專利名稱：利用咀嚼肌和眼輪匝肌干細(xì)胞體外分化治療心臟病的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明屬于成體干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涉及成體干細(xì)胞提取、體外擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化及干細(xì)胞移植技術(shù)。
背景技術(shù)：
在發(fā)達(dá)國家和中國等多數(shù)國家，心血管疾病已經(jīng)成為致死的主要原因。應(yīng)用干細(xì)胞治療心肌梗塞及缺血性心臟病是當(dāng)前心血管疾病治療的新領(lǐng)域，最終會成為主流技術(shù)?，F(xiàn)如今臨床試驗使用的干細(xì)胞種類包括骨髓干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞、外周及臍帶血干細(xì)胞和臍帶間質(zhì)干細(xì)胞等。到目前為止，已完成臨床三期試驗的有骨髓干細(xì)胞和骨骼肌干細(xì)胞。雖然骨骼肌干細(xì)胞具有取材方便、可進(jìn)行大量的體外擴(kuò)增等優(yōu)點，但不具有在體 內(nèi)分化心肌細(xì)胞的能力和較差的電偶聯(lián)作用，在臨床應(yīng)用受到極大限制。頭面部肌肉咀嚼肌胚胎發(fā)育起源不同于軀干和四肢骨骼肌(軀干和四肢骨骼肌祖細(xì)胞來源于中胚層體節(jié)而咀嚼肌祖細(xì)胞起源于臟壁中胚層)。咀嚼肌祖細(xì)胞起源于臟壁中胚層鰓節(jié)肌與心臟祖細(xì)胞為同一起源。通過基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在咀嚼肌干細(xì)胞心肌基因Nkx2. 5和Isll有不同程度的表達(dá)，在基因水平上這也證實，咀嚼肌干細(xì)胞具有心肌干細(xì)胞的特性。最近研究發(fā)現(xiàn)非編碼小RNA (miRNA)對骨骼肌發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用。從咀嚼肌及眼輪匝肌干細(xì)胞返祖并獲得適當(dāng)?shù)母尚?先祖心肌細(xì)胞)是一個全新的研究思路。而且咀嚼肌及眼輪匝肌干細(xì)胞在胚胎期與心肌細(xì)胞發(fā)育同源具有無可比擬的優(yōu)勢。咀嚼肌及眼輪匝肌的胞漿成分及表面標(biāo)記物更接近心肌細(xì)胞，無免疫原性(若取材于同一病人)，并且無成瘤性。由于咀嚼肌及眼輪匝肌的獨特成體干細(xì)胞特性，從咀嚼肌及眼輪匝肌分化到心肌細(xì)胞只需改變表觀遺傳學(xué)的特征既可。表觀遺傳學(xué)改變是基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，基因表達(dá)活性調(diào)控主要是通過染色質(zhì)水平的化學(xué)修飾，形成有轉(zhuǎn)錄活性的常染色質(zhì)和無轉(zhuǎn)錄活性的異染色質(zhì)區(qū)域。表觀遺傳學(xué)信息本身不改變基因的序列，而是通過基因修飾，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，DNA和其他成份的相互作用，影響和調(diào)節(jié)基因的功能和特性。涉及到DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等。DNA甲基化是最重要的表觀遺傳修飾形式，是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因釉組CPG 二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)，引起染色質(zhì)構(gòu)、DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)，一般是起抑制效應(yīng)。將已知的四個基因如0CT4、Sox2、KIf4、c-Myc轉(zhuǎn)入，使體細(xì)胞變成iPSC，但內(nèi)源性基因的四個因素被激活，一個重要的要求是DNA去甲基化。DNA甲基化主要是通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)家族催化完成。