專利名稱：一種天然黃色素生產(chǎn)方法及其生產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然黃色素的生產(chǎn)技術(shù)方法及其生產(chǎn)菌株，尤其是低能耗清潔生產(chǎn)天然黃色素的技術(shù)方法，屬于生物化工及著色劑生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
色素，也稱著色劑，廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、印染、食品等行業(yè)領(lǐng)域，能夠在很大程度上改善產(chǎn)品性狀及影響產(chǎn)品品質(zhì)。人工合成色素和天然色素是兩類應(yīng)用廣泛的主要色素。盡管人工合成色素色澤鮮艷，價格低廉，著色性及穩(wěn)定性良好，但鑒于其對人體健康普遍存在一定程度的毒性，甚至具有致畸、致突變、致癌作用。許多國家已對人工合成色素的使用種類、應(yīng)用范圍、添加劑量等作出明確規(guī)定，有些國家甚至完全禁止使用合成色素。天然色素與合成色素相比，具有天然、健康以及安全性相對較高的最大優(yōu)點，并且能賦予食品許多新功能，符合人們對“安全、天然、營養(yǎng)、多功能”色素產(chǎn)品的需求。世界天然色素市場 正以每年10%的速度快速增長，市場前景非常樂觀。
現(xiàn)今生產(chǎn)天然黃色素的方法主要有抽提法和微生物發(fā)酵法，通過抽提法生產(chǎn)的黃色素主要有姜黃色素、葉黃素、桅子黃色素、紅花黃色素、玉米黃色素等。這種生產(chǎn)方法主要是從植物里抽提，受季節(jié)影響很大，且抽提過程中引入了有機試劑，成本較高(楊萌，吳振強.食用天然黃色素的研究近況.中國調(diào)味品，2008，(2):67-71.)。微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)天然黃色素不受季節(jié)影響，成本較低，轉(zhuǎn)化率高，且已知的微生物代謝產(chǎn)生的色素基本安全無毒，發(fā)展前景十分廣闊。但由于菌種資源缺乏，到目前為止，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃色素的相關(guān)研究報道很少，主要集中在紅曲霉菌株的利用上。紅曲霉菌本身安全性較高，而且紅曲霉菌不僅產(chǎn)紅色素，也產(chǎn)黃色素，紅曲黃色素的蛋白著色能力很強，熱穩(wěn)定性好。有報道稱綠色木霉也能發(fā)酵產(chǎn)黃色素(張曉毅，崔英德，陸寧等.綠色木霉菌產(chǎn)黃色素液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化·化工學(xué)報，2010，61 (12) :3205-3212.) ο
目前能代謝合成黃色素的微生物資源比較少，大都處于實驗室研究階段，只有日本實現(xiàn)了一種微生物黃色素(紅曲黃色素)的商品化生產(chǎn)。泰國在紅曲黃色素方面的研究較多，已經(jīng)進(jìn)入中試研究階段，但據(jù)證實還沒實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)(周波，吳吉林，朱明軍等.微生物黃色素的研究進(jìn)展.微生物學(xué)通報，2010，37(9) :1362-1368.)。
黃色素是一類主要的食用著色劑，天然黃色素國內(nèi)市場需求量占色素總需求量的60%以上，加上旺盛的國際市場需求，天然黃色素呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的局面，因此研究開發(fā)食用天然黃色素將具有廣闊的市場前景及巨大的經(jīng)濟(jì)潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)生大量胞外黃色素的細(xì)菌菌株，通過發(fā)酵提取制備大量天然黃色素粗制品及精制品。
本發(fā)明提供了一種黃色素產(chǎn)生菌-突光假單胞菌iPsoudomorms fluorescens
BMG-1)菌株，同時提供利用該菌株生產(chǎn)天然黃色素的發(fā)酵及制備工藝方法。本發(fā)明所提供的產(chǎn)黃色素突光假單胞菌iPsGudomorms fluorescens BMG-1)已于2012年5月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 6060。
該菌株呈短桿狀，無芽胞、莢膜，革蘭氏陰性，好氧，4°C下生長，41°C下不生長。該菌株氧化酶、接觸酶反應(yīng)呈陽性；D，L-丙氨酸、L-天冬氨酸(酰胺)、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-組氨酸、羥脯氨酸代謝陽性，而L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、D-絲氨酸及尿苷、胸苷代謝陰性。