°C保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；向微量反應(yīng)管中加入10 u I已預(yù)熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻，用7500型PCR儀(美國(guó)ABI公司產(chǎn)品)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。SAT酶液中含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 750U，T7RNA 聚合酶 500U/ 反應(yīng)，IOmM HEPES pH7. 5，20mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酸-L-半胱氨酸)，0. ImM zinc acetate (乙酸鋒)、IOmMtrehalose (海藻糖)、IOOmMTris-HCl pH8. 0,IOOmM KCl,0. Imm EDTA,0. 8 % (v/v)Triton X-100 和 40 % (v/v)glycerol (丙三醇)；3. 3將微量反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀器(ABI7500熒光定量?jī)x，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長(zhǎng)相近)，42°C反應(yīng)50分鐘，設(shè)定每I分鐘檢測(cè)一次熒光，共檢測(cè)50次。(4)結(jié)果判定根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果得到的曲線，設(shè)定閥值線，讀取dt值，判定結(jié)果。閾值設(shè)定以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(與一般實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的ct值類似)①陽(yáng)性結(jié)果判定
VIC通道dt彡45的樣本為陽(yáng)性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果dt < 50的樣本為陽(yáng)性。②陰性結(jié)果判定VIC通道dt無(wú)數(shù)值或?yàn)?0，則為陰性。(5)結(jié)果圖I顯示靈敏度的檢測(cè)圖，將濃度為IX 105CFU/mL的陽(yáng)性參考品，按10倍梯度稀釋進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)陽(yáng)性參考品的濃度為100CFU/mL的時(shí)候，檢測(cè)dt值為25，即檢測(cè)下限靈敏度可以達(dá)到100CFU/mL。實(shí)施例4、霍亂弧菌的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)特異性本檢測(cè)模式為本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用試劑盒組成同實(shí)施例2，試劑的生產(chǎn)在GMP車 間進(jìn)行；特異性參考品處理的方法如下6例陰性參考品包括金黃色葡萄球菌(SA)、志賀氏 菌(SH)、大腸桿菌0157 (0157)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Lm)、沙門氏菌(Sal. spp.)、副溶血弧菌(VP)，另設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各一個(gè)。檢測(cè)方法同實(shí)施例3，檢測(cè)中所用試劑量同實(shí)施例3。使用本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果如圖2，6個(gè)陰性參考品的擴(kuò)增曲線平直且與基線無(wú)交叉，可明確判定為陰性。6例陰性參考品包括金黃色葡萄球菌(SA)、志賀氏菌(SH)、大腸桿菌0157(0157)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Lm)、沙門氏菌(Sal. spp.)、副溶血弧菌(VP)。實(shí)施例5、實(shí)際食品樣本的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)用本發(fā)明試劑盒(組成見實(shí)施例2，試劑盒含有VC內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)液內(nèi)含有內(nèi)標(biāo)探針)檢測(cè)食品樣品中的霍亂弧菌VC，具體方法包括以下步驟(I)樣本處理稱取25g(mL)樣品裝入盛有225mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打Imin 2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，震蕩混勻。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45°C以下不超過(guò)15min，或2°C 5°C不超過(guò)18h解凍?；魜y弧菌樣本編號(hào)為VC食品標(biāo)本1_10，另設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各一個(gè)。(2)核酸提取2. I在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入200iil裂解液(含HEPES 35mM,(NH4) 2S0420mM)，200 ill菌液，用裂解液裂解待測(cè)樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液。2. 2在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入100 U I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 150mM, LiCl 1500mM,捕獲探針 20 u M,磁珠 250mg/L), 10 U I 內(nèi)標(biāo)溶液(含 I X IO8 拷貝/mL VC內(nèi)標(biāo)RNA)，混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。2. 3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復(fù)2次。2. 4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復(fù)合物，備用(此步應(yīng)清晰可見磁珠)。(3) SAT核酸擴(kuò)增檢測(cè)3. I向樣品處理管中加入40 U I反應(yīng)檢測(cè)液(40 U I VC反應(yīng)液+2. 5 VC檢測(cè)液)洗滌磁珠。VC 反應(yīng)液具體包含 Tris 50mM,MgCl2 2OmM，dNTP 5mM, NTP 10mM,PVP405%,KCl 40mM ;VC檢測(cè)液中T7引物濃度為12. 5pmol，nT7引物濃度為12. 5pmol，VC檢測(cè)探針濃度為5pmol,內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度為5pmol。3. 2取振蕩混勻的上述反應(yīng)檢測(cè)液30 Ul加至潔凈微量反應(yīng)管，60°C保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；向微量反應(yīng)管中加入IOiU已預(yù)熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻，用7500型PCR儀(美國(guó)ABI公司產(chǎn)品)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。SAT酶液中含 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1500U，T7RNA 聚合酶 1000U/ 反應(yīng)，IOmM HEPES pH7. 5，50mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酸-L-半胱氨酸)，0. 4mM zinc acetate (乙酸鋒)、60mMtrehalose (海藻糖)、IOOmM Tris-HCl pH8. 0,200mM KC1,0. 3mM EDTA,0. 8% (v/v) TritonX-100 和 40% (v/v) glycerol (丙三醇)。3. 3將微量反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀器(ABI7500熒光定量?jī)x，ABI公司產(chǎn)品，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長(zhǎng)相近)，42°C反應(yīng)50分鐘，設(shè)定每I分鐘檢測(cè)一次熒光，共檢測(cè)50次。
