專利名稱：一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細菌纖維素的制備領域，特別涉及一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法。
背景技術：
細菌纖維素(Bacterial Cellulose,簡稱BC)是一種新型納米微生物材料,具有較好的生物相容性、生物可降解性、較強的持水能力和較高的力學性能等特性。鑒于其優(yōu)良特性，細菌纖維素被廣泛應用于各種特殊領域。在醫(yī)用材料領域，細菌纖維素可以用于合成人造皮膚、人造血管、外科敷料、緩釋藥物的載體等；在食品工業(yè)領域，細菌纖維素本身就可以作為一種食品食用，另外，BC還可以作為食品工業(yè)中的增稠劑、成型劑、添加劑等；在造紙工業(yè)方面，細菌纖維素的添加可以 提高紙張抗張強度和耐破度，降低透氣度，提高撕裂度等；在音響領域可以用作生產超性能的聲音振動膜；在材料領域，BC納米纖維與其他高分子、有機或無機分子的復合摻雜，可獲得各種新的功能復合材料，譬如燃料電池質子交換膜。目前大規(guī)模利用細菌纖維素的主要障礙是其產量低、成本高、價格不敵普通纖維素，因此研究的重點集中在找尋新碳源上，尋找廉價合適的原料，既降低生產成本又能提高
纖維素的產量。木薯，英文名=Cassava,又稱木番薯或樹薯，屬大戟科，原產于美洲。木薯適應性強，病蟲害少，耐瘠耐旱，產量高，其用途相當廣泛。木薯在19世紀20年代由印度尼西亞引進我國，現如今廣泛分布于華南地區(qū)，其中，以廣西種植面積為最大，2010年廣西木薯種植面積達344. 39萬畝。木薯塊根淀粉含量豐富為薯類之首，含量為25% 35%，素有“淀粉之王”、“地下糧倉”及“特用作物”之稱。木薯的主要用途是食用、飼用和工業(yè)上開發(fā)利用。作為工業(yè)原料，木薯能加工為淀粉，變性淀粉，有機酸，酒精等2000多個品種，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)?？萍及l(fā)展，能源的需求不斷增長，木薯已成為我國生物燃料產業(yè)發(fā)展的重要資源。與其他作物相比，木薯投入少，易栽培，全身可用，因而，木薯得到越來越多國家的重視，并積極開展研究，大力發(fā)展。除了木薯，我國還有大量的番薯、甘薯、地瓜和馬鈴薯，有時由于運輸等問題，造成這些薯類農產品大量爛在地里和倉庫，浪費嚴重。因此如有一種技術能充分利用這些現有農產品資源，提升其附加值，同時降低細菌纖維素生產成本，將對我國農業(yè)產品升級，推廣納米纖維素的應用具有很大幫助。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，該方法具有原料來源廣泛，工藝簡單、能耗低、反應迅速等優(yōu)點；且使用薯類原料水解液生產的細菌纖維素產量高于其他碳源生產的細菌纖維素，在細菌纖維素的生產領域具有良好的應用前景。本發(fā)明的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，包括
(I)薯類原料的預處理將薯類原料用汽蒸熟化軟化后搗爛，或將薯類原料勻漿細碎化，得到預處理后的薯類原料；(2)在上述預處理后的薯類原料中加入酸，進行酸水解；或加入酶，進行酶水解，得到薯類原料水解液；所述的酸水解的具體工藝為酸的濃度為0. 005-0. 03g/mL,于溫度60-150° C下水解0. l-5h ;所述的酶水解的具體工藝包括a.薯類原料的液化在上述預處理后的薯類原料中，按照酶/薯類原料干物質=l-4w/w%加入酶，再用酸或堿調節(jié)PH值為4. 0-7. 0，以50-120r/min的速度振蕩反應30_120min，得到液化后的薯類原料；b.薯類原料的糖化在上述液化后的薯類原料，加入糖化酶66_270U/g薯類原料干物質，用酸調節(jié)pH 值為4. 0-5. 5，在溫度40-70°C的條件下反應0. 5_48h，然后離心得到上清液，即薯類原料水解液；(3)將上述薯類原料水解液作為培養(yǎng)基碳源，加氮源配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接入細菌纖維素生產菌株的種子液，經過3 23天發(fā)酵制得細菌纖維素。所述步驟(I)中的薯類原料為木薯、番薯、甘薯、地瓜或馬鈴薯中的一種或幾種。所述步驟(I)中的用汽蒸熟化軟化的具體工藝為將薯類原料整體或切碎后，于溫度50-110° C下水煮或者汽蒸30-60min熟化軟化，水煮時薯類原料干物質與水的質量比例為1:1-1:3 ;勻漿細碎化的具體工藝為將清洗干凈的薯類原料直接加水勻漿，薯類原料干物質與水的質量體積比為lg: I. 5mL。所述步驟(2)中的酸水解中酸為硫酸、鹽酸、磷酸、醋酸或檸檬酸。所述步驟(2)中的酶水解中酶為淀粉酶、糊精酶、纖維素酶、糖化酶、葡聚糖酶、果膠酶中的一種或幾種。所述步驟(2) a中的酶/薯類原料干物質=3w/w%，pH值為6.0，反應的溫度為87. 5 °C，反應時間為53min。所述步驟(2)a中的酶為淀粉酶，當反應的溫度為80-97° C時，采用高溫淀粉酶；當反應的溫度為30-60° C時，采用普通淀粉酶。所述步驟(2) b中糖化酶的加入量為133U/g，pH值為4.5，反應的溫度為62.2°〇，反應時間為86min。所述步驟(2) b中上述的離心的速度為6000rpm/min,離心時間為20min。所述步驟(2 ) a中的堿為Ca (OH)2, NaOH或NH4OH,所述步驟(2 ) a和b中的酸為硫
