專利名稱：一種粘紅酵母油脂基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres. ) Harrison)是一種重要的產(chǎn)油微生物，可以產(chǎn)生微生物油脂和其他活性物質(zhì)，類胡蘿卜素，L-苯丙氨酸，SOD等，并在一定條件下，產(chǎn)生a-丙氨酸和谷氨酸。由于其營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、粗放，可用蔗渣、廢糖蜜等作為培養(yǎng)基質(zhì)，成本較低。尤其是其脂質(zhì)含量明顯高于其他產(chǎn)油微生物，近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越專注于其產(chǎn)油功能的開發(fā)研究，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，使粘紅酵母產(chǎn)油量獲得了一定的提高。但是 靠外在的生長(zhǎng)環(huán)境的改變使其產(chǎn)油量獲得更高的提升顯然不現(xiàn)實(shí)。目前對(duì)于產(chǎn)油粘紅酵母基因工程改造方面的研究較為匱乏，還未見有文獻(xiàn)報(bào)道將產(chǎn)油相關(guān)基因?qū)胝臣t酵母內(nèi)表達(dá)，對(duì)于粘紅酵母基因工程改造的資料也幾乎處于空白。產(chǎn)油微生物油脂合成代謝調(diào)控過(guò)程有兩個(gè)關(guān)鍵酶，檸檬酸裂解酶(ACL)和蘋果酸酶(ME) (Adams IP,et al. The distinctiveness of ATP:citratelyase fromAspergillus nidulans. Biochem Biophys Acta, 2002),大量研究表明，產(chǎn)油微生物油月旨積累的多少與ME的代謝調(diào)控有關(guān)，如果ME受到抑制，則油脂積累下降。這是因?yàn)殡m然微生物代謝途徑中有許多生成NADPH的過(guò)程，但FAS幾乎只能利用由ME產(chǎn)生的NADPH(Wynn JP,etal. The role ofmalic enzymein the regulation of lipid accumulationin filamentous fungi. Microbiology, 1999)。研究表明，以卷枝毛霉為模式有機(jī)體，在蘋果酸酶活性的特異性抑制劑芝麻酚的作用下，其脂肪積累量從25%下降到2%，而其菌體生長(zhǎng)沒(méi)有任何負(fù)面的影響(Song Y，et al. A pregenetic study of the isoformsof malic enzyme associated with lipid accumulation in Mucor circinelloides.Microbiology, 2001.)。進(jìn)一步證實(shí)了 ME的活性與脂肪積累量之間存在直接的相關(guān)性。因此，如果能鑒定和分離產(chǎn)油微生物的ME基因，就可以利用基因工程手段甚至化學(xué)生物學(xué)手段選擇性調(diào)控蘋果酸酶的活性，提高微生物產(chǎn)油能力。rDNA在酵母基因組中有100-200個(gè)重復(fù)單兀(Scopione RC, et al. A new promoter probe vector for Saccharomteescerevisiae using fungal glucoamylase cDNA as the reporter gene. Yeast, 1993.),以rDNA為同源整合的靶順序構(gòu)建的載體，既克服了通常整合載體只有單拷貝或幾個(gè)拷貝的局限，同時(shí)又保留整合載體穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，所以是一類用于表達(dá)外源基因理想的載體系統(tǒng)。目前這種策略已成功在多種微生物中構(gòu)建并實(shí)現(xiàn)表達(dá)應(yīng)用，如Bacillus subtilis、Saccharomy cerevisiae、Pichia pastoris、Candida albicans、Kluyveromyces lactis、Phaffa rhodozyma、Hansenula Polymorpha、Arxula adeninivorans 等(Jens K, CornelisPH, etal. Integration of heterologous genes in several yeast species usingvectors containing a Hansenula polymorpha-derived rDNA-targeting element.FEMS Yeast Research, 2003 ；Mahadtanapuk S,etal. Cloning of antifungal gene fromBacillus licheniformis by application of low energy ion beam bombardment.Surface&Coatings Technology,2009.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種粘紅酵母野生菌株(Rhodotorulaglutinis)。本發(fā)明的目的還在于提供一種粘紅酵母野生菌株的構(gòu)建方法，以提高粘紅酵母的
