一種分離純化哺乳動(dòng)物胰島的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型高效哺乳動(dòng)物胰島純化方法。其特征在于該純化方法是針對(duì)于胰島純化過程中由于嵌入式胰島（胰島表面圍繞的外分泌細(xì)胞超過其表面積一半時(shí)，該胰島稱之為嵌入式胰島）的存在干擾純化結(jié)果的問題而發(fā)明的。該純化方法是在進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心前，采用高低滲法去除包裹在胰島外的外分泌細(xì)胞及部分外分泌細(xì)胞團(tuán)。本發(fā)明的胰島純化方法不僅可以提高胰島的產(chǎn)量，降低嵌入率、提高純度，同時(shí)也提高了分離液的利用率，降低成本。
【專利說明】一種分離純化晡乳動(dòng)物胰島的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種新型高效哺乳動(dòng)物胰島純化方法，具體地說本發(fā)明是可以降低胰島嵌入率，提高胰島純度及產(chǎn)量的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，糖尿病在世界范圍內(nèi)大幅度的增加，而傳統(tǒng)的胰島素注射治療并不能避免并發(fā)癥的產(chǎn)生。由于胰島是胰腺的內(nèi)分泌單位，其具有重要的調(diào)節(jié)血糖的生理作用，因此科研人員期望通過胰島移植治療來減輕患者長(zhǎng)期注射胰島素的痛苦，并解決并發(fā)癥的產(chǎn)生。胰島移植是一種極具潛力的胰島素依賴型糖尿病的臨床治療方法，與胰腺移植相比胰島移植具有簡(jiǎn)單、安全、有效、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，因此其應(yīng)用前景更加廣泛。但是人源胰腺供體的短缺是制約胰島移植治療的主要問題，因此異種胰島移植是解決胰島來源的最佳方法[Moon-Kyu Lee.Cell transplantation for endocrine disorders, Advanced DrugDelivery Reviews,2000,42:103-120][Reinhard G.1slet celltransplantation today.Langenbecks Arch Surg，2007，392:239-253]。但是，患者的免疫排斥反應(yīng)制約著其在臨床的應(yīng)用。生物微膠囊技術(shù)則為最終解決免疫排斥問題提供了可能，微囊化胰島細(xì)胞移植可以實(shí)現(xiàn)全內(nèi)分泌替代治療，通過對(duì)血糖進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)和精細(xì)的調(diào)節(jié)，可使糖代謝恢復(fù)正常而不增加低血糖的發(fā)生率，從而防止或減緩心、腎、眼等病變的發(fā)展。同時(shí)對(duì)II型糖尿病患者來說，胰島細(xì)胞移植可以部分替代尚存在功能的胰島細(xì)胞發(fā)揮作用，有助于患者胰腺功能的修復(fù)及發(fā)揮正常的作用，使患者逐步擺脫對(duì)藥物或胰島素的依賴。因此如何獲得大量高活性的胰島是制約微囊化胰島治療進(jìn)入臨床的關(guān)鍵因素。由于哺乳動(dòng)物胰腺組織結(jié)構(gòu)在不同物種之間，甚至在同物種間，也存在著明顯的差別，所以增加了分離純化難度，此外在胰島的分離純化過程中， 也存在著諸多變量因素，使得胰島的產(chǎn)量高度不一。目前科研人員根據(jù)胰島密度及外分泌細(xì)胞密度，通常直接采用連續(xù)或不連續(xù)密度梯度離心法去除外分泌細(xì)胞，目的使其分離純化。純化方法大多采用Ficoll、Dextran或Biocoll液進(jìn)行4°C離心機(jī)梯度特異性地對(duì)胰島細(xì)胞進(jìn)行分離純化。但是由于胰島的密度為:~1.059g/ml，外分泌細(xì)胞的密度為:1.059~1.074g/ml，對(duì)于嵌入式胰島即被外分泌細(xì)胞包圍的胰島，它們的密度與外分泌細(xì)胞類似，所以僅用梯度離心的方法很難純化分離開，因此降低了胰島純度，影響胰島回收率，此外分離液價(jià)格昂貴，也增加了胰島獲取的成本。因此本發(fā)明考慮優(yōu)化胰島純化方案，達(dá)到提高胰島純度、降低嵌入率、提高分離液利用率和降低純化成本的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)上述問題，本發(fā)明提出了一種新型高效哺乳動(dòng)物胰島純化方法。本發(fā)明純化方法中采用了反復(fù)過篩處理，去除過大的組織塊及單細(xì)胞。采用高低滲法去除嵌入式胰島，由于嵌入式胰島的密度與外分泌組織類似，所以僅僅采用密度梯度離心法很難分離開，降低了胰島的純度，而本發(fā)明采用高低滲法，可去除嵌入式胰島外圍包裹的外分泌細(xì)胞，提高了胰島的純度及產(chǎn)量。經(jīng)過過篩及高低滲處理的胰島粗提物再進(jìn)行密度梯度離心后，可明顯提高分離液的利用率，降低了成本。
[0004]本發(fā)明新型高效哺乳動(dòng)物胰島純化方法的高低滲法原理如下圖1所示:
[0005]由于胰島表面含有轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的蛋白(如圖1-A)，即GLUT-2，而外分泌細(xì)胞不含有該蛋白，所以可以通過滲透壓的改變來去除外分泌細(xì)胞，在高糖高滲溶液下(如圖1-B)，胰島表面的GLUT-2可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的膨脹而達(dá)到平衡，而外分泌細(xì)胞無此功能，所以外分泌細(xì)胞通過水的外排作用，瞬時(shí)收縮，一段時(shí)間后，通過離子作用增加內(nèi)部的離子濃度來平衡外部葡萄糖濃度，所以大多數(shù)的外分泌細(xì)胞又恢復(fù)了體積(如圖ι-c)，當(dāng)將這些細(xì)胞處于低滲溶液中時(shí)，相反的過程發(fā)生，沒有GLUT-2的細(xì)胞膨脹而破裂，此過程僅會(huì)對(duì)外分泌細(xì)胞產(chǎn)生破壞的作用，對(duì)胰島無影響(如圖1-D)。