酸、磷酸、鹽酸或硝酸。所述步驟(3)中的薯類原料水解液可以首先補加0. l_lwt%的酵母浸膏和0. 1-0. 5wt%胰蛋白胨，調節(jié)pH至5. 0,接入面包酵母/釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)室溫下或者30° C條件下自然發(fā)酵1_3天，再補加氮源配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接入細菌纖維素生產菌株的種子液，經過3 23天發(fā)酵制得細菌纖維素。所述步驟(3)中的氮源為0. riwt%的酵母浸膏和0. ro. 5wt%的胰蛋白胨；或者為0. l-2wt%的硫酸銨、玉米漿或麥芽汁。所述步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調節(jié)為4. (T6. 0，所述的發(fā)酵為在2(T30°C溫度下靜止培養(yǎng)或者在5(T500rpm轉速下動態(tài)培養(yǎng)。所述步驟(3)中的細菌纖維素生產菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌屬(Achromobacter sp.)、產喊菌屬(Alcaligenessp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp.)、固氣菌屬(Azotobacter sp. )、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)、木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)或紅茶菌(kombucha),優(yōu)選木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)或紅茶菌(kombucha)。所述細菌纖維素生產菌株中除紅茶菌以外的菌種按2 3接種環(huán)的接種量接入液 體種子培養(yǎng)基(5 — 50g/L的甘露醇/或葡萄糖，I — 10g/L酵母浸膏、I — 5g/L蛋白胨,培養(yǎng)基PH值為5. 0)制備種子液，然后按體積百分比3-15%的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基；細菌纖維素生產菌株為紅茶菌時按接入廣3片直徑Icm圓片菌膜的接種量接入液體種子培養(yǎng)基，然后按廣3片直徑Icm圓片菌膜的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明利用木薯、番薯、甘薯、地瓜、馬鈴薯等這些在我國資源豐富，種植廣泛，存儲方便且價格低廉的薯類原料進行。實驗數據表明，在同等條件下，使用薯類原料水解液生產的細菌纖維素產量高于其他碳源，如蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇等碳源生產的細菌纖維素。因此證實本發(fā)明所生產的廉價碳源是一種培養(yǎng)細菌纖維素的優(yōu)質碳源。有益效果( I)本發(fā)明以薯類為原料，具有來源廣泛，工藝簡單、水解液糖含量高；薯類原料預處理水解工藝具有簡單、能耗低、反應迅速等優(yōu)點。(2)本發(fā)明經處理的薯類原料水解液生產的細菌纖維素產量高于其他碳源生產的細菌纖維素，在細菌纖維素的生產領域具有良好的應用前景。