DNMT抑制0CT4的表達(dá)，而DNMT又受到一組micronRNA簇的調(diào)控。因此，為采用蛋白誘導(dǎo)技術(shù)將咀嚼肌及眼輪匝肌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞提供了轄理論依據(jù)。此外，BMP4在誘導(dǎo)咀嚼肌及眼輪匝肌干細(xì)胞分化及發(fā)育為心肌細(xì)胞上也起到了關(guān)鍵作用。BMP4信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控心肌相關(guān)基因(如MEF2a、GATA等)乙酰化激活細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，可進(jìn)一步調(diào)控心肌細(xì)胞分化。另外，穿膜肽作為一個新技術(shù)可運載一系列包括多肽，蛋白、核酸和寡聚核苷酸等生物活性物質(zhì)進(jìn)入活細(xì)胞。本發(fā)明應(yīng)用咀嚼肌干細(xì)胞具有心肌干細(xì)胞的特性，采用非編碼小RNA體外改變咀嚼肌干細(xì)胞分化，促進(jìn)分化心肌細(xì)胞，克服骨骼肌干細(xì)胞治療心臟疾病的缺點，用于治療心肌梗塞及缺血性心臟病。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)方法體外擴(kuò)增咀嚼肌干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞用于治療心臟疾病，其步驟如下
I無創(chuàng)活檢方法收集咀嚼肌樣品。2利用膠原酶消化處理咀嚼肌樣品。 3懸浮培養(yǎng)酶消化處理后的咀嚼肌組織，單一咀嚼肌干細(xì)胞增殖逐漸形成球狀細(xì)胞體。4擴(kuò)增咀嚼肌干細(xì)胞通過處理球狀細(xì)胞體使之分成單一細(xì)胞，重復(fù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。5誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)液加入非編碼小RNA及BMP4。6通過流體細(xì)胞儀純化心肌細(xì)胞。7通過冠狀動脈導(dǎo)管注射及細(xì)胞膜片技術(shù)進(jìn)行心肌細(xì)胞移植治療心肌梗塞及缺血性心臟疾病。8采用NG-reagent技術(shù)介導(dǎo)Nanog、0ct4及Sox2蛋白進(jìn)入咀嚼肌及眼輪阻肌祖細(xì)胞使其反祖為iPSC，將現(xiàn)有的iPSC轉(zhuǎn)變成心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)換率大幅度提高。9采用NG-reagent技術(shù)介導(dǎo)GATA4、MEF2c及Tbx5蛋白進(jìn)入咀嚼肌及眼輪匝肌祖細(xì)胞，直接誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。10在心肌細(xì)胞特異性啟動子(NCXl)引導(dǎo)下，結(jié)合慢病毒載體，熒光素酶，嘌啉霉素基因用于跟蹤、純化來自咀嚼肌及眼輪匝肌祖細(xì)胞的心肌細(xì)胞。
具體實施方案材料和方法
咀嚼肌樣品處理和咀嚼肌干細(xì)胞生長培養(yǎng)
首先消毒，在無菌條件經(jīng)皮下活檢獲得咀嚼肌組織。將組織放入PBS溶液置于冰上(在這種條件下可保存到12小時)。使用消毒鑷子和剪刀就咀嚼肌組織剪切成(T5 mm3碎片，用II型膠原酶(lmg/ml) 3(T40°C消化25 40分鐘。消化后咀嚼肌組織離心，使用移液管將組織細(xì)胞團(tuán)塊輕輕散開，放入培養(yǎng)液(containing 15% heat-inactivated fetalcalf serum, 100 Units/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin, 2 mmol/IL-glutamine, and 0. I mmol / I 2-mercaptoethanol in DMEM)。在 30 4CTC 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)懸浮培養(yǎng)。咀嚼肌干細(xì)胞擴(kuò)增和液氮凍存