[0006]本發(fā)明采用了一種新型高效哺乳動(dòng)物胰島純化方法，該純化方法可以降低嵌入式胰島的嵌入率和提高胰島純度。該哺乳動(dòng)物胰島純化方法中包括采用過篩處理和高滲-低滲溶液處理，即在溫和的攪拌條件下去除嵌入式胰島外的外分泌細(xì)胞及部分外分泌細(xì)胞團(tuán)，最后進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心純化。
[0007]其中，哺乳動(dòng)物胰島的純化包括對(duì)人、猴、豬、狗、貓或嚙齒類等各種哺乳動(dòng)物的胰島的分離純化。
[0008]該純化方法包含過篩處理、高滲-低滲溶液處理、不連續(xù)密度梯度離心；
[0009]該純化方法的過篩處理為將得到的胰島粗提物過10-325目篩網(wǎng)。
[0010]該純化方法的高低滲處理的溶液配制含量為:高滲液配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Mediuml99等 培養(yǎng)基或生理鹽水、PBS、Hank's、HEPES, Tris、平衡鹽溶液為水相，其中含葡萄糖 100-1000mol/L、Na+0-600mmol/L、Cl 0-600mmol/L> Ca2+0-600mmol/L>HC03_10-600mmol/L, K+0-600mmol/L ;低滲液配方為配制方法是以 RPMI1640、MEM、DMEM、Mediuml99等培養(yǎng)基或生理鹽水、PBS、Hank's、HEPES、Tris、平衡鹽溶液為水相，其中含葡萄糖 0-300mmo 1/L、Na+0-300mmol/L、Cr0-300mmol/L、Ca2+0-300mmol/L、HCO^O-SOOmmol/L、K+0-300mmol/Lo
[0011]該純化方法中高滲溶液的攪拌時(shí)間為l_120min，在低滲溶液的攪拌時(shí)間為l_120mino
[0012]該純化方法的不連續(xù)密度梯度離心的分離液可釆用Dextran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分離液。
[0013]該新型高效哺乳動(dòng)物胰島純化方法的操作步驟如下:無菌條件下，
[0014](I)獲得新鮮哺乳動(dòng)物的胰腺組織，熱缺血時(shí)間〈10分鐘，
[0015](2)將步驟(1)的胰腺組織灌注膠原酶后，機(jī)械剪碎，膠原酶處理30-45分鐘，獲得胰島粗提物。其中，膠原酶為1、I1、II1、IV、V型中的一種或二種以上，酶的使用濃度即每種酶濃度在0-2mg/ml，溶液中總酶濃度在0.5_2mg/ml，該步驟在35-37 °C下完成。
[0016](3)將步驟(2)得到的胰島粗提物過10-325目篩網(wǎng)，得到胰島組織團(tuán)。
[0017](4)將步驟(3)得到的胰島組織團(tuán)采用高滲-低滲法處理，即先將胰島組織團(tuán)懸于100-1000mmo 1/L的高滲液中，0_25°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速為0-200rpm/mi n, l_120min后，換用低滲液重懸，0-25°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速為0-200rpm/min，l-120min，過10-325目篩網(wǎng)，去除部分外分泌細(xì)胞，得到胰島組織團(tuán)粗提物。
[0018]步驟(4)中高滲液配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Mediuml99等培養(yǎng)基或生理鹽水、PBS、Hank's、HEPES, Tris、平衡鹽溶液為水相，其中含葡萄糖100-1000mmol/L、Na+0-600mmol/L、Cl 0_600mmol/L、Ca2+0-600mmol/L> HCO3 1O-GOOmmol/!^ K+0-600mmol/L ；低滲液配方為配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Mediuml99等培養(yǎng)基或生理鹽水、PBS、Hank's、HEPES> Tris、平衡鹽溶液為水相，其中含葡萄糖 0_300mmol/L、Na+0-300mmol/L>Cr0-300mmol/L、Ca2+0-300mmol/L、HCO^O-SOOmmol/L、K+0-300mmol/L。
[0019](5)將步驟(4)得到的胰島組織團(tuán)與密度1.084g/ml Dextran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分離液混合，1:5_1:10的比例下混勻器混勻后，加入離心管底部，然后再依次加入 1.065、1.060、1.054、1.036g/ml 的 Dextran 或 Ficoll 或 percoll 或碘克沙醇分離液。0_25°C離心,0-800rpm, O-1Omin,在此基礎(chǔ)上提高轉(zhuǎn)速到1000-2500rpm,繼續(xù)離心l-60min。取分離出的每層細(xì)胞，用培養(yǎng)基離心清洗2_3次，其中1.084-1.065層即獲得分離純化好的胰島組織。
[0020]本發(fā)明是一種能在胰島純化過程中，降低嵌入式胰島含量，提高胰島純度，提高分離液利用率，并且可以有效地提高分離后胰島的活性。該純化方法是針對(duì)于胰島純化過程存在嵌入式胰島干擾純化結(jié)果的問題而發(fā)明的。
[0021]本發(fā)明的效果如下:
[0022]1.可避免嵌入式胰島的引入，使得密度梯度離心能明顯區(qū)分內(nèi)外分泌細(xì)胞，減輕下游工作的難度。
[0023]2.可降低嵌入式胰島的比例，提高分離液的利用率，降低成本。
[0024]3.可提高胰島的純度及活性，提高了胰島移植成功率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為高低滲法演示圖；
[0026]圖2 (a)粗分離得到的胰島；(b)經(jīng)過高-低滲處理的胰島粗提物；
[0027]圖3 Ca)純化優(yōu)化實(shí)驗(yàn)組；圖3 (b)對(duì)照組；
[0028]圖4純化優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后的胰島-DTZ染色。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1:
[0030]一種新型高效小鼠胰島純化方法的具體操作步驟:
[0031]配制試劑:用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制高、低滲液，使得葡萄糖終濃度分別為300mmol/和0mmol/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制Dextran分離液，設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:1.084,1.065,1.060,1.054,1.036g/ml。
[0032]摘取新鮮哺乳動(dòng)物的胰腺組織，使得熱缺血時(shí)間〈10分鐘，胰腺組織灌注膠原酶溶液后，機(jī)械剪碎，膠原酶處理30-45分鐘，獲得胰島粗提物。將胰島粗提物用4°C含10%血清的Hank's重懸后進(jìn)行過篩處理，先過20目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過325目篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集胰島粗提物進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于高滲液中，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速為50rpm/min,30min后,過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速50rpm/min, 15min。過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，離心清洗，棄上清。最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的Dextran液1:10的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加A 1.065、1.060、1.054、1.036g/ml 的 Dextran 液，4。。離心 5min, 900rpm ；20min, 2000rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基離心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，
純化結(jié)束。
[0033]對(duì)照組為:將由膠原酶灌注法分離提取的胰島粗提物用4°C含10%血清的Hank's重懸后，過20目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，直接進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心。細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的Dextran液1:10的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入 1.065、1.060、1.054、1.036g/ml 的 Dextran 液，4°C 離心 5min, 900rpm20min, 2000rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞，用培養(yǎng)基離心清洗2次，1000rpm/min 2min,去上清，純化結(jié)束。
[0034]檢測(cè)方法:
[0035]對(duì)采用或未采用高低滲處理的胰島進(jìn)行DTZ染色(如圖2)，可見嵌入式胰島外的外分泌細(xì)胞(如圖2-a)經(jīng)高低滲處理后可去除(如圖2-b)。通過檢測(cè)分離后胰島的純度和嵌入率(純度檢測(cè)方法::取三份200ul純化前后的樣品細(xì)胞顆粒，經(jīng)DTZ染色后，鏡下拍照，Image J記錄并分析被DTZ染色的胰島以及未染色的細(xì)胞團(tuán)數(shù)，胰島純度=DTZ染色的胰島/細(xì)胞團(tuán)總數(shù)X 100%;嵌入率檢測(cè)方法:取三份200ul純化前后的樣品細(xì)胞顆粒，經(jīng)DTZ染色后，鏡下拍照，Image J記錄并分析，胰島嵌入率=嵌入式胰島數(shù)/胰島總數(shù)X 100% )，發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度高達(dá)98% (如圖3)，嵌入率為O。通過檢測(cè)分離后胰島的活力和功能(活力檢測(cè)方法:臺(tái)酚藍(lán)細(xì)胞活死染色；功能檢測(cè)方法:豬胰島素快速檢測(cè)試劑盒)，發(fā)現(xiàn)該新型 純化方法得到的胰島與常規(guī)純化相比活力提高了 1.1倍，功能活性提高了 1.5倍。
[0036]實(shí)施例2:
[0037]—種新型高效大鼠胰島純化方法的具體操作步驟:
[0038]配制試劑:用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制高、低滲液，使得葡萄糖終濃度分別為350mmol/和Ommol/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制Ficoll分離液，設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。摘取新鮮哺乳動(dòng)物的胰腺組織，使得熱缺血時(shí)間〈10分鐘，胰腺組織灌注膠原酶溶液后，機(jī)械剪碎，膠原酶處理30-45分鐘，獲得胰島粗提物。將胰島粗提物用4°C含5%血清的PBS重懸后進(jìn)行過篩處理，先過18目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過270目篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集濾布上的細(xì)胞進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于高滲液中，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速為40rpm/min,8min后，過270目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，4°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速40rpm/min，15min。