產(chǎn)油量。本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母野生菌株的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了粘紅酵母GM4 (Rhodotorulaglutinis GM4)，于2012年6月5日保藏在位于中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2012203。 本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌的構(gòu)建方法，利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子基因PGKl和卷枝毛霉的蘋果酸酶基因ME構(gòu)建成表達(dá)載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)，其基因工程菌的構(gòu)建的具體步驟如下A、目的基因的獲取(I)采用珠磨與酚氯仿結(jié)合法提取粘紅酵母的總基因組DNA ;將提取的總DNA純化后點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，此基因組模板分裝后于_20°C保存，并用于后序的PCR反應(yīng)；根據(jù)粘紅酵母基因組中rDNA的保守序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物擴(kuò)增26SrDNA D1/D2片段和5. 8SrDNA-ITS 片段；(2)以卷枝毛霉基因組為模板，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中蘋果酸酶同源保守的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，引物設(shè)計(jì)如下Fr5’ -AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3’ 如 SEQ IDN0. 2 所示Rr5’ -CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3’ 如 SEQ IDN0. 3 所示PCR擴(kuò)增得到大小為2. Ikb的ME基因片段，通過(guò)A-T克隆插入pMD_T質(zhì)粒載體，獲得pMD-ME，轉(zhuǎn)入E. coli DH5 a，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)XhoI和NotI消化轉(zhuǎn)入pPICZ-E，構(gòu)建pPICZ-ME載體；(3)強(qiáng)啟動(dòng)子PGKl的獲取及載體的構(gòu)建提取釀酒酵母YS58基因組DNA，根據(jù)PGKl基因保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增啟動(dòng)子PGKl基因，引物設(shè)計(jì)如下Fr :5’ -ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3’ 如 SEQ IDN0. 4 所示EcoRIRr :5’ -TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3’ 如 SEQ IDN0. 5 所示BamHI將PCR擴(kuò)增的PGKI基因純化后直接與PMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性的克隆再抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證；B、同源重組表達(dá)載體pPICZ-rD-ME的構(gòu)建將ME基因酶切連接到質(zhì)粒pPICZ-rD上，構(gòu)建多順?lè)醋硬⑴c抗性基因Zeocin共用一個(gè)PGKl啟動(dòng)子和CYCl終止子；構(gòu)建的同源重組載體pPICZ-rD-ME轉(zhuǎn)化粘紅酵母菌，能整合到染色體上，便可同時(shí)表達(dá)ME基因和抗性基因。步驟(I)擴(kuò)增26SrDNA D1/D2片段的一對(duì)引物為26SrDNA D1/D2 NL-I :5，-CGCGGATCCGTAGGTCGAAACAGAACA-3，如 SEQ IDN0. 6 所示26SrDNA D1/D2 NL-4 :5，-TGCTCTAGAGAAAGTAACATCCCAATG-3，。如 SEQ IDN0. 7 所
示步驟(I)擴(kuò)增5. 8SrDNA-ITS片段的一對(duì)引物為5. 8SrDNA-ITS(l):5，-CTGCAGAACCAATGCATTGGTCCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 如 SEQ IDN0. 8 所示5. 8SrDNA-ITS(2): 5’ -GAAGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。如 SEQ IDN0. 9 所示所述的A中步驟3)中在含有氨節(jié)青霉素、x_Gal、IPTG的LB平板上篩選白色菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性的克隆。rDNA的PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，此過(guò)程共計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。rDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
反應(yīng)物川S (ML)
10Xl>CR huITer2.5
dNTPs ( 2, SiiiboLL-I )4
