骨骼肌氯離子通道基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸、分離的多肽、篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的方法、篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的試劑盒。其中，分離的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有選自下列的至少一種突變：c.26552_656insC、c.1616C>T、c.2057_2058delAC以及c.313C>T。通過檢測(cè)這些新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易感先天性肌強(qiáng)直疾病。
【專利說明】骨骼肌氯離子通道基因突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及骨骼肌氯離子通道基因突變體及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及分離的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸、分離的多肽、篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的方法、篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]先天性肌強(qiáng)直(myotonia congenital, MC)是以骨骼肌強(qiáng)直和肥大為主要臨床表現(xiàn)的一種遺傳性肌病，多數(shù)在出生時(shí)或兒童早期即發(fā)病，少數(shù)至青春期發(fā)病。發(fā)病率為
.0.3~0.6/10萬，即全中國(guó)大約有3000-6000名MC患者。依遺傳方式不同，MC可分為Thomsen病(常染色體顯性遺傳)和Becker病(常染色體隱性遺傳)，均由骨骼肌氯離子通道(CLC-1)異常引起。而CLC-1是由骨骼肌氯離子通道基因(CLCNl)編碼的，位于人類7號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)5帶(7q35)，有23個(gè)外顯子，編碼988個(gè)氨基酸。迄今為止，已有近130種突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，散布于整個(gè)CLCNl上，無高發(fā)熱點(diǎn)區(qū)，但也有近1/3先天性肌強(qiáng)直患者未發(fā)現(xiàn)突變。
[0003]因而，目前對(duì)先天性肌強(qiáng)直疾病的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出先天性肌強(qiáng)直疾病的致病基因CLCNl上的新突變。
[0005]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作而完成的:發(fā)明人通過目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序的方法確定了先天性肌強(qiáng)直疾病的致病基因上的新突變。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與SEQ ID NO:1相比，該核酸具有選自下列的至少一種突變:.c.2655_2656insC、c.1616C>T、c.2057_2058delAC 以及 c.313C>T。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了多個(gè)骨骼肌氯離子通道基因的新突變體，這些新突變體與先天性肌強(qiáng)直疾病的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測(cè)這些新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易感先天性肌強(qiáng)直疾病。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與SEQ ID N0:2相比，該分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Ser886Glnfs*26、p.Thr539Ile、p.Tyr686Xfs*l以及p.Argl05Cys。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該多肽是由前述分離的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸編碼的。通過檢測(cè)生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易感先天性肌強(qiáng)直疾病。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的方法包括以下步驟:從生物樣品提取核酸樣本；確定核酸樣本的核酸序列；該核酸樣本的核酸序列或其互補(bǔ)序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.2655_2656insC、c.1616C>T、 c.2057_2058delAC以及c.313C>T的至少一種突變是生物樣品易感先天性肌強(qiáng)直疾病的指示。通過根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的方法，可以有效地篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的系統(tǒng)包括:核酸提取裝置，該核酸提取裝置用于從生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置， 該核酸序列確定裝置與核酸提取裝置相連，用于對(duì)核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，該判斷裝置與核酸序列確定裝置相連，以便基于核酸樣本的核酸序列或其互補(bǔ)序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有選自c.2655_2656insC、c.1616C>T、 c.2057_2058delAC以及c.313C>T的至少一種突變，判斷生物樣品是否易感先天性肌強(qiáng)直疾病。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實(shí)施前述篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該用于篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的試劑盒包括:適于檢測(cè)骨骼肌氯離子通道基因突變體的試劑，其中與SEQ ID N0:1相比，骨骼肌氯離子通道基因突變體具有選自c.2655_2656insC、c.1616C>T、c.2057_2058delAC以及c.313C>T的至少一種突變。利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒，能夠有效地篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品。
[0011]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0013]圖1:顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的系統(tǒng)及其組成部分的示意圖，其中，A為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，B為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸提取裝置的示意圖，C為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0014]圖2:顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的對(duì)患者I的骨骼肌氯離子通道基因突變位點(diǎn)的 Sanger測(cè)序驗(yàn)證峰圖；以及
[0015]圖3:顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的對(duì)患者2及其父母的骨骼肌氯離子通道基因突變位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證峰圖,其中,A為患者2與其母親的突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序驗(yàn)證峰圖，B為患者2與其父親的突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序驗(yàn)證峰圖。
【具體實(shí)施方式】`