(4)結(jié)果判定根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果得到的曲線，設(shè)定閥值線，讀取dt值，判定結(jié)果。閾值設(shè)定以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(與一般實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的ct值類似)③陽(yáng)性結(jié)果判定Fl通道dt ( 45的樣本為陽(yáng)性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果Fl通道dt < 50的樣本為陽(yáng)性。④陰性結(jié)果判定F1通道dt無(wú)數(shù)值或?yàn)?0，同時(shí)F2通道dt ( 45，則為陰性。質(zhì)量控制每次檢測(cè)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，且結(jié)果應(yīng)同時(shí)滿足陽(yáng)性對(duì)照Fl通道dt < 45 ;陰性對(duì)照Fl通道dt無(wú)數(shù)值或?yàn)?0，同時(shí)F2通道dt < 45，否則此次檢測(cè)結(jié)果視為無(wú)效。(5)結(jié)果根據(jù)Fl通道(圖3)和F2通道(圖4)的dt值情況，判定樣本3、7檢測(cè)為陽(yáng)性，樣本1、2、4、5、6、8、9、10為陰性(樣本1、2、4、5、6、8、9、10圖3顯示為陰性，圖4顯示有信號(hào)，正說(shuō)明內(nèi)標(biāo)可檢測(cè)出，反應(yīng)體系沒有受環(huán)境影響，排除假陰性)。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)即可對(duì)本發(fā)明所要求保護(hù)的霍亂弧菌(VC)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)施，并達(dá)到預(yù)期效果。本發(fā)明公開的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但并不足構(gòu)成對(duì)本發(fā)明限制。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員用顯而易見的相似替代物或改造，或用某些在化學(xué)上或生物上結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的制劑替代在此描述的制劑，或?qū)Ρ景l(fā)明相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行變動(dòng)，但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想，均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包含有一條序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標(biāo)核酸(VC RNA)的捕獲探針，一對(duì)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測(cè)引物17和nT7，和一條用于與在17RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VC檢測(cè)探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述試劑盒，其特征在于所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC檢測(cè)引物由T7引物和n!7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述VC檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和17 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、n!7引物和VC檢測(cè)探針存在于一 VC檢測(cè)液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有VC內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；所述VC內(nèi)標(biāo)為VC核苷酸序列(VC RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可與捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物(T7和n!7引物)，由序列表中序列7所示的VC IC RNA ;所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)，且所述內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于VC檢測(cè)液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、VC反應(yīng)液、VC檢測(cè)液、SAT酶液、VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)，其中 裂解液含硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ； 核酸提取液含捕獲探針和磁珠； 洗滌液含NaCl和SDS ； VC反應(yīng)液含dNTP和NTP ； VC檢測(cè)液含17引物、n!7引物、VC檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針； SAT酶液含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶； VC陽(yáng)性對(duì)照；含霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物； VC陰性對(duì)照不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液，如生理鹽水； VC內(nèi)標(biāo)VC IC RNA (序列如序列表中序列I所示)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中一個(gè)反應(yīng)單位中各種試劑組成如下(1)裂解液HEPES25-250mM,(NH4)2SO4 5_50mM ； (2)核酸提取液HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50 u M (優(yōu)選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優(yōu)選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA I-IOmM ；(4)VC 反應(yīng)液Tris 10_50mM，MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(優(yōu)選為 0. 5_5mM)，NTPl-20mM(優(yōu)選為 I-IOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ； (5)VC檢測(cè)液將VC檢測(cè)引物和VC檢測(cè)探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-15pmol/反應(yīng)均可；其中17引物濃度優(yōu)選為.12. 5pmol/反應(yīng)，nT7引物濃度優(yōu)選為12. 