經(jīng)過懸浮培養(yǎng)一天后，可發(fā)現(xiàn)單一咀嚼肌干細(xì)胞或數(shù)位細(xì)胞體形成。三到四天后可見球狀細(xì)胞體。六天后收集球狀細(xì)胞體，II型膠原酶(I mg/ml) 3(T40°C消化5 25分鐘，使球狀細(xì)胞體分散成單一細(xì)胞或小細(xì)胞塊，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。以上過程可重復(fù)多次直到獲得足夠數(shù)量咀嚼肌干細(xì)胞。在此過程中取部分細(xì)胞液氮凍存?zhèn)溆?。誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞
球狀細(xì)胞體經(jīng)II型膠原酶(I mg/ml) 3(T40°C°C消化5 20分鐘分散成單一細(xì)胞或小細(xì)胞塊，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，應(yīng)用BMP刺激及用病毒方式轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞關(guān)聯(lián)因子或敲除非心肌細(xì)胞關(guān)聯(lián)因子促使咀嚼肌干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞。采用NG-reagent負(fù)載蛋白
I含跨膜肽的膜狀結(jié)構(gòu)組裝?？缒る娜苡谒蚰M生理介質(zhì)中，將改構(gòu)葡聚糖熔于DMS0，然后滴加到跨膜肽溶液中分散，自組裝得到穩(wěn)定的跨膜肽/葡聚糖片狀懸液。采用原子力顯微鏡(AFM)，ZETA電位儀表征懸液的分散穩(wěn)定性、采用解組裝/高效液相檢測跨膜肽的組裝量。
2含蛋白納米微囊的組裝。將待轉(zhuǎn)染蛋白溶于PBS中，NaCl調(diào)節(jié)鹽濃度，與上述懸液混合，組裝成5(Tl00nm微囊。透析膜分離未組裝的蛋白以及其它非鹽分子。采用上述檢測方法測試蛋白納米微囊的大小，包裝差異和穩(wěn)定性等。3納米微囊的轉(zhuǎn)染效率納米微囊同時負(fù)載熒光標(biāo)記蛋白(GFP)，將純化負(fù)載蛋白納米微囊過0.22 pm濾膜除菌。與咀嚼肌及眼輪匝肌干細(xì)胞共培養(yǎng)，48小時內(nèi)檢測細(xì)胞GFP的特異性表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染效率。通過慢病毒載體技術(shù)純化心肌細(xì)胞
在心肌細(xì)胞特異性啟動子(NCX1)引導(dǎo)下，用慢病毒載體，結(jié)合熒光素酶，嘌啉霉素基因用于跟蹤、純化心肌細(xì)胞。NCXl promoter driving firefly luciferase (pLVX-NCXl-Fluc-PuroR-IRES-ZsGreenl)分化，生長的心肌細(xì)胞含有上述結(jié)構(gòu)特點后，體內(nèi)、外給予嘌啉霉素可殺死心肌細(xì)胞以外的各種細(xì)胞。通過生物體發(fā)光影相儀(Xenogen IVIS-200 System)可監(jiān)測細(xì)胞生長，繁殖及移行情況。通過流體細(xì)胞儀純化心肌細(xì)胞
用BMP刺激后，使咀嚼肌干細(xì)胞及先祖細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。來自咀嚼肌干細(xì)胞及先祖細(xì)胞將會用含有特異性心肌細(xì)胞起動子，綠色熒光蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)染。指定朝心肌細(xì)胞分化的先祖細(xì)胞含有綠色熒光，用流體細(xì)胞儀篩選出更純化的心肌細(xì)胞。心肌梗塞模型和細(xì)胞移植
在麻醉的前提下，將大鼠心臟左前降支冠狀動脈結(jié)扎。將含有來自咀嚼肌干細(xì)胞及先祖細(xì)胞分化心肌細(xì)胞用冠狀動脈導(dǎo)管注射或細(xì)胞膜片技術(shù)(將細(xì)胞膜片放到心肌梗塞組織的表面)進(jìn)行心肌細(xì)胞移植，關(guān)閉胸腔。一月后觀察新分化心肌細(xì)胞的生長及心臟功能改變狀況。免疫組織學(xué)
