專利名稱：一種鏈霉菌新菌株及dna鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種放線菌及其鑒定方法，具體涉及一種鏈霉菌新菌株及DNA鑒定方法。
背景技術：
鏈霉菌是放線菌中最占優(yōu)勢、數(shù)量最大、應用最廣的一類。迄今為止，關于放線菌的研究多數(shù)是圍繞著鏈霉菌展開的，絕大多數(shù)抗生素也是由鏈霉菌產(chǎn)生的，據(jù)統(tǒng)計，世界上所知道的數(shù)千種抗生素中70%是由鏈霉菌產(chǎn)生的。吉林農(nóng)業(yè)大學《生物物理學碩士論文》，2008.隋麗等發(fā)表“放線菌769對水稻抗稻瘟病的誘導抗性研究”介紹了放線菌對大腸桿菌、高梁散黑穗、構巢曲霉菌、禾谷鐮刀病 原菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、番茄灰霉病原菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、大豆霜霉病原菌、黃瓜黑星病菌、玉米穗腐病原菌、大豆灰斑病菌、番茄葉霉病原菌、分枝桿菌、番茄炭疽病菌、葡萄霜霉病原菌、辣椒黑斑病原菌、玉米人斑、番茄早疫病原菌、玉米彎孢病菌等病原菌具有抗性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種鏈霉菌新菌株及DNA鑒定方法，為進一步開發(fā)利用打下基礎。本發(fā)明的一種鏈霉菌新菌株(Streptomyces fujianensis sp簡稱Js_lT),是2009年10月9日在福州市食用菌場于銀耳菌筒病害研究中從銀耳菌筒上分離培養(yǎng)純化，通過誘變和篩選，獲得的菌株，2011年10月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學)，菌株保藏號為CCTCC NO M2011365o Js-It對真菌、細菌的生長有很強的抑制作用，經(jīng)測定，Js-It對大腸桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、稻瘟病、核盤菌、木霉、根霉、疣孢霉等的抗性很強，具有很好的開發(fā)應用前景。Js-It (CCTCC NO M2011365)的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基PDA :馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂條20g，水IOOOmL ;培養(yǎng)條件為常規(guī)的鏈霉菌培養(yǎng)，無特殊要求。Js-It (CCTCC NO :M2011365)的DNA鑒定方法，包括菌株活化、菌絲培養(yǎng)與收集、CTAB法提取基因組DNA、NRPS合成酶基因的擴增、目的基因片段的克隆和目的基因片段的測序；其特征在于測序的結果如下
CCCACGATGATCAGGATGCTGGTGCCACCGATCGAGTTGCCCGCACCGCCATAGCTCGCCAACGCCACCGTC
GGCGCGAGAGCGATCAGCCCCAGGTACAGCGAACCCGGCCACGTGATCCGGTTGAGCACGTAGCTCAGGTACTCAGC
GGTCGGACGACCGGCGCGAATACCTGGGATGAAGCCACCATACTTCTTCATATTGTCGGCCACTTCCTCGGGGTTGA
ACGAGATCGCCACGTAGAAGAAGGCGAAGAACACGATCAACAGGAAGTAGGCCGTCACGTAGTACGGGTGGTCACCC
TTGACGAAGTTGTCCTGGATCCAGGTCTTCCAACCCGAGGTGGAGCTGGAGAACTGCGCGATCAGCGCGGGGATGTA
CAGCAGCGAAGAGGCGAAGATGACCGGGATCACACCGGCCTGGTTCACCTTGAGGGGGATGTACGTCGAGGTCCCGC
CGTAGGAGCGACGGCCGATCATCCGCTTCGCGTACCGCACGGGTGACGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG。DNA序列是一個物種最直接的特征，具有特異性，是區(qū)別其它特種的本質所在。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
I、Js-It對真菌、細菌的生長有很強的抑制作用，具有很好的開發(fā)應用前景。2、Js-It的DNA鑒定方法具有真實可靠，一目了然的特點，比經(jīng)典的形態(tài)鑒定誤差小，判斷更直觀。3、Js-It的DNA鑒定方法操作簡單，檢測時間短，經(jīng)典的形態(tài) 鑒定需要檢測的指標多，時間長且需要綜合起來分析。


圖I為Js-It (CCTCC NO M2011365)的NRPS電泳圖；圖中:M為分子量是DL2000的DNAMark，左側是具體的分子量，HO表示樣品為Js_lT，HO上的條帶為750bp ；