圖I為不同單因素對高溫a淀粉酶液化木薯的影響；圖2為不同單因素對糖化酶酶解木薯效果的影響；圖3為新鮮木薯、甘薯以及馬鈴薯水解液和其它常規(guī)碳源生產的細菌纖維素的結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I聞溫a淀粉酶液化最適條件的確定I.木薯勻漿液制備新鮮木薯先用水清洗干凈，用打汁機在22000rpm/min下勻漿5分鐘，木薯與水的比例(g/ml)是1:1. 5，然后在5000rpm/min下離心10分鐘，固液分離，將上清液和固行物存于4°C冰箱備用。2.單因素實驗選擇反應溫度、反應時間、酶量、pH這4個影響液化效果的因素進行單因素實驗，通過比較還原糖濃度來確定各個最優(yōu)單因素條件。( I)液化最適反應pH在加酶量為3% (m/m)，反應時間為90min，溫度為87°C，實驗對象為固液比是1:8(g/mL)的木薯勻楽;液的條件下,不同的pH值對還原糖濃度的影響見圖I (a),實驗表明淀粉水解產生還原糖的量的最適pH為6. O。(2)液化最適反應時溫度 在pH=6. 0,反應溫度在90min,酶量在3% (m/m),實驗對象為固液比是1:8 (g/mL)的木薯勻漿液的條件下，反應溫度對還原糖濃度的影響見圖I (b)，實驗表明最適合的反應溫度是87°C。(3)液化最適反應時間在pH=6. 0，酶量在3%(m/m)，反應溫度為87°C的條件下，實驗對象為固液比是1:8(g/mL)的木薯勻漿液的條件下，反應時間對還原糖濃度的影響見圖I (C)，液化最合適反應時間是60min。( 4 )液化最適酶用量在pH=6. 0，反應溫度為87°C，反應時間為90min，實驗對象為固液比是1:8 (g/mL)的木薯勻漿液的條件下，反應酶量對還原糖濃度的影響見圖I (d)時，綜合考慮水解度和實際生產成本等因素，暫時確定酶添加量為2%。通過單因素實驗，我們得到液化的最佳反應條件為溫度87°C，反應時間60min，酶量為3% (m/m), pH值為6. 0，實驗原料木薯勻漿液。3.多因素實驗在單因素實驗的基礎上，考慮實際的操作，我們調節(jié)木薯勻漿液的pH為6. 0，選擇反應溫度、時間、酶量進行響應面優(yōu)化，利用Design Experts8. 0軟件進行Box-Behnken設計。Box-Behnken是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數學統(tǒng)計方法。取反應溫度、反應時間、酶量3個因素，每個因素取三個水平，根據設計進行實驗后，對數據進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平均項、交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定水平范圍內求最佳值。實驗設計如下表I :淀粉酶響應面設計
水平編碼值
因素編碼 _
-I0I
li'liiijA30.0060.0090.00
溫度B82.0087.0092.00
權利要求
1.一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，包括 (1)將薯類原料用汽蒸熟化軟化后搗爛，或將薯類原料勻漿細碎化，得到預處理后的薯類原料； (2)在上述預處理后的薯類原料中加入酸，進行酸水解；或加入酶，進行酶水解，得到薯類原料水解液；所述的酸水解的具體工藝為酸的濃度為O. 005-0. 03g/mL,于溫度60-150° C下水解O. l-5h ;所述的酶水解的具體工藝包括 a.在上述預處理后的薯類原料中，按照酶/薯類原料干物質=l-4w/w%加入酶，再用酸或堿調節(jié)pH值為4. 0-7. 0，以50-120r/min的速度振蕩反應30_120min，得到液化后的薯類原料； b.在上述液化后的薯類原料，加入糖化酶66-270U/g薯類原料干物質，用酸調節(jié)pH值為4. 0-5. 5，在溫度40-70°C的條件下反應O. 5_48h，然后離心得上清液，即薯類原料水解液； (3)將上述薯類原料水解液作為培養(yǎng)基碳源，加氮源配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接入細菌纖維素生產菌株的種子液，經過3 23天發(fā)酵制得細菌纖維素。
2.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(I)中的薯類原料為木薯、番薯、甘薯、地瓜或馬鈴薯中的一種或幾種。
3.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(I)中的用汽蒸熟化軟化的具體工藝為將薯類原料整體或切碎后，于溫度50-110° C下水煮或者汽蒸30-60min熟化軟化，水煮時薯類原料干物質與水的質量比例為1:1-1:3 ;勻漿細碎化的具體工藝為將清洗干凈的薯類原料直接加水勻漿，薯類原料干物質與水的質量體積比為lg: I. 5mL。
4.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(2)中的酸水解中酸為硫酸、鹽酸、磷酸、醋酸或檸檬酸；酶水解中酶為淀粉酶、糊精酶、纖維素酶、糖化酶、葡聚糖酶、果膠酶中的一種或幾種。
5.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(2) a中的酶/薯類原料干物質=3w/w%，pH值為6. O,反應的溫度為87. 5°C，反應時間 為53min。