分離的心肌組織用10% (v/v)甲醛水溶液固定，石蠟包埋，切成5 厚標(biāo)本。用免疫組化的方法進(jìn)行各種染色，確定分化，新生的心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管形成。
權(quán)利要求
1.運用了咀嚼肌干、眼輪匝肌干細(xì)胞具有心肌干細(xì)胞的特性，采用非編碼小RNA體外改變并促進(jìn)咀嚼肌、眼輪匝肌干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，可用于治療心肌梗塞及缺血性心臟病。
2.權(quán)利要求I的方法，其中包括無創(chuàng)活檢方法收集咀嚼肌或眼輪匝肌樣品。
3.權(quán)利要求I的方法，其中包括利用膠原酶消化處理咀嚼肌樣品。
4.權(quán)利要求I的方法，其中包括懸浮培養(yǎng)酶消化處理后的咀嚼肌組織，單一咀嚼肌干細(xì)胞增殖逐漸形成球狀細(xì)胞體。
5.權(quán)利要求I的方法，其中包括擴(kuò)增咀嚼肌干細(xì)胞通過處理球狀細(xì)胞體使之分成單一細(xì)胞，重復(fù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求I的方法，其中包括誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)液加入非編碼小RNA。
7.權(quán)利要求I的方法,其中包括通過流體細(xì)胞儀純化心肌細(xì)胞。
8.權(quán)利要求I的方法，其中包括通過冠狀動脈導(dǎo)管注射和細(xì)胞膜片技術(shù)進(jìn)行心肌細(xì)胞移植治療心肌梗塞及缺血性心臟疾病。
9.權(quán)利要求I的方法，其中包括采用NG-reagent技術(shù)介導(dǎo)Nanog、0ct4及Sox2蛋白進(jìn)入咀嚼肌及眼輪匝肌祖細(xì)胞使其返祖為iPSC，將現(xiàn)有的iPSC轉(zhuǎn)變成心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)換率大幅度提高或采用NG-reagent技術(shù)介導(dǎo)GATA4、MEF2c及Tbx5蛋白進(jìn)入咀嚼肌及眼輪匝肌祖細(xì)胞，直接誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。
10.權(quán)利要求I的方法，其中包括在心肌細(xì)胞特異性啟動子(NCX1，acardiacsodium-calcium exchanger)引導(dǎo)下，結(jié)合慢病毒載體,綠色突光蛋白，嘌啉霉素基因用于跟蹤、純化來自咀嚼肌及眼輪匝肌祖細(xì)胞的心肌細(xì)胞。
全文摘要
該發(fā)明屬于成體干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涉及成體干細(xì)胞提取、體外擴(kuò)增、分化誘導(dǎo)及干細(xì)胞移植技術(shù)。依據(jù)頭面部肌肉咀嚼肌與心臟祖細(xì)胞同一起源的理論基礎(chǔ)?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在咀嚼肌干細(xì)胞中的心肌基因Nkx2.5和Isl1有不同程度的表達(dá)。本發(fā)明應(yīng)用了咀嚼肌干細(xì)胞具有心肌干細(xì)胞的這一特性，采用無創(chuàng)活檢方法收集咀嚼肌樣品，經(jīng)懸浮培養(yǎng)方法體外擴(kuò)增咀嚼肌干細(xì)胞；采用非編碼小RNA體外改變和促進(jìn)咀嚼肌干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞并純化。將已純化的心肌細(xì)胞經(jīng)冠狀動脈導(dǎo)管注射或細(xì)胞膜片技術(shù)(將細(xì)胞膜片放到心肌梗塞組織的表面)進(jìn)行心肌細(xì)胞移植至心肌梗塞部位，可用于治療心肌梗塞及缺血性心臟病。
文檔編號C12N5/071GK102703382SQ20121020821
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者滕國奇, 王義剛, 趙柏松 申請人:吉林省霍普金斯藥物研究院有限責(zé)任公司