專利名稱：一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的方法。
背景技術(shù)：
核酸、蛋白質(zhì)和多糖是最重要的三種生物大分子，核酸和蛋白質(zhì)在生命現(xiàn)象中的重要性已為世人所知，而多糖的研究比核酸和蛋白質(zhì)落后許多，真正對其研究僅是最近幾十年的事。近20年來，國內(nèi)外有關(guān)活性多糖的研究非常的活躍，目前主要從動物、植物組織以及藻類和微生物發(fā)酵液中提取多糖。本世紀(jì)生命科學(xué)的焦點(diǎn)是對細(xì)胞生物多糖高層次的生命現(xiàn)象解釋，所以糖類作為生物體內(nèi)細(xì)胞識別及調(diào)控信息分子，因此對其研究是非常重 要的。微生物胞外多糖是一種高粘度的大分子物質(zhì)，近年來已發(fā)展成為一類新型的發(fā)酵產(chǎn)品。除具有大多數(shù)植物多糖和合成的高分子聚合物所特有的性質(zhì)外，還具有低濃度下呈高黏度，假塑性，熱穩(wěn)定性，可與多種鹽類配伍及形成有用的膜等特性，同時具有生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)不受季節(jié)、地理條件、病害的限制等優(yōu)點(diǎn)。另外，微生物多糖的無毒、不污染環(huán)境等特點(diǎn)又使其在將來有可能取代高分子聚合物，消除高聚物受石油資源制約、毒性、污染等弊病。微生物多糖除具有藥用外還可作為增稠劑、懸浮劑和穩(wěn)定劑而廣泛地應(yīng)用于化工、石油開采、醫(yī)藥加工、食品和化妝品等領(lǐng)域。根據(jù)D. E. Eveleigh統(tǒng)計，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)49屬76中微生物產(chǎn)胞外多糖，但真正有應(yīng)用價值并已經(jīng)進(jìn)行或接近工業(yè)化生產(chǎn)的僅十幾種。近幾年，隨著對微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的產(chǎn)量和年增長量均在10%以上，而一些新型多糖年增長量在30%以上。目前為止，已大量投產(chǎn)的微生物胞外多糖主要有黃原膠、結(jié)冷膠、右旋糖苷、硬葡聚糖、異淀粉等。據(jù)估計，全世界微生物多糖年加工業(yè)產(chǎn)值可達(dá)50-100億美元。近幾十年來，由于微生物胞外多糖在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性能及生產(chǎn)方面所具有的優(yōu)勢特點(diǎn)而得到大力研究和開發(fā)，微生物胞外多糖的開發(fā)已成為工業(yè)微生物研究的熱點(diǎn)之
O本專利以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，對影響發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)基PH及發(fā)酵時間進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的方法，本專利以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，對影響發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)基PH及發(fā)酵時間進(jìn)行了研究。I. 一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的方法，其特征在于發(fā)酵時，在100mL三角瓶中裝入一定體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入一定量的枯草芽孢桿菌種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在不同的初始PH值條件下發(fā)酵培養(yǎng)以一定的轉(zhuǎn)速和溫度下發(fā)酵一定的時間。2.步驟I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖25，蛋白胨15，牛肉膏3. 0，檸檬酸三鈉1.0。pH值根據(jù)發(fā)酵條件選定。3.步驟I所述的種子培養(yǎng)液的制備方法為將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d，制成種子培養(yǎng)液。4.步驟3所述的固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，蛋白胨5，牛肉膏3，氯化鈉5，瓊脂15-20。5.步驟I所述的最佳發(fā)酵溫度為40°C。6.步驟I所述的最佳接種量為3%。7.步驟I所述的最佳轉(zhuǎn)速為160 rpm。
8.步驟I所述的最佳裝液量為30 mL。9.步驟I所述的最佳培養(yǎng)基pH值為6. O。10.步驟I所述的最佳發(fā)酵時間為35 h。


圖I培養(yǎng)溫度對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響。圖2不同接種量對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響。圖3不同轉(zhuǎn)速對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響。圖4不同裝液量對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響。圖5不同培養(yǎng)基初始pH對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響。圖6發(fā)酵時間對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響。
具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對本發(fā)明沒有限制。本專利所用的菌株為枯草芽孢桿菌，購買于ATCC，編號為ATCC02733。實施例I
本實施例說明不同培養(yǎng)溫度對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響，將種子培養(yǎng)液以1% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，初始PH值為6，于200 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量為50mL/500 mL三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)30 h，培養(yǎng)溫度分別為25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，結(jié)果如圖I所示。由圖I可以看出，不同的發(fā)酵溫度，菌株胞外多糖的產(chǎn)生情況明顯不同。從圖中可以看出在30°C以上菌株的胞外多糖產(chǎn)量較高，當(dāng)溫度達(dá)到40°C時，胞外多糖產(chǎn)量最高，而超過這個溫度胞外多糖產(chǎn)量卻逐漸下降。因此實驗選擇40°C為最佳生產(chǎn)胞外多糖的溫度。實施例2
本實施例說明不同接種量對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響，將種子培養(yǎng)液以2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH值為6，于37°C，200 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量為50 mL/500 mL三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)30 h，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，當(dāng)菌株接種量為3%時，胞外多糖產(chǎn)量最高，隨著接種量的增加，胞外多糖的產(chǎn)量并沒有增加，反而有所下降。這可能是由于菌株是好氧菌，當(dāng)接入量過高時，生長空間一定，密度增加，氧氣量供應(yīng)不足，影響其生長繼而影響產(chǎn)物的產(chǎn)出；還可能的原因是底物量一定，當(dāng)接入過多菌種后，底物量只能滿足其生長需求，其次級代謝產(chǎn)物還沒有來的及產(chǎn)生已消耗盡，所以造成產(chǎn)糖量的減少。實施例3