[0016]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。[0017]骨骼肌氯離子通道基因突變體
[0018]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與SEQ ID NO:1相比，該核酸具有選自下列的至少一種突變:c.2655_2656insC、c.1616C>T、c.2057_2058delAC 以及 c.313C>T，優(yōu)選地，該核酸具有 c.2655_2656insC 和 c.1616C>T,或 c.2057_2058delAC 和 c.313C>T 的組合突變。在本文中所使用的表達(dá)方式“編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸”，是指與編碼骨骼肌氯離子通道突變體的基因相對(duì)應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與骨骼肌氯離子通道突變體的編碼基因相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體示例，前面所述的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸為DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確了多個(gè)骨骼肌氯離子通道基因的新突變體，這些新突變體與先天性肌強(qiáng)直疾病的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測(cè)這些新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易感先天性肌強(qiáng)直疾病，也可以通過檢測(cè)這些突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測(cè)生物體是否易感先天性肌強(qiáng)直疾病。
[0019]這些編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸，是本申請(qǐng)的發(fā)明人通過目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序的方法，針對(duì)多個(gè)患者樣本進(jìn)行測(cè)序，確定的先天性肌強(qiáng)直疾病的致病基因上的新突變。
[0020]需要說明的是，骨骼肌氯離子通道基因即CLCN1，定位于人類7號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū) 5帶(7q35)，有23個(gè)外顯子，cDNA序列(來自NCBI的Genbank，登錄號(hào)為NM_000083.2)如下所示:
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的編碼骨骼肌氯離子通道突變體的核酸，其特征在于，與SEQ ID NO:I相比，所述核酸具有選自下列的至少一種突變:c.2655_2656insC、c.1616C>T、c.2057_2058delAC 以及 c.313C>T, 優(yōu)選地，所述核酸具有 c.2655-2656insC 和 c.16I6OT,或 c.2057_2058delAC 和c.313C>T的組合突變， 任選地，所述核酸為DNA。
2.一種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Ser886Glnfs*26、p.Thr539Ile> p.Tyr686Xfs*l 以及 p.Argl05Cys, 優(yōu)選地，所述多肽具有 P.Ser886Glnfs*26 和 p.Thr539Ile,或 p.Tyr686Xfs*l 和p.Argl05Cys的組合突變， 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。
3.一種篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列或其互補(bǔ)序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.2655_2656insC、c.1616C>T、c.2057-2058delAC 以及 c.313C>T 的至少一種突變是所述生物樣品易感先天性肌強(qiáng)直疾病的指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液、皮膚、毛發(fā)和肌肉的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進(jìn)一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進(jìn)一步包括: 針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；以及 對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果，任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一種對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序， 任選地,針對(duì)所述核酸樣本,構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)一步包括: 利用骨骼肌氯離子通道外顯子特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及 針對(duì)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測(cè)序文庫(kù)， 任選地，所述骨骼肌氯離子通道外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:3-32所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列或其互補(bǔ)序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有選自c.2655_2656insC、c.1616C>T、 c.2057_2058delAC以及c.313C>T的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易感先天性肌強(qiáng)直疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括:RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對(duì)所述RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括:文庫(kù)構(gòu)建單元，所述文庫(kù)構(gòu)建單元用于針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；以及測(cè)序單元，所述測(cè)序單元與所述文庫(kù)構(gòu)建單元相連，用于對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果，任選地,所述文庫(kù)構(gòu)建單元進(jìn)一步包括:PCR擴(kuò)增模塊，所述PC R擴(kuò)增模塊中設(shè)置有骨骼肌氯離子通道外顯子特異性引物，以便利用骨骼肌氯離子通道外顯子特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，任選地，所述骨骼肌氯離子通道外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:3-32所示的核苷酸序列，任選地，所述測(cè)序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測(cè)序裝置的至少一種。
9.一種用于篩選易感先天性肌強(qiáng)直疾病的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有: 適于檢測(cè)骨骼肌氯離子通道基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述骨骼肌氯離子通道基因突變體具有選自c.2655_2656insC、c.1616C>T、c.2057_2058delAC以及 c.313C>T的至少一種突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑為核酸探針。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103509801SQ201210205445
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月20日
【發(fā)明者】王金明, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司