5pmol/反應(yīng)，VC檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針濃度優(yōu)選為5pmol/反應(yīng)； (6)SAT酶液M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)(優(yōu)選為500-1500U/反應(yīng))、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(yīng)(優(yōu)選為 500-1000U/ 反應(yīng))、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine^0. 04-0. 4mM zinc acetate^IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ； (7)VC陽(yáng)性對(duì)照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物； (8)VC陰性對(duì)照不含有霍亂弧菌(VC)靶標(biāo)核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液； (9)VC內(nèi)標(biāo)含IO5-IO8拷貝/mL VCIC RNA(序列如序列表中序列7所示)體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于由A盒即標(biāo)本處理單元和B盒即核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述VC反應(yīng)液、VC檢測(cè)液、SAT酶液、VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照及VC內(nèi)標(biāo)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于所述VC陽(yáng)性對(duì)照中的體外轉(zhuǎn)錄的VC RNA以下述方法制備 (1)用化學(xué)合成法合成VCtoxR中無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)； (2)將片段克隆到pGEW-T載體中，構(gòu)建VC陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒； (3)VC陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名SpGEMs -T-VC菌株，貯存于_70°C ； (4)純化去除DNA，并定量、鑒定RNA； 存在VC內(nèi)標(biāo)時(shí)，體外轉(zhuǎn)錄的VC IC RNA以下述方法制備 (1)用化學(xué)合成法合成一段除探針檢測(cè)區(qū)域序列不同，其他序列基本同VC靶標(biāo)序列區(qū)域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)； (2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構(gòu)建VC內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒； (3)VC內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-VC IC菌株，貯存于-70°C; (4)純化去除DNA，并定量、鑒定內(nèi)標(biāo)RNA。
9.權(quán)利要求1-8任一所述霍亂弧菌(VC)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中的專用試劑，為以下表示的物質(zhì)之一 (1)可與序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標(biāo)核酸(VCRNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示； (2)用于在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生VC靶標(biāo)核酸(VCRNA)的DNA拷貝的VC檢測(cè)引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示； (3)用于與在17RNA聚合酶作用下根據(jù)所述VC靶標(biāo)核酸(VC RNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的VC檢測(cè)探針，所述VC檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)；(4)內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針，內(nèi)標(biāo)為VC核苷酸序列(VC RNA)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，可與(I)所述捕獲探針特異性結(jié)合，并使用同一對(duì)引物(T7和n!7引物)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示,5’端標(biāo)記HEX突光基團(tuán),3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
10.一種權(quán)利要求1-8任一所述的試劑盒的使用方法，用于霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，包括以下操作 (1)用裂解液裂解待測(cè)樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液； (2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內(nèi)存在VC內(nèi)標(biāo)時(shí)，同時(shí)加入VC內(nèi)標(biāo)，使捕獲探針與靶標(biāo)或內(nèi)標(biāo)核酸特異結(jié)合后再與磁珠結(jié)合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結(jié)合的核酸，得到霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ； (3)將步驟2)提取的霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VCIC RNA加入由VC反應(yīng)液和VC檢測(cè)液組成的第一階段反應(yīng)物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應(yīng)物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續(xù)溫育50分鐘，用檢測(cè)儀同步記錄熒光信號(hào)的變化；所述第一階段反應(yīng)物與第二階段酶反應(yīng)物的體積比為3 I ； (4)根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和強(qiáng)度參照VC陽(yáng)性對(duì)照、VC陰性對(duì)照和VC內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種霍亂弧菌(VC)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。包括捕獲探針、VC檢測(cè)引物T7引物和nT7引物、VC檢測(cè)探針、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶等試劑。本發(fā)明試劑盒能夠檢測(cè)食品中的VC RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達(dá)100 CFU/ml)、污染低(擴(kuò)增產(chǎn)物RNA在自然環(huán)境下易于降解)及快速檢測(cè)(常規(guī)50分鐘完成檢測(cè))的特點(diǎn)，將在霍亂弧菌快速檢測(cè)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102719542SQ20121020330
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者于明輝, 居金良, 張長(zhǎng)明, 李豪 申請(qǐng)人:上海仁度生物科技有限公司