圖2為Js-It (CCTCC NO M2011365)對I類疣孢霉的防治效果，防效達68. 77% ；
圖3為Js-It (CCTCC NO M2011365)對II類疣孢霉的防治效果，防效達83. 84% ；
圖4為Js-It (CCTCC NO M2011365)對III類疣孢霉的防治效果，防效達85. 62% ；
圖5為對照CK的發(fā)病情況。
具體實施例方式 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的闡述。實施例I、Js-It (CCTCC NO M2011365)的DNA鑒定方法，包括以下步驟
I.材料選擇
菌株來源鏈霉菌菌株編號HO，分離自銀耳“楊霉霜菌”發(fā)病菌筒，即鏈霉菌Js-1T。培養(yǎng)基PDA斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20 g，蒸餾水1000mL。Bennett液體培養(yǎng)基葡萄糖10g，酵母浸膏l(xiāng)g，牛肉浸膏l(xiāng)g，酵母水解酪素(casein) 2g,瓊脂粉 15g,蒸懼水 1000mL。LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸餾水lOOOmL，pH 7。LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂20 g，蒸餾水IOOOmL, pH 7。試劑與儀器
CTAB 抽提液100 mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB,20 mmol/L EDTA, I. 4 mol/L NaCl,pH 8. 0;
CTAB 沉淀液50 mmol/L Tris-HCl, I. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA, pH 8. 0;
CTAB/NaCl :0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
氯仿異戊醇體積比氯仿比異戊醇為24比I ;
TE 緩沖液10 mmol/L Tris HCl，I mmol/L EDTA ；
0.5XTBE 44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HB03、1 mmol/L EDTA;
上樣緩沖液0. 1%溴酚藍，40%蔗糖；
EB 10 mg/mL溴化乙錠；
PCR擴增試劑及酶均購自大連寶生物公司。主要儀器
Sff-CJ-IFB型單人水平垂直兩用凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司滅菌鍋上海三申
HYG-A全溫搖瓶柜太倉市實驗室
冷凍離心機Sigma 3K30
PCR 擴增儀Eppendorf AG22331 Hamburg
掌型離心機江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-IOO手掌型離心機
SDC-6節(jié)能型智能恒溫槽寧波新芝生物科技股份有限公司
凝膠成像系統(tǒng)TAN0N-2008
2鑒定方法
2.I菌株活化使用接種環(huán)將Js-It菌株劃線接種于PDA斜面上，28°C培養(yǎng)7_10天。2. 2菌絲培養(yǎng)與收集
(1)將步驟2.I獲得的再生菌株轉接含IOOmL Bennett液體培養(yǎng)基的250 mL廣口三角瓶中；
(2)放置于28°C培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)7 10d ；
(3)用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；
(4)稱取O.5 I. 3g菌絲，用濾紙包好，保存于_20°C備用。2. 3 CTAB法提取基因組DNA
(1)取步驟2.2(4)保存?zhèn)溆玫木z0.5 I. 3g放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉入7mL的離心管；
(2)加2.5 mL 65°C預熱的抽提液，同時加入50 μ L巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質變性沉淀；
(3)65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩I次；
(4)加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質；
(5)8000 r/min, 4°C離心 IOmin,取上清到 7mL 管；
(6)加1/5體積65°C預熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 mL的氯仿異戊醇混勻；
(7)10000r/min, 4°C離心 IOmin,取上清；