過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，離心清洗，棄上清。最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的Ficoll液1:9的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Ficoll液，4°C離心20min, 2000rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基離心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，純化結(jié)束。發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度高達(dá)100% (如圖4)，嵌入率為O。胰島活力提高了 1.3倍，功能活性提高了 1.6倍。
[0039]實(shí)施例3:
[0040]一種新型高效豬胰島純化方法的具體操作步驟:[0041]配制試劑:用Hank's鹽溶液配制高、低滲液,使得葡萄糖終濃度分別為600mmol/和Ommol/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制Ficoll分離液,設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。將灌注膠原酶法分離提取的胰島粗提物用4°C含10%血清的Hank's鹽溶液重懸后進(jìn)行過篩處理，先過10目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過325目濾布篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集濾布上的細(xì)胞進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于高滲液中，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速為20rpm/min,30min后,過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速20rpm/min,60min。過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，離心清洗，最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的Ficoll液1:8的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入 1.065、1.060、1.054、1.036g/ml 的 Ficoll 液，室溫離心 25min，2500rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞，用培養(yǎng)基離心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，純化結(jié)束。發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度為95%，嵌入率為O。胰島活力提高了 0.9倍，功能活性提高了 1.1倍。
[0042]實(shí)施例4:
[0043]一種新型高效豬胰島純化方法的具體操作步驟:
[0044]配制試劑:用HBSS鹽溶液配制高、低滲液，使得葡萄糖終濃度分別為200mmol/和Ommol/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制Dextran分離液,設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:
1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。將膠原酶灌注法分離提取的胰島粗提物用4°C含5%血清的HBSS鹽溶液重懸后進(jìn)行過篩處理，先過16目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過270目篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集濾布上的細(xì)胞進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于高滲液中，25°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速為35rpm/min, 15min后,過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，25°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速35rpm/min，75min。過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，離心清洗，棄上清。最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的Dextran液1:10的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入 1.065、1.060、1.054、1.036g/ml 的 Dextran 液，室溫離心 20min, 1500rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞，用培養(yǎng)基離心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，純化結(jié)束。發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度為96%，嵌入率為O。胰島活力提高了 1.2倍，功能活性提高了 1.3倍。