丨物 I ( IOjj iiol. L-I)I
引物 2 ( IOm mol. I-I)I
粘紅酵_.墻園泔校板I
TaqDNA 聚 ( BI. }j L-1)0. 3
dd"2015. 2
總體枳25B. PGKl的PCR擴(kuò)增條件為94°C 預(yù)變性 4min，94°C變性 lmin，54°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 lOmin。PGKl的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為反應(yīng)物fflS (M i-)
IOXFCR buffer5
dNTPs5
上游引物0.7 下游引物0.7
隨灑_母基_組模扳0.4
TaqIMA 聚合_0.4
ddH2037.8
總體積50C. ME基因的PCR擴(kuò)增條件為94°C 預(yù)變性 5min，94°C 變性 lmin，544°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 lOmin。ME基因的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為
反應(yīng)物用量(M L)
IOXPCR bufferS
dM'Ps5
.l-r游引物0.7
下游引物0.7
卷枝毛霉0. 4TaqDNA 聚合_(J. 4
ddH2037,8
總體積50。同源重組載體pPICZ-rD-ME的基因序列表如SEQ IDNO. I所示。首先通過(guò)利用XhoI和NotI雙酶切同源重組載體pPICZ-rD-ME。表I重組載體pPICZ-rD-ME的雙酶切體系反應(yīng)物用量(M L)
pPICZ-rD-ME (25ng. p L-1)15
Xhol2
NotI2
IOXK buffer6
0. 1%BSA5
總體積24
酶切反應(yīng)在37°C水浴反應(yīng)3h。載體pPICZ-rD-ME雙酶切體系的回收純化采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和PCR產(chǎn)物直接純化試劑盒純化回收。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種粘紅酵母的篩選和培養(yǎng)方法，其方法的具體步驟如下I)粘紅酵母篩選菌株初篩采用孟加拉紅培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)采用Yro培養(yǎng)基，并通過(guò)蘇丹黑染色法進(jìn)行產(chǎn)油量的初篩；通過(guò)熱酸-有機(jī)溶劑法進(jìn)一步定量確定候選菌株的產(chǎn)油量高低；兩輪篩選之后，獲得一株高產(chǎn)油脂菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)生理生化鑒定，初步判斷這是一株酵母菌；通過(guò)測(cè)定其26SrDNADl/D2區(qū)域序列，進(jìn)一步確定該微生物為粘紅酵母；2)粘紅酵母培養(yǎng)條件將粘紅酵母保藏斜面移接到活化培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵96h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體。所述粘紅酵母篩選過(guò)程中26SrDNADl/D2區(qū)域序列為序列表中的SEQ IDN0. I。所述粘紅酵母培養(yǎng)中活化培養(yǎng)基為酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH值為6. 8 7. 2。所述粘紅酵母培養(yǎng)中液體種子培養(yǎng)基為酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，KH2PO4O. 7%, Na2HPO4O. 25%, MgSO4. 7H200. 15%, pH 值為 6. 8 7. 2。所述粘紅酵母培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，KH2PO4O. 7%，Na2HPO4O. 25%, MgSO4. 7H200. 15%, CaCl2O. 015%, FeCl3. 6H200. 015%, ZnSO4. 7H200. 002%, MnSO4.H2OO. 006%, (MM)2SO4O. 05%, pH6. 0。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產(chǎn)微生物油脂方面的應(yīng)用。另夕卜，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產(chǎn)功能性油脂方面的應(yīng)用。通過(guò)5L發(fā)酵罐小試培養(yǎng)，表明導(dǎo)入ME和PGKl后的粘紅酵母菌，相對(duì)于野生菌株，其蘋果酸酶活性提高了 3. 6倍，脂質(zhì)含量從27%提高到68%，生物量從15%提高到33%。同時(shí)，脂質(zhì)積累的穩(wěn)定期，轉(zhuǎn)化菌株較野生菌株提前5. 5小時(shí)，而脂質(zhì)積累的穩(wěn)定期也相對(duì)野生菌株延長(zhǎng)了 2小時(shí)。轉(zhuǎn)化菌株的脂肪酸代謝中不飽和脂肪酸含量尤其是Y-亞麻酸的含量增加顯著，提高了 13%。轉(zhuǎn)化菌株在非選擇培養(yǎng)條件下，連續(xù)生長(zhǎng)50世代質(zhì)粒穩(wěn)定性為99. 86%。