不能利用糊精、糖原、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、核糖醇、D-纖維二糖、L-果糖、龍膽二糖、a -D-乳糖、麥芽糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-海藻糖及木糖醇；能夠利用葡萄糖(產(chǎn)酸)、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-山梨醇、甘油、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-甘露醇、蔗糖、D-葡糖酸、丙酸、丙二酸、D, L-乳酸、D-己糖酸、丁二酸及朽1檬酸。結(jié)合16S rDNA序列比對分析確定該菌株為突光假單胞菌iPseudomonasfluorescens)(中國科學(xué)院微生物研究所檢測鑒定報告(2010)微檢字第223號)。在固體PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，蒸餾水IOOOmL)上菌落圓形，表面濕潤光滑，邊緣整齊，最初白色，隨后中心變藍(lán)，藍(lán)色隨菌落生長而向外擴(kuò)展，菌落生長處的培養(yǎng)基變?yōu)辄S綠色。菌株適宜產(chǎn)色素溫度為20°C -28°C?！?br> 突光假單胞菌iPseudomonas fl uorescens BMG-1)可以米用凍干管或土壤法保藏。凍干管法保藏的菌種可在-20°C保存I年以上。土壤保藏法是刮取在固體PDA培養(yǎng)基上于220C -28°C恒溫培養(yǎng)36-48小時的菌落，接種于濕潤無菌土壤中，于同樣溫度下培養(yǎng)36-48小時，然后將接菌土壤轉(zhuǎn)入4°C恒溫保藏，該法可以保藏菌種I年左右。
長期保藏的菌種在發(fā)酵培養(yǎng)之前需要進(jìn)行活化培養(yǎng)。以無菌水制備熒光假單胞菌{Pseudomonas fl uorescens BMG-1)保藏土的土懸液，以土懸液作IO2-IO4倍稀釋后涂布MKB平板進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)。MKB培養(yǎng)基含有下述物質(zhì)5. O克酪蛋白氨基酸，15mL甘油，2. 5克K2HPO4, 2. 5 克 MgSO4 · 7H20，加蒸餾水至 1000 毫升，115°C滅菌 20 分鐘，pH 為 7. 2。
本發(fā)明繼提供產(chǎn)黃色素菌株之外，也提供了由本發(fā)明菌株生產(chǎn)黃色素的方法。
由本發(fā)明所提供菌株生產(chǎn)黃色素的步驟如下
1)發(fā)酵培養(yǎng)挑取復(fù)壯培養(yǎng)的突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens BMG-1)CGMCC No. 6060培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基。待PDA培養(yǎng)基平板上的菌苔變?yōu)樯钏{(lán)色后，以每個直徑0 9cm平板用IOmL PD液的比例配制發(fā)酵用種子液，以2%_8%的接種量將種子液接種于發(fā)酵H)培養(yǎng)液中，在20°C _28°C靜置發(fā)酵培養(yǎng)48小時。本發(fā)明采用淺盤靜置培養(yǎng)發(fā)酵方式，淺盤中培養(yǎng)液層厚度為l_2cm。
2)色素制備離心除去發(fā)酵培養(yǎng)液中的菌體,收集上清液并低溫真空濃縮至原體積的1/5-1/10。以5-10倍乙醇浸提濃縮液，合并乙醇浸提液并真空濃縮干燥可制得黃色素粗制品。合并乙醇浸提液過硅膠柱層析可制得黃色素精制品。
所選PDA培養(yǎng)基含有下述物質(zhì)20克葡萄糖，200克新鮮馬鈴薯的沸水浸出物，18克瓊脂粉，加蒸餾水至1000毫升，121。。滅菌20分鐘，pH為7. O。
所選發(fā)酵生產(chǎn)黃色素的H)培養(yǎng)液含有下述物質(zhì)20克葡萄糖，200克新鮮馬鈴薯的沸水浸出物，加蒸餾水至1000毫升，121°C滅菌20分鐘，pH為7. O。
本發(fā)明制備的黃色素，易溶于水，在250nm處有一個最大吸收峰，在pH2. 2-10. O范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，具有非常良好的熱穩(wěn)定性和自然光穩(wěn)定性，具有一定程度的抗氧化能力。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株生長速度快，在20°C _28°C溫度范圍內(nèi)都可發(fā)酵產(chǎn)色素，發(fā)酵產(chǎn)色素過程為淺盤靜置、自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)條件及設(shè)備要求粗放，能耗低，色素產(chǎn)量大(黃色素粗品產(chǎn)量可以達(dá)到I. 6-1. 9克/升發(fā)酵液，黃色素精制品產(chǎn)量可以達(dá)到I. 0-1. 5克/升發(fā)酵液)，制備工藝簡單，便于產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵制得的黃色素為純天然色素產(chǎn)品，對動物體無任何毒副作用，可以廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、印染、食品等行業(yè)領(lǐng)域。


圖I所示為本發(fā)明的黃色素產(chǎn)生菌-突光假單胞菌fluorescens