本實施例說明不同轉(zhuǎn)速對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響，將種子培養(yǎng)液以3% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，初始PH值為6，于37°C，轉(zhuǎn)速分別為120 r/min, 140 r/min, 160 r/min，180 r/min, 200 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量為50 mL/500 mL三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)30h，結(jié)果如圖3所不。由圖3可以看出，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量增大，但高于160 r/min后，轉(zhuǎn)速提高胞外多糖的產(chǎn)量卻下降?？梢娹D(zhuǎn)速過低，通氣效果不好，不利于菌體生長，提高搖床轉(zhuǎn)速，雖然有利于菌種生長，但營養(yǎng)成分消耗也較大，造成營養(yǎng)成分不足， 或者轉(zhuǎn)速過高對菌體產(chǎn)生機(jī)械損傷，引起菌體自溶，生物量減少。所以轉(zhuǎn)速過高，發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量會降低。從圖中可以看出選擇轉(zhuǎn)速為160 r/min時，菌株胞外多糖產(chǎn)量最聞。實施例4
本實施例說明不同裝液量對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響，將種子培養(yǎng)液以3% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，初始PH值為6，于37°C，160 r/min振蕩培養(yǎng)，不同培養(yǎng)基裝液量，發(fā)酵培養(yǎng)30 h，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，枯草芽孢桿菌是好氧性細(xì)菌，搖瓶中的氧氣量將直接影響細(xì)菌的生長和活性物質(zhì)的產(chǎn)生。試驗結(jié)果顯示，500 mL三角瓶中裝入30 mL的培養(yǎng)液最適于菌株胞外多糖的產(chǎn)生，隨著裝液量增大，瓶中空氣量減少，菌體生長受到影響，因此其次級代謝產(chǎn)物胞外多糖產(chǎn)量減少。實施例5
本實施例說明不同初始PH培養(yǎng)基對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響，將種子培養(yǎng)液以3%(V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH值分別為5-10，于37°C，160 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量為30 mL/500 mL三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)30 h，結(jié)果如圖5所示。pH主要通過影響菌體細(xì)胞膜電荷、膜滲透性以及營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收。由于搖瓶發(fā)酵過程中的PH難以控制，只能控制發(fā)酵液的初始pH。由圖5可以看出，pH對菌株胞外多糖的合成有較大的影響。較低或較高pH的情況下均不利于胞外多糖的產(chǎn)生。當(dāng)PH低于6. O以下，因為酸的抑制作用，菌體不宜生長或生長緩慢，更是影響胞外多糖的產(chǎn)生。從圖中可以看出，當(dāng)PH為6. O時，最利于菌株胞外多糖的產(chǎn)生。所以選擇培養(yǎng)基初始pH為6. O進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。實施例6
本實施例說明發(fā)酵時間對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響，將種子培養(yǎng)液以3% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，初始PH值為6，于37°C，160 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量為30mL/500 mL三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)不同的時間，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出菌株胞外多糖的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長在不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時間為35 h時，菌株胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到最高。當(dāng)繼續(xù)延長發(fā)酵時間菌株胞外多糖的產(chǎn)量反而下降，原因可能是因為底物的營養(yǎng)價值已被消耗盡無法繼續(xù)提供菌株細(xì)胞生長及胞外多糖的分泌，從而造成多糖產(chǎn)量的下降；也可能是由于大量多糖覆蓋在菌株細(xì)胞表面抑制了菌株的繼續(xù)生長及分泌多糖。目前許多研究也在傾向于胞外多糖產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長而降低，可能與酶降解或培養(yǎng)基成分的減少有 關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的方法，其特征在于發(fā)酵時，在100 mL三角瓶中裝入一定體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入一定量的枯草芽孢桿菌種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在不同的初始PH值條件下發(fā)酵培養(yǎng)以一定的轉(zhuǎn)速和溫度下發(fā)酵一定的時間。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖25g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉膏3.0 8/1，檸檬酸三鈉1.0 g/L ;pH值根據(jù)發(fā)酵條件選定。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于種子培養(yǎng)液的制備方法為將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d，制成種子培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于固體培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，蛋白胨5 g/L,牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15-20 g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于發(fā)酵溫度為40°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于接種量為3%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)速為160rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于裝液量為30mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基pH值為6.O。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于發(fā)酵時間為35h。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的方法，本發(fā)明以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，對影響發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)基pH及發(fā)酵時間進(jìn)行了研究。
文檔編號C12R1/125GK102690850SQ20121020938
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者張斌 申請人:蘇州百趣食品有限公司