由此可見，該基因工程菌株能夠在強(qiáng)啟動(dòng)子PGKl帶動(dòng)下穩(wěn)定地表達(dá)外源基因ME，從而實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)在粘紅酵母內(nèi)的快速積累。發(fā)酵罐小試培養(yǎng)的具體的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程①首先發(fā)酵培養(yǎng)基的配制酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，pH6. 0，裝樣量為4L。②對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，121°C滅菌30min。③滅菌結(jié)束，設(shè)定培養(yǎng)條件30°C，180rpm,空氣流量為每分鐘0. 5個(gè)罐體體積。并通過(guò)2mol. L-I的KOH或2mol. L-I的HCl自動(dòng)添加使pH維持在5. 5 6. 5。④按10%接種量的接種量接入粘紅酵母種子培養(yǎng)液。培養(yǎng)96h。⑤發(fā)酵結(jié)束，管式離心機(jī)18000rpm離心收集菌體。測(cè)定生物量和脂質(zhì)含量。本發(fā)明主要根據(jù)酵母較易發(fā)生同源重組的特點(diǎn)，利用染色體DNA中多拷貝串聯(lián)的 兩段rDNA單位序列作為整合載體同源重組靶位點(diǎn)，以提高外源基因在酵母基因組中的拷貝數(shù)，構(gòu)建出兼具多拷貝數(shù)和高穩(wěn)定性雙重優(yōu)點(diǎn)的新型整合型載體。通過(guò)本發(fā)明的提供了一種構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達(dá)載體，以適用對(duì)粘紅酵母野生株的分子生物學(xué)操作，提高外源基因的穩(wěn)定性和表達(dá)水平。在了解微生物油脂合成代謝的基礎(chǔ)上，通過(guò)導(dǎo)入脂質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵酶基因和強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠調(diào)控脂質(zhì)代謝，提高油脂產(chǎn)量。本發(fā)明的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌是應(yīng)用粘紅酵母工程菌株生產(chǎn)微生物油脂微生物油脂可以廣泛應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn)。生物柴油是以動(dòng)植物油脂為原料生產(chǎn)的柴油替代品，基本成分是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。來(lái)源麥麩、秸桿、玉米等有機(jī)農(nóng)作物。生物柴油燃料是一種高脂酸甲烷，它是通過(guò)以不飽和油酸C18為主要成分的甘油脂分解而獲得的。與常規(guī)柴油相比，生物柴油具有下述無(wú)法比擬的性能(I)具有優(yōu)良的環(huán)保特性(2)具有較好的低溫發(fā)動(dòng)機(jī)啟動(dòng)性能(3)具有較好的潤(rùn)滑性能(4)具有較好的安全性能(5)具有良好的燃料性能(6)具有可再生性能(7)無(wú)須改動(dòng)柴油機(jī)，可直接添加使用，同時(shí)無(wú)需另添設(shè)加油設(shè)備、儲(chǔ)存設(shè)備及人員的特殊技術(shù)訓(xùn)練(8)生物柴油以一定比例與石化柴油調(diào)和使用，可以降低油耗、提高動(dòng)力性，并降低尾氣污染另外，本發(fā)明的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌應(yīng)用粘紅酵母工程菌株生產(chǎn)功能性油脂，可制成相關(guān)保健品和藥品功能性油脂是一類對(duì)人體健康具有重要作用的脂質(zhì)，主要是一些多不飽和脂肪酸，目前多不飽和脂肪酸主要來(lái)源于動(dòng)植物油脂，因而產(chǎn)量不高，受到季節(jié)，原料和生長(zhǎng)周期等的影響較大。而微生物油脂因其生產(chǎn)和提取較為便捷，生產(chǎn)方便，成本低廉，克服了動(dòng)植物油脂來(lái)源單一和高昂的缺點(diǎn)。說(shuō)明書附I為粘紅酵母菌落圖(孟加拉紅平板)；圖2為粘紅酵母菌落圖(LB平板)；圖3為膠回收載體pPICZ-rD-ME雙酶切目的片段；圖中1、2、3為目的片段，經(jīng)測(cè)定，其大小為2. Ikb左右，與ME基因大小相吻合。可以確定該目的基因ME也成功插入載體；圖4為載體構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的說(shuō)明。實(shí)施例I本發(fā)明所用的微生物為粘紅酵母野生菌株，為本發(fā)明人從自然界篩選獲得，其具體的篩選方法為菌株初篩采用孟加拉紅培養(yǎng)基(蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂(MgSO4 *7H20)0. 