6.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(2)a中的酶為淀粉酶，當反應的溫度為80-97° C時，采用高溫淀粉酶；當反應的溫度為30-60° C時，采用普通淀粉酶。
7.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于 所述步驟(2) b中糖化酶的加入量為133U/g，pH值為4. 5，反應的溫度為62. 2V，反應時間為86min。
8.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(2 ) a中的堿為Ca (OH) 2、NaOH或NH4OH,所述步驟(2 ) a和b中的酸為硫酸、磷酸、鹽酸或硝酸。
9.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(3)中的薯類原料水解液首先補加O. l_lwt%的酵母浸膏和O. 1-0. 5被％胰蛋白胨，調節(jié)pH至5. O,接入面包酵母/釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)室溫下或者30° C條件下自然發(fā)酵1-3天，再補加氮源配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接入細菌纖維素生產菌株的種子液，經過3 23天發(fā)酵制得細菌纖維素。
10.根據權利要求I或9所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(3)中的氮源為O. riwt%的酵母浸膏和O. Γ0. 5wt%的胰蛋白胨；或者為O.l-2wt%的硫酸銨、玉米漿或麥芽汁。
11.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調節(jié)為4. (Γ6.0，所述的發(fā)酵為在2(T30°C溫度下靜止培養(yǎng)或者在5(T500rpm轉速下動態(tài)培養(yǎng)。
12.根據權利要求I所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述步驟(3)中的細菌纖維素生產菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌屬(Achromobacter sp.)、產喊菌屬(Alcaligenessp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp.)、固氣菌屬(Azotobacter sp.)、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)、木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)或紅茶菌(kombucha)。
13.根據權利要求12所述的一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，其特征在于所述細菌纖維素生產菌株中除紅茶菌以外的菌種按2 3接種環(huán)的接種量接入液體種子培養(yǎng)基制備種子液，然后按體積百分比3-15%的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基；細菌纖維素生產菌株為紅茶菌時按接入Γ3片直徑Icm圓片菌膜的接種量接入液體種子培養(yǎng)基，然后按f 3片直徑Icm圓片菌膜的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用薯類原料制備細菌纖維素的方法，包括(1)薯類原料的預處理將薯類原料用汽蒸熟化軟化后搗爛，或將薯類原料勻漿細碎化，得到預處理后的薯類原料；(2)在上述預處理后的薯類原料中加入酸，進行酸水解；或加入酶，進行酶水解，得到薯類原料水解液；(3)將上述薯類原料水解液作為培養(yǎng)基碳源，加氮源配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接入細菌纖維素生產菌株的種子液，經過3~23天發(fā)酵制得細菌纖維素。本發(fā)明的工藝簡單、能耗低、反應迅速，原料來源廣泛；且經處理的木薯、番薯以及馬鈴薯等薯類原料水解液生產的細菌纖維素產量高于其它常規(guī)碳源生產的細菌纖維素，在細菌纖維素的生產領域具有良好的應用前景。
文檔編號C12R1/645GK102703543SQ20121020936
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權日2012年6月25日
發(fā)明者楊雪霞, 洪楓, 陳軍 申請人:東華大學