[0045]實(shí)施例5:
[0046]—種新型高效狗胰島純化方法的具體操作步驟:
[0047]配制試劑:用Mediuml99基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制高、低滲液，使得葡萄糖終濃度分別為65OmmoI/和Ommo 1/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制percoll分離液,設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。將膠原酶灌注法分離提取的胰島粗提物用4°C含10%血清的Hank's鹽溶液重懸后進(jìn)行過篩處理，先過14目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過270目篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集濾布上的細(xì)胞進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于高滲液中，25°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速為45rpm/min，35min后，過270目篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，25°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速45rpm/min，65min。過325目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，離心清洗，棄上清。最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的percoll分離液1:7的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的percoll分離液，4°C離心0-5min，800rpm ；5-20min, 2000rpmo取1.084-1.065層的細(xì)胞，用培養(yǎng)基離心清洗3次，1000rpm/min 2min,去上清,純化結(jié)束。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度高達(dá)95.5%，嵌入率為O。胰島活力提高了 I倍，功能活性提高了 1.5倍。[0048]實(shí)施例6:
[0049]一種新型高效人胰島純化方法的具體操作步驟:
[0050]配制試劑:用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制高、低滲液，使得葡萄糖終濃度分別為260mmol/和Ommol/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制Dextran分離液,設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。將采用膠原酶灌注法分離提取的胰島粗提物用4°C含10%血清的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行過篩處理，先過10目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過325目濾布篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集濾布上的細(xì)胞進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于高滲液中，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速為55rpm/min, IOmin后，過230目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，4°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速55rpm/min, IOmin0過230目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞,離心清洗,棄上清。最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的Dextran液1:8的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Dextran液,4°C離心6min, 500rpm ；20min, 2000rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞,用培養(yǎng)基離心清洗2次,1000rpm/min 2min,去上清,純化結(jié)束。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度高達(dá)96.5%，嵌入率為O。胰島活力提高了 I倍，功能活性提高了 1.3倍。
[0051]實(shí)施例7:
[0052]一種新型高效人胰島純化方法的具體操作步驟:
[0053]配制試劑:用MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制高、低滲液，使得葡萄糖終濃度分別為450mmo1/L和Ommo 1/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制Ficoll分離液,設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。將膠原酶灌注法分離提取的胰島粗提物用4°C含5%血清的MEM重懸后進(jìn)行過篩處理，先過18目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過270目濾布篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集濾布上的細(xì)胞進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于450mmol/L高滲液中，25°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速為60rpm/min, IOmin后，過230目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，25°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速60rpm/min,60min。