(8)加入2.5 mL 65°C預熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65°C水浴Ih ；
(9)12000r/min, 4°C離心IOmin后，去除上清液；
(10)用O.5mL TE溶液或無菌水溶解沉淀IOmin ；
(11)加入O.25mL飽和酚和O. 25mL氯仿異戊醇，混勻； (12)12000r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積在4°C預冷的無水乙醇，混勻；
(13)放置-20°C冰箱Ih或過夜；
(14)12000 r/min, 4°C離心 10 min,棄上清；
(15)自然風干沉淀，用30UL TE溶液或無菌去離子水溶解沉淀，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 4 NRPS合成酶基因的擴增
NRPS-PCR 擴增反應體系1 μ L 含量 50 100 ng 的 DNA，2.5yL IOXPCRbuffer, 2μ L 濃度為 2.5 m mol/L 的 dNTP，I μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 A3, A3 序列為 5’ -GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3’，I μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 A7R, A7R 序列為5，-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3，，0· 3 μ L 酶活為 5 U/uL 的 Taq DNA Polymerase, 17. 2 μ LddH20。
NRPS-PCR擴增反應體系95°C預變性 5 min ;95°C變性 30s，59°C退火2min，72°C延伸lmin, 35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。2. 5電泳檢測
經(jīng)NRPS-PCR的擴增產(chǎn)取8 μ L與2 μ L上樣緩沖液混勻，點樣于重量比為I. 2%的瓊脂糖凝膠上，于O. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳50min ;經(jīng)電泳檢測，如圖I所示，得到一個750bp的DNA片段。2.6目的基因片段的克隆
2.6. I連接
將經(jīng)電泳檢測的NRPS-PCR擴增的DNA片段，連接到載體pMD 18-T Vector上，操作方法按TaKaRa公司提供的pMD 18_T Vector說明書操作。 2. 6. 2 轉化
Cl)每管感受態(tài)細胞100 μ L中加入10 μ L連接產(chǎn)物，混勻，在冰中放置30 min ；
(2)離心管在42°C靜止水浴I 2min；
(3)將離心管轉移到冰浴中，冷卻2min ；
(4)加入890μ L LB液體培養(yǎng)基，370C 120rpm搖床培養(yǎng)45min lh，使細菌復蘇；所述LB液體培養(yǎng)基為胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH7，蒸餾水1L。(5)將融化的LB固體培養(yǎng)基在無菌操作下倒進已滅菌過的培養(yǎng)皿中，每200mL LB加200 μ L 100mg/mL氨芐青霉素，使其終濃度為100 μ g/mL ；
(6)吸取200μ L已轉化的感受態(tài)細胞到凝固的LB平板上，涂布均勻，封口膜封口 ；
(7)平板室溫靜置10min至液體被吸收，將培養(yǎng)皿倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h_16h至菌落可見。2. 6. 3陽性菌落的篩選
I、待“2. 6. 2”的“(7)”中的培養(yǎng)皿上出現(xiàn)菌落直徑小于等于Imm時，用接種環(huán)挑取邊緣齊整的單菌落，劃線至新的LB平板上37°C培養(yǎng)，并做好編號。新菌落長出后，用接種環(huán)刮一環(huán)到20 μ L無菌雙蒸餾水中，混勻后取其中的2 μ L作為PCR擴增的模板，用通用引物進行PCR驗證，若PCR產(chǎn)物大小比750bp大150bp，則挑取的菌落為陽性菌落。菌落PCR 擴增體系2μ L 菌液，2· 5μ L 10XPCR buffer,2y L 濃度為 2· 5 m mol/L 的 dNTP，I μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 RV-M，RV-M序列為 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG_3’，I μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 M13_47，M13_47 序列為 5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，0· 3μ L 酶活為 5 U/uL 的 Taq DNA Polymerase, 17. 2 μ L ddH20。菌落PCR擴增程序95 °C預變性7 min ;95°C變性30s，52 °C退火45s，72°C延伸lmin, 35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。2.7.1目的基因片段的測序