5g,瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液IOOmL,蒸餾水IOOOmL,氯霉素0. Igo )，發(fā)酵培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基(1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖)，并通過(guò)蘇丹黑染色法 進(jìn)行產(chǎn)油量的初篩；通過(guò)熱酸-有機(jī)溶劑法進(jìn)一步定量確定候選菌株的產(chǎn)油量高低；兩輪篩選之后，獲得一株高產(chǎn)油脂菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)生理生化鑒定，初步判斷這是一株酵母菌；通過(guò)測(cè)定其26SrDNA D1/D2區(qū)域序列，進(jìn)一步確定該微生物為粘紅酵母。I)粘紅酵母生理生化特性在孟加拉紅培養(yǎng)基(圖I)上生長(zhǎng)，菌體形態(tài)為卵圓形，菌落凸起，邊緣整齊，菌落橙紅或微帶橘紅色，表面可由光滑到褶皺，有光澤，菌落正背面顏色一致。多邊芽殖，有明顯的紅色或黃色色素，因生莢膜而形成粘質(zhì)狀菌落，無(wú)酒精發(fā)酵能力，可產(chǎn)生脂肪。2)粘紅酵母培養(yǎng)條件將粘紅酵母保藏斜面移接到活化培養(yǎng)基(酵母粉1%，蛋白胨I0/?！咸烟?%，瓊脂2%，自然pH)上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基(酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，自然pH)的250mL三角瓶中，28°C振蕩(150rpm)培養(yǎng)24h，然后按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，PH6. 0)的250mL三角瓶中，于28°C振蕩(150rpm)發(fā)酵96h。發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體并測(cè)定生物量和脂質(zhì)含量。粘紅酵母生理生化特性在LB培養(yǎng)基(圖2)上生長(zhǎng)，菌體形態(tài)為卵圓形，直徑3飛mm，菌落凸起，邊緣整齊，菌落橘紅色或黃色，表面可由光滑帶有光澤，菌落正背面顏色一致。在LB平板上生長(zhǎng)的菌落相對(duì)于孟加拉紅平板上生長(zhǎng)的菌落要小。多邊芽殖，有明顯的紅色或黃色色素，因生莢膜而形成粘質(zhì)狀菌落，無(wú)酒精發(fā)酵能力，可產(chǎn)生脂肪。 發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體并測(cè)定生物量和脂質(zhì)含量測(cè)定生物量和脂質(zhì)含量
權(quán)利要求
1.一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌GM4 (Rhodotorula glutinis),其特征在于保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2012203。
2.一種如權(quán)利要求I所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子基因PGKl和卷枝毛霉的蘋果酸酶基因ME構(gòu)建成表達(dá)載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)，其基因工程菌構(gòu)建的具體步驟如下 A、目的基因的獲取 (1)采用珠磨與酚氯仿結(jié)合法提取粘紅酵母的總基因組DNA;將提取的總DNA純化后點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，此基因組模板分裝后于-20°C保存，并用于后序的PCR反應(yīng)；根據(jù)粘紅酵母基因組中rDNA的保守序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物擴(kuò)增26SrDNA D1/D2片段和.5.8SrDNA-ITS 片段； (2)以卷枝毛霉基因組為模板，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中蘋果酸酶同源保守的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，引物設(shè)計(jì)如下Frl 5’-AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3’Rrl 5’-CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3’ PCR擴(kuò)增得到大小為2. Ikb的ME基因片段，通過(guò)A-T克隆插入pMD-T質(zhì)粒載體，獲得PMD-ME，轉(zhuǎn)入E. coli DH5 a，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)XhoI和NotI消化轉(zhuǎn)入pPICZ-E,構(gòu)建 pPICZ-ME 載體； (3)強(qiáng)啟動(dòng)子PGKl的獲取及載體的構(gòu)建 提取釀酒酵母YS58基因組DNA，根據(jù)PGKl基因保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增啟動(dòng)子PGKl基因，引物設(shè)計(jì)如下Fr2 :5’-ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3’EcoRIRr2 :5’-TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3’BamHI 將PCR擴(kuò)增的PGKI基因純化后直接與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性的克隆再抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證； B、同源重組表達(dá)載體pPICZ-rD-ME的構(gòu)建 