BMG-1) CGMCC No. 6060。
圖2所示為熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)黃色素的吸收光譜曲線圖。
圖3所示為不同溫度對熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)黃色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。
圖4所示為pH2. 2-8. O值對熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)黃色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。
圖5所示為pH9. 0-10. 6值對熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)黃色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。
圖6所示為pHll. 0-12. O值對熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)黃色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。
圖7所示為不同光照條件對熒光假單胞BGM-I菌株所產(chǎn)黃色素穩(wěn)定性的影響曲線圖。
具體實施例方式實施例I、熒光假單胞菌BMG-1 (CGMCC No. 6060)的培養(yǎng)
將活化復(fù)壯的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，檢測菌落顏色及培養(yǎng)基顏色的變化；刮取變?yōu)樯钏{(lán)色的菌苔接種于ro培養(yǎng)液中，分散均勻，制備成種子液。將種子液接種于發(fā)酵ro培養(yǎng)液中淺盤靜置、自然通氣方式培養(yǎng)，培養(yǎng)液層厚度為l-2cm，26°C恒溫培養(yǎng)，至整個培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯铧S綠色時結(jié)束培養(yǎng)過程。
實施例2、菌種發(fā)酵培養(yǎng)及黃色素提取制備
1、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
將由復(fù)壯的BMG-I菌種制備的ro種子液以2%的接種量接入ro發(fā)酵培養(yǎng)液，淺盤靜置、自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)液層厚度lcm，22°c恒溫培養(yǎng)，至72小時整個培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯铧S綠色時結(jié)束培養(yǎng)過程。
2、黃色素的提取制備
收集發(fā)酵培養(yǎng)液在8000r/min下離心15min,合并上清液在40°C下真空濃縮至原體積的1/10。以7倍體積無水乙醇浸提濃縮液，合并無水乙醇浸提液并在40°C下真空濃縮、干燥可制得黃色素粗制品，得率為I. 68g/L發(fā)酵液。將此黃色素粗制品過60-100目硅膠柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集黃色洗脫組分，濃縮干燥后可制得黃色素精制品，得率為I. 27g/L發(fā)酵液。
實施例3、菌種發(fā)酵培養(yǎng)及黃色素提取制備
I、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
將由復(fù)壯的BMG-I菌種制備的ro種子液以5%的接種量接入ro發(fā)酵培養(yǎng)液，淺盤靜置、自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)液層厚度I. 5cm，24°C恒溫培養(yǎng)，至60小時整個培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯铧S綠色時結(jié)束培養(yǎng)過程。2、黃色素的提取制備
收集發(fā)酵培養(yǎng)液在8000r/min下離心15min,合并上清液在40°C下真空濃縮至原體積的1/8。以8倍體積無水乙醇浸提濃縮液，合并無水乙醇浸提液并在40°C下真空濃縮、干燥可制得黃色素粗制品，得率為I. 91g/L發(fā)酵液。將此黃色素粗制品過60-100目硅膠柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集黃色洗脫組分，濃縮干燥后可制得黃色素精制品，得率為1.43g/L發(fā)酵液。
實施例4、菌種發(fā)酵培養(yǎng)及黃色素提取制備
1、菌種發(fā)酵培養(yǎng)
將由復(fù)壯的BMG-I菌種制備的ro種子液以7%的接種量接入ro發(fā)酵培養(yǎng)液，淺盤靜置、自然通氣培養(yǎng)方式，培養(yǎng)液層厚度2. 0cm, 26°C恒溫培養(yǎng)，至48小時整個培養(yǎng)液顏色變?yōu)樯铧S綠色時結(jié)束培養(yǎng)過程?！? 2、黃色素的提取制備