用接種環(huán)挑起一環(huán)經(jīng)過驗證得到的陽性克隆菌體接種到含有ImL液體LB培養(yǎng)基的離心管中振蕩培養(yǎng)4 6小時后送DNA測序公司進行測序。用DNAMAN V6軟件對測序結果進行拼接,并截去兩端pMD 18_T上的序列，余下的序列即為Js-It的鑒別序列。2. 7. 2測序結果如下 CCCACGATGATCAGGATGCTGGTGCCACCGATCGAGTTGCCCGCACCGCCATAGCTCGCCAACGCCACCGTCGGCGCGAGAGCGATCAGCCCCAGGTACAGCGAACCCGGCCACGTGATCCGGTTGAGCACGTAGCTCAGGTACTCAGC
GGTCGGACGACCGGCGCGAATACCTGGGATGAAGCCACCATACTTCTTCATATTGTCGGCCACTTCCTCGGGGTTGA
ACGAGATCGCCACGTAGAAGAAGGCGAAGAACACGATCAACAGGAAGTAGGCCGTCACGTAGTACGGGTGGTCACCC
TTGACGAAGTTGTCCTGGATCCAGGTCTTCCAACCCGAGGTGGAGCTGGAGAACTGCGCGATCAGCGCGGGGATGTA
CAGCAGCGAAGAGGCGAAGATGACCGGGATCACACCGGCCTGGTTCACCTTGAGGGGGATGTACGTCGAGGTCCCGC
CGTAGGAGCGACGGCCGATCATCCGCTTCGCGTACCGCACGGGTGACGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGA
GCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
實施例2、Js-It (CCTCC NO M2011365)抑制細菌和真菌試驗，包括以下步驟
I、供試菌株
供試菌株Js-It菌株分離自銀耳菌袋，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號CCTCC NO :M2011365)。指不細菌大腸桿菌co7i)、枯草芽抱桿菌Cfeci77w5·subtilis、。指不真菌有害撫抱霉菌(MycogonePerniciosa ifeg/ )、稻痕菌(Pyricularia《risea)、哈茨木霉{Trichoderma harzianum) {Rhizopus spp. )iFusariumspp.)、菌核盤菌{Sclerotinia sclerotiorum)、香蕉枯萎病菌天藍一號
vasicuIar wilt)。2、培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂條20g，蒸餾水lOOOmL。液體LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl IOg,蒸餾水lOOOmL，pH 7 ；
3、主要儀器 pH 計UB-7 型；
隔水式恒溫培養(yǎng)箱Gsp-9160MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；
生化培養(yǎng)箱Spx-250B-Z，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；
潔凈工作臺VS-1300L-u，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；
4、試驗方法
4.1 Js-It菌株培養(yǎng)
將Js-It菌接種于直徑為9cm裝有PDA培養(yǎng)基的平皿，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-14天，備用。4.2 Js-It菌株對細菌的抑制作用
I、用接種環(huán)分別取一環(huán)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌接種到不同的裝有IOmL液體LB培養(yǎng)基的試管內，在160r/min，37 °C的恒溫搖床中培養(yǎng)24h，備用。2、融化90mL固體PDA培養(yǎng)基，待冷卻至40°C時，快速加入5mL “I”中培養(yǎng)好的菌液，混合均勻后倒平板。待培養(yǎng)基凝固后在平板中心位置接種直徑為Icm的Js-It菌株的菌塊，每種細菌設置3個重復，37°C培養(yǎng)48h后測量透明圈即抑菌圈的大小。4.3 Js-It菌株對真菌的抑制作用