將ME基因酶切連接到質(zhì)粒pPICZ-rD上，構(gòu)建多順?lè)醋硬⑴c抗性基因Zeocin共用一個(gè)PGKl啟動(dòng)子和CYCl終止子；構(gòu)建的同源重組載體pPICZ-rD-ME轉(zhuǎn)化粘紅酵母菌，能整合到染色體上，便可同時(shí)表達(dá)ME基因和抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)擴(kuò)增26SrDNA D1/D2片段的一對(duì)引物為26SrDNA D1/D2 NL-I :5’-CGCGGATCCGTAGGTCGAAACAGAACA-3’26SrDNA D1/D2 NL-4 :5’-TGCTCTAGAGAAAGTAACATCCCAATG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)擴(kuò)增5. 8SrDNA-ITS片段的一對(duì)引物為. 5.8SrDNA-ITS(l):.5’-CTGCAGAACCAATGCATTGGTCCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’.5.8SrDNA-ITS(2):.5’-GAAGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的A中步驟(3)中在含有氨芐青霉素、x-Gal、IPTG的LB平板上篩選白色菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性的克隆。
6.一種粘紅酵母的培養(yǎng)方法，其特征在于其方法的具體步驟如下 .1)粘紅酵母篩選菌株初篩采用孟加拉紅培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)采用Yro培養(yǎng)基，并通過(guò)蘇丹黑染色法進(jìn)行產(chǎn)油量的初篩；通過(guò)熱酸-有機(jī)溶劑法進(jìn)一步定量確定候選菌株的產(chǎn)油量高低；兩輪篩選之后，獲得一株高產(chǎn)油脂菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)生理生化鑒定，初步判斷這是一株酵母菌；通過(guò)測(cè)定其26SrDNADl/D2區(qū)域序列，進(jìn)一步確定該微生物為粘紅酵母； .2)粘紅酵母培養(yǎng)條件將粘紅酵母保藏斜面移接到活化培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵96h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述粘紅酵母培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母粉 1%，蛋白胨 1%，葡萄糖 4%, KH2PO4O. 7%, Na2HPO4O. 25%,MgSO4. 7H200. 15%, CaCl2O. 015%,FeCl3. 6H200. 015%, ZnSO4. 7H200. 002%, MnSO4. H2OO. 006%, (NH4)2SO4O. 05%, pH6. 0。
8.—種如權(quán)利要求I所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產(chǎn)微生物油脂方面的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求I所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產(chǎn)功能性油脂方面的應(yīng)用。
10.一種如權(quán)利要求I所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在食品方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種粘紅酵母油脂基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，其基因工程菌的構(gòu)建方法主要利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子基因PGK1和卷毛枝霉的蘋果酸酶基因ME構(gòu)建成表達(dá)載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)，轉(zhuǎn)化株脂質(zhì)含量較野生菌株提高2.5倍。本發(fā)明在了解微生物油脂合成代謝的基礎(chǔ)上，通過(guò)導(dǎo)入脂質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵酶基因和強(qiáng)啟動(dòng)子，將為調(diào)控脂質(zhì)代謝，提高油脂產(chǎn)量。該基因工程菌株可應(yīng)用于微生物油脂的生產(chǎn)和功能性油脂相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，如藥品，保健品等。
文檔編號(hào)A23L1/30GK102796675SQ201210222018
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者孫晗笑, 王一楊, 李智, 孫晗蓄, 馮麗霞, 孫長(zhǎng)偉, 匡超, 周瑞秒 申請(qǐng)人:南陽(yáng)奇?zhèn)ノ⑸鷳B(tài)基因科技開發(fā)有限公司