收集發(fā)酵培養(yǎng)液在8000r/min下離心15min,合并上清液在40°C下真空濃縮至原體積的1/7。以10倍體積無水乙醇浸提濃縮液，合并無水乙醇浸提液并在40°C下真空濃縮、干燥可制得黃色素粗制品，得率為I. 73g/L發(fā)酵液。將此黃色素粗制品過60-100目硅膠柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集黃色洗脫組分，濃縮干燥后可制得黃色素精制品，得率為I. 35g/L發(fā)酵液。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)黃色素突光假單胞菌 iPseudomonas fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens BMG-1) CGMCCNo. 6060發(fā)酵生產(chǎn)提取黃色素的方法，包括如下步驟 1).將保藏的突光假單胞菌fluorescensBMG-1) CGMCC No. 6060 使用MKB培養(yǎng)基活化、擴(kuò)大培養(yǎng)； 2).將步驟I)的菌株培養(yǎng)物以2%-8%的接種量接種于H)培養(yǎng)液中，200C-280C淺盤靜置、自然通氣方式培養(yǎng)36-60小時； 3).將步驟2)的培養(yǎng)液除去菌體，收集上清液，以乙醇提取其中的黃色素，經(jīng)濃縮干燥后獲得黃色素粗制品及精制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于活化復(fù)壯熒光假單胞菌的MKB培養(yǎng)基含有下述物質(zhì)5. O克酪蛋白氨基酸，15mL甘油，2. 5克K2HPO4, 2. 5克MgSO4 · 7H20，加蒸餾水至1000毫升，115°C滅菌20分鐘，pH為7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所選發(fā)酵生產(chǎn)黃色素的H)培養(yǎng)液含有下述物質(zhì)20克葡萄糖，200克新鮮馬鈴薯的沸水浸出物，加蒸餾水至1000毫升，121°C滅菌20分鐘，pH為7. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述黃色素生產(chǎn)采用淺盤靜置、自然通氣方式。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述含黃色素上清液是通過離心除去培養(yǎng)液中的菌體后得到的，離心轉(zhuǎn)速為3000-8000r/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或6所述的方法，其特征在于低溫(35°C-45°C )真空濃縮離心除菌后的含黃色素上清液至原體積的1/5-1/10 ;以乙醇浸提濃縮液，收集合并黃色乙醇提取液，低溫(35°C -40°C )真空濃縮干燥可制得黃色素粗制品；將含黃色素乙醇提取液在濃縮后過硅膠柱層析、減壓濃縮干燥可制得黃色素精制品。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的方法，其特征在于所述黃色素提取溶劑為無水乙醇，用量為濃縮液的5-10倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或7或8所述的方法，其特征在于所述柱層析采用60-100目或100-200目試劑級硅膠，以蒸餾水為洗脫劑；收集洗脫液真空干燥后獲得黃色素精制品；所述黃色素精制品在250nm處有I個最大吸收峰。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天然黃色素生產(chǎn)方法及其發(fā)酵生產(chǎn)菌株。本發(fā)明使用熒光假單胞菌BGM-1菌株(PseudomonasfluorescensBGM-1) CGMCC No.6060生產(chǎn)胞外水溶性黃色素，生產(chǎn)方法為將產(chǎn)黃色素?zé)晒饧賳伟鶥GM-1菌株以2%-8%接種量接種于淺盤PD培養(yǎng)液中，20-28℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)24-48小時得到發(fā)酵液。離心除去菌體，濃縮發(fā)酵上清液。以乙醇浸洗經(jīng)濃縮的發(fā)酵上清液，35-40℃真空濃縮干燥可制得黃色素粗制品。將黃色素粗品過硅膠柱層析得到精制品。所得黃色素具有很好的光熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，對動物無任何毒副作用，為純天然黃色素產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、食品等工業(yè)各領(lǐng)域。本發(fā)明為天然黃色素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了新的方法及途徑。
文檔編號C12P1/04GK102899265SQ20121021800
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者毛得獎, 朱亞玲, 韓寧 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院