1、把指示真菌的菌株接種于9cm裝有PDA培養(yǎng)基的平皿，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-10 天，
2、用直徑為Icm的打孔器在“I”的平板上打取菌塊。3、在直徑為9 cm裝有PDA培養(yǎng)基的平皿中央畫“十”字形，重復3皿，4、用直徑為Icm的打孔器在步驟4.I培養(yǎng)好的Js-It菌株平皿打取菌塊，取菌塊接種到“3”中平皿“十”交叉的位置，
5、同時把“2”中打取的菌塊接種到“3”中“十”字線兩端距離中心3cm處，置于25°C下
培養(yǎng)，
6、把“2 ”中的菌塊接種到裝有PDA培養(yǎng)基的平皿中央，置于25 °C下培養(yǎng)，作為對照組，重復3皿，
7、待對照組“6”中的指示真菌接近長滿培養(yǎng)皿時開始測量菌落直徑，記為D1，同時測量“3”中指示真菌的菌落直徑，記為D2，
8、抑菌圈大小為Dl減去D2。5、試驗結果
5.I Js-It菌株對細菌的抑制作用
將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別混入PDA培養(yǎng)基中倒平板，培養(yǎng)結束時菌落會布滿整個平板而使平板呈不透明狀態(tài)。接有Js-It菌塊的平板，在Js-It菌塊周圍兩種細菌均不能夠生長，出現(xiàn)不同大小的透明圈。說明Js-It菌株對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌都具有抑制作用，對大腸桿菌的抑菌圈為2. 76cm，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈為I. 26cm。菌株對真菌的抑制作用
Js-It菌株對真菌的抑制作用如表I所示，Js-It菌株對核盤菌、有害疣孢霉菌的抑制作用最顯著，對峙培養(yǎng)時兩類病原真菌基本不能生長；對木霉、根霉、香灰菌、稻瘟菌也具有較明顯的抑制作用，產(chǎn)生的抑菌圈直徑均不小于2. 90cm，Js-It對鐮刀菌和香蕉枯萎病菌也具有抑制作用，使兩種致病菌的菌落形態(tài)發(fā)生變異，致使鐮刀菌產(chǎn)生的紅色素減少、香蕉枯萎病菌菌絲變稀薄，但是抑菌圈不夠顯著。
權利要求
1.一種鏈霉菌新菌株，其特征在于該菌株為鏈霉菌(Streptomyces fujianensis sp),CCTCC NO :M2011365，簡稱 Js-1T。
2.一種如權利要求I所述的Js-It (CCTCC NO M2011365)的DNA鑒定方法，包括菌株活化、菌絲培養(yǎng)與收集、CTAB法提取基因組DNA、NRPS合成酶基因的擴增、目的基因片段的克隆和目的基因片段的測序；其特征在于測序的結果如下CCCACGATGATCAGGATGCTGGTGCCACCGATCGAGTTGCCCGCACCGCCATAGCTCGCCAACGCCACCGTCGGCGCGAGAGCGATCAGCCCCAGGTACAGCGAACCCGGCCACGTGATCCGGTTGAGCACGTAGCTCAGGTACTCAGCGGTCGGACGACCGGCGCGAATACCTGGGATGAAGCCACCATACTTCTTCATATTGTCGGCCACTTCCTCGGGGTTGAACGAGATCGCCACGTAGAAGAAGGCGAAGAACACGATCAACAGGAAGTAGGCCGTCACGTAGTACGGGTGGTCACCC TTGACGAAGTTGTCCTGGATCCAGGTCTTCCAACCCGAGGTGGAGCTGGAGAACTGCGCGATCAGCGCGGGGATGTACAGCAGCGAAGAGGCGAAGATGACCGGGATCACACCGGCCTGGTTCACCTTGAGGGGGATGTACGTCGAGGTCCCGCCGTAGGAGCGACGGCCGATCATCCGCTTCGCGTACCGCACGGGTGACGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGA GCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鏈霉菌新菌株(Streptomyces fujianensis sp簡稱Js-1T)及其DNA鑒定方法，Js-1T對真菌、細菌的生長有很強的抑制作用，經(jīng)測定，Js-1T對大腸桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、稻瘟病、核盤菌、木霉、根霉、疣孢霉等的抗性很強，具有很好的開發(fā)應用前景。Js-1T的DNA鑒定方法具有真實可靠，一目了然的特點，操作簡單，檢測時間短，比經(jīng)典的形態(tài)鑒定誤差小，判斷更直觀。
文檔編號C12Q1/04GK102703362SQ20121020738
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權日2012年6月21日
發(fā)明者劉新銳, 李兵兵, 溫志強, 謝寶貴, 鄧優(yōu)錦 申請人:福建農(nóng)林大學