專利名稱：一種魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從魚類加工副產(chǎn)物中提取酶的方法，尤其涉及一種魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝。
背景技術(shù)：
魷魚是生活在海洋中的無脊椎動(dòng)物，每年全球食用量非常大，而魷魚有30%左右的頭、足、內(nèi)臟及表皮等廢棄物，其中內(nèi)臟占15. 92%，通常被廢棄和就地掩埋處理，這樣既沒有充分開發(fā)魷魚附加值，造成其中蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)，而且還存在著環(huán)境污染的隱患。隨著魷魚加工業(yè)的不斷發(fā)展，加工下腳料中內(nèi)臟占大部分，魷魚內(nèi)臟中含有豐富的酶，但至今還沒有對(duì)其進(jìn)行提取方法的研究。目前對(duì)魷魚內(nèi)臟的利用主要集中在利用蛋白酶從魷魚內(nèi)臟中提取魚油和用其生產(chǎn)“魷溶漿”，該法利用內(nèi)源蛋白酶的自溶作用將魷魚內(nèi)臟液化， 以得到蛋白水解液，但通過自溶作用獲得的水解液存在明顯的苦澀味和腥臭味，產(chǎn)品風(fēng)味差。因此，有效地處理魷魚廢棄物并進(jìn)行高值化綜合利用，具有較大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提取方法設(shè)計(jì)合理、能將魷魚廢棄物進(jìn)行綜合利用的魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特點(diǎn)是其步驟如下
(1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:1 3向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min,離心5 15min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解,溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；
(2)堿性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I:8 12用pH為7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000 4000r/min離心10 20min后，得到上清液，沉淀再用pH為7. 5的20mM Tris-HCl處理后再次離心，棄去沉淀，上清液合并，過濾，得到魷魚內(nèi)臟堿性酶液。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還提供了另一種魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特點(diǎn)是其步驟如下
(1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:1 3向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min,離心5 15min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解,溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I: 8 12用0. 065M HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C, 3000 4000r/min,離心5 20min后，取上清液,沉淀再用0. 065MHCl緩沖液處理后再次離心，棄去沉淀，上清液合井，過濾，即得魷魚內(nèi)臟酸性酶液。本發(fā)明所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝中可以將所得的堿性或者酸性酶液在-20°C _40°C的溫度條件下保藏，作為酶液存入?；蛘呓?jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。保藏的溫度條件最佳為-23. 5°C。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法以魷魚加工廢棄物為原料，從中提取內(nèi)臟酶，有效利用魷魚加工過程中的副產(chǎn)物——內(nèi)臟，變廢為寶，避免了其中蛋白資源的浪費(fèi)，減少對(duì)環(huán)境的污染。該エ藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，高效節(jié)能，本發(fā)明所得酶粉活性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，エ藝簡(jiǎn)単，生產(chǎn)周期短，提取率高，高效節(jié)能，適合 エ業(yè)化生產(chǎn)，有很好的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下進(jìn)ー步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)ー步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。實(shí)施例1，ー種魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝，其步驟如下
(1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:1向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°c，3000r/min,離心5min，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心5min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心5min,棄去上清液,取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；
(2)堿性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I:8用pH為7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min離心IOmin后，得到上清液，沉淀再用pH為7. 5的20mM Tris-HCl處理后再次離心，棄去沉淀，上清液合并，過濾，得到魷魚內(nèi)臟堿性酶液。實(shí)施例2，ー種魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝，其步驟如下
(1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I: 3向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min,離心15min，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心15min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心15min,棄去上清液,取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；
(2)堿性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I: 12用pH為7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，4000r/min離心20min后，得到上清液，沉淀再用pH為7. 5的20mM Tris-HCl處理后再次離心，棄去沉淀，上清液合并，過濾，得到魷魚內(nèi)臟堿性酶液。實(shí)施例3，ー種魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝，其步驟如下
(I)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I :2向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min，離心lOmin，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C，3000r/min,離心lOmin，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心lOmin,棄去上清液,取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；(2)堿性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I :10用pH為7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3500r/min離心15min后，得到上清液，沉淀再用pH為7. 5的20mM Tris-HCl處理后再次離心，棄去沉淀，上清液合并，過濾，得到魷魚內(nèi)臟堿性酶液。實(shí)施例4，實(shí)施例1-3任何一項(xiàng)所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝中將所得的堿性酶液在_20°C的溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。實(shí)施例5，實(shí)施例1-3任何一項(xiàng)所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝中將所得的堿性酶液在_40°C的溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。實(shí)施例6，實(shí)施例1-3任何一項(xiàng)所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝中將所得的堿性酶液在-23. 5°C的溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。實(shí)施例7，ー種魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝，其步驟如下 (1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:1向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°c，3000r/min,離心5min，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心5min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心5min,棄去上清液,取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I:8用0. 065M HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min，離心5min后，取上清液，沉淀再用0. 065M HCl緩沖液處理后再次離心,棄去沉淀,上清液合并,過濾,即得魷魚內(nèi)臟酸性酶液。實(shí)施例8，ー種魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝，其步驟如下
(1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:3向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min，離心15min，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心15min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心15min,棄去上清液,取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I: 12用0. 065M HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，4000r/min，離心20min后，取上清液，沉淀再用0. 065M HCl緩沖液處理后再次離心,棄去沉淀,上清液合并,過濾，即得魷魚內(nèi)臟酸性酶液。實(shí)施例9，ー種魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝，其步驟如下
(1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:2向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min,離心lOmin，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C，3000r/min,離心lOmin，棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心IOmin,棄去上清液,取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I: 10用0. 065M HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3500r/min，離心12min后，取上清液，沉淀再用0. 065M HCl緩沖液處理后再次離心,棄去沉淀,上清液合并,過濾,即得魷魚內(nèi)臟酸性酶液。實(shí)施例10，實(shí)施例7-9任何一項(xiàng)所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝中將所得的酸性酶液在_20°C的溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。實(shí)施例11，實(shí)施例7-9任何一項(xiàng)所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取エ藝中將所得的酸性酶液在_40°C的溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。實(shí)施例12，實(shí)施例7-9任何一項(xiàng)所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝中將所得的酸性酶液在-23. 5°C的溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。酶是一種能催化反應(yīng)過程的蛋白質(zhì)，本發(fā)明通過酶活力的測(cè)定來驗(yàn)證所提取出來的物質(zhì)是酶。蛋白酶在20°C、pH為7的條件下，水解酪素底物，然后 加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并將未水解的酪素沉淀除去，濾液對(duì)紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定。根據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。酶活單位的定義每ImL粗酶液，在一定溫度和pH值條件下，Imin水解酪素產(chǎn)生Iug酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以(u/mL)表示。I.繪制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
(1)取0.05g L-酪氨酸溶于純水中，定容至25ml，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液I，其濃度為2mg/ml ；
(2)將標(biāo)準(zhǔn)溶液I稀釋一倍作為標(biāo)準(zhǔn)溶液2，其濃度為lmg/ml；
(3)將標(biāo)準(zhǔn)溶液2稀釋一倍作為標(biāo)準(zhǔn)溶液3，其濃度為0.5mg/ml ；
(4)將標(biāo)準(zhǔn)溶液3稀釋一倍作為標(biāo)準(zhǔn)溶液4，其濃度為0.25mg/ml ；
(5)再將標(biāo)準(zhǔn)溶液4稀釋一倍作為標(biāo)準(zhǔn)溶液5，其濃度為0.125mg/ml ；
(6)取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5各I.4ml，分別加0. 65ml 22. 5%三氯乙酸溶液，于290nm測(cè)其吸光度。(7)根據(jù)測(cè)得的吸光度值A(chǔ)為為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度c為橫坐標(biāo)作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.酶活力的測(cè)定
(I)堿性酶液活力測(cè)定
先將酪蛋白溶液放入40±0. 2°C恒溫水浴中，預(yù)熱5min，吸取適量稀釋的堿性酶液2ml于試管中，加入酪蛋白2ml搖勻后放入20°C恒溫水浴中反應(yīng)20min，加入4ml 22. 5%三氯乙酸溶液震蕩搖勻后置于冰水浴中l(wèi)Omin，取出室溫條件下6000r/min離心15 min，取上清液過濾，290nm測(cè)其吸光度?？瞻诪橄劝牙业鞍着c三氯乙酸混合IOmin后再加酶液，然后與反應(yīng)液共同離心測(cè)吸光度值，以蒸餾水校準(zhǔn)儀器。在20°C下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I U g酪氨酸，定義為I個(gè)蛋白酶活力單位。X = AXKX 8/2 X 1/20 XnXE = 1/5 XAXKXnXE 式中X——樣品的酶活力，(u/mL)；
A——試樣溶液的平均吸光度；
K——吸光常數(shù)；
8——反應(yīng)試劑的總體積，mL ；
2——吸取酶液2. OOmL ；
1/10-反應(yīng)時(shí)間IOmin,以Imin計(jì)；
n——稀釋倍數(shù)；
E——紫外法與福林法的換算系數(shù)(中性、堿性蛋白酶系數(shù)為0. 50)。
所得結(jié)果表示至整數(shù)。所得堿性酶液活力不低于12u/mL。(2)酸性酶活力測(cè)定
先將牛血紅蛋白溶液放入40±0. 2°C恒溫水浴中，預(yù)熱5min，吸取適量稀釋的酶液2ml于試管中，加入牛血紅蛋白2ml搖勻后放入30°C恒溫水浴中反應(yīng)20min，加入4ml 22. 5%三氯こ酸溶液震蕩搖勻后置于冰水浴中IOmin,取出室溫條件下6000r/min離心15 min,取上清液過濾，275nm測(cè)其吸光度?？瞻诪橄劝雅Ｑt蛋白與三氯こ酸混合IOmin后再加酶液，然后與反應(yīng)液共同離心測(cè)吸光度值，以蒸餾水校準(zhǔn)儀器。在20°C下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I U g酪氨酸，定義為I個(gè)蛋白酶活力単位。 X = AXKX 8/2 X 1/20 XnXE = 1/5 XAXKXnXE 式中X——樣品的酶活力，(u/mL)；
A——試樣溶液的平均吸光度；
K——吸光常數(shù)；
8——反應(yīng)試劑的總體積，mL ；
2——吸取酶液2. OOmL ；
1/20-反應(yīng)時(shí)間20min,以Imin計(jì)；
n——稀釋倍數(shù)
E——紫外法與福林法的換算系數(shù)(酸性蛋白酶系數(shù)為0. 77)。所得酸性酶液活力不低于12u/mL。
權(quán)利要求
1.一種魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特征在于其步驟如下 (1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:1 3向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min,離心5 15min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解,溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉； (2)堿性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I:8 12用pH為7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000 4000r/min離心10 20min后，得到上清液，沉淀再用pH為7. 5的20mM Tris-HCl處理后再次離心，棄去沉淀，上清液合并，過濾，得到魷魚內(nèi)臟堿性酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特征在于將所得的堿性酶液在-20°C _40°C的溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特征在于保藏的溫度條件為-23. 5。。。
4.一種魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特征在于其步驟如下 (1)以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水浙干后，按質(zhì)量體積比I:1 3向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)0°C，3000r/min，離心5 15min,棄去上清液,沉淀用丙酮溶解，溶液再經(jīng)離心機(jī)0°C, 3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液經(jīng)離心機(jī)0°C,3000r/min,離心5 15min,棄去上清液，取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉； (2)酸性酶的提取將丙酮干粉按重量體積比I: 8 12用0. 065M HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)(TC, 3000 4000r/min,離心5 20min后，取上清液,沉淀再用0. 065MHCl緩沖液處理后再次離心，棄去沉淀，上清液合并，過濾，即得魷魚內(nèi)臟酸性酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特征在于將所得的酸性酶液在_20°C _40°C溫度條件下保藏，或經(jīng)冷凍干燥，即得到高活性的魷魚內(nèi)臟酶酶粉粗制品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，其特征在于保藏的溫度條件為-23. 5。。。
全文摘要
本發(fā)明是一種魷魚內(nèi)臟酶的提取工藝，它以新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，將水瀝干后，按質(zhì)量體積比11～3向原料中加入丙酮，再用組織勻漿機(jī)處理成漿狀；過濾，所得濾液經(jīng)冷凍離心機(jī)后，取出沉淀在自然條件下風(fēng)干，得丙酮干粉；將丙酮干粉按重量體積比18～12用pH為7.5的20mMTris-HCl溶解成均勻狀態(tài)，經(jīng)冷凍離心機(jī)，沉淀再用pH為7.5的20mMTris-HCl處理后再次離心，上清液合并，過濾，得到魷魚內(nèi)臟堿性酶液。本發(fā)明方法以魷魚加工廢棄物為原料，從中提取內(nèi)臟酶，避免了其中蛋白資源的浪費(fèi)，減少對(duì)環(huán)境的污染。該工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，高效節(jié)能，本發(fā)明所得酶粉活性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，提取率高，高效節(jié)能，適合工業(yè)化生產(chǎn)，有很好的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/64GK102787110SQ20121021795
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者張俊杰, 朱勤, 段蕊, 陳憶鳳 申請(qǐng)人:江蘇天福萊集團(tuán)有限公司