過230目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，離心清洗，棄上清。最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的Ficoll液1:10的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入1.065,1.060,1.054,1.036g/ml的Ficoll液，4°C離心15min, 2500rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞，用培養(yǎng)基離心清洗3次，1000rpm/min 2min,去上清，純化結(jié)束。發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度高達(dá)99%，嵌入率為O。胰島活力提高了 1.4倍，功能活性提高了 1.6倍。
[0054]實(shí)施例8:
[0055]一種新型高效貓胰島純化方法的具體操作步驟:
[0056]配制試劑:用PBS溶液配制高、低滲液，使得葡萄糖終濃度分別為550mmol/L和0mmol/L,攪拌均勻后0.22um無菌過濾備用。配制碘克沙醇分離液，設(shè)定不連續(xù)密度梯度為:1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。將灌注膠原酶法分離提取的胰島粗提物用4°C含5%血清的PBS溶液重懸后進(jìn)行過篩處理，先過12目不銹鋼篩網(wǎng)，去除大的組織塊，收集濾過物，再過230目篩網(wǎng)，去除單細(xì)胞，收集濾布上的細(xì)胞進(jìn)行高低滲法處理，先將胰島粗提物懸于高滲液中，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速為65rpm/min, 35min后，過230目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，換用低滲液重懸，4°C無菌攪拌,轉(zhuǎn)速65rpm/min, 15min。過270目濾布篩網(wǎng)，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞，離心清洗，棄上清。最后采用不連續(xù)密度梯度離心，將高低滲處理后的細(xì)胞顆粒與密度為1.084g/ml的碘克沙醇分離液1:6的比例混勻器下混勻，加入離心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、L 036g/ml的碘克沙醇分離液，25°C離心15min，2500rpm。取1.084-1.065層的細(xì)胞,用培養(yǎng)基離心清洗2次，1000rpm/min 2min,去上清,純化結(jié)束。發(fā)現(xiàn)采用該改良后的純化方法后胰島的純度高達(dá)95%，嵌入率為O。胰島活力提高了 0.9倍，功能活性提高了 1.2倍 。
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化哺乳動(dòng)物胰島的方法，其特征在于:將哺乳動(dòng)物的胰腺組織采用膠原酶法分離得到胰島粗提物，過篩后，高滲-低滲法處理去除部分外分泌細(xì)胞，最后再進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心，獲得胰島，純度高達(dá)95%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的制備方法，其特征在于:整個(gè)制備過程均在無菌條件下進(jìn)行，具體操作過程如下， (O獲得新鮮哺乳動(dòng)物的胰腺組織，熱缺血時(shí)間〈10分鐘； (2)將步驟(1)的胰腺組織灌注膠原酶溶液后，機(jī)械剪碎，膠原酶處理30-45分鐘，獲得膜島粗提物； 其中，膠原酶為1、I1、II1、IV、V型中的一種或二種以上，酶的使用濃度即每種酶濃度在0-2mg/ml，溶液中總酶濃度0.5_2mg/ml，該步驟在35-37 °C下完成； (3)將步驟(2)得到的胰島粗提物過10-325目篩網(wǎng)，得到通過篩網(wǎng)的胰島組織團(tuán)粗提物； (4)將步驟(3)得到的胰島組織團(tuán)采用高低滲法處理，即先將胰島組織團(tuán)懸于100-1000mmol/L的高滲液中，0-25°C無菌攬拌，轉(zhuǎn)速為0-200rpm/min, l_120min后，過濾或離心，再將胰島組織團(tuán)粗提物換用低滲液重懸，0-25°C無菌攪拌，轉(zhuǎn)速為0-200rpm/min，l-120min，過10-325目篩網(wǎng)，去除部分外分泌細(xì)胞，得到通過篩網(wǎng)的胰島組織團(tuán)粗提物； 步驟(4)中高滲液配制方法是以RPMI1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Mediuml99培養(yǎng)基、或生理鹽水、PBS緩沖液、Hank's緩沖液、HEPES緩沖液、Tris緩沖液中的一種或二種以上為液相基質(zhì)，其中加入葡萄糖，使葡萄糖于液相基質(zhì)中的終濃度lOO-lOOOmmol/L，并調(diào)整液相基質(zhì)中的以下幾種離子的終濃度為:Na+0-600mmol/L、Cr0-600mmol/L、Ca2+O-6OOmmoI/L> H`CO3 1O-BOOninioI /I,、K+Q-600mnio1 /T,； 低滲液配方為配制方法以RPMI1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Med iuml99培養(yǎng)基、或生理鹽水、PBS緩沖液、Hank's緩沖液、HEPES緩沖液、Tris緩沖液中的一種或二種以上為液相基質(zhì)，其中加入或不加葡萄糖，使葡萄糖于液相基質(zhì)中的終濃度0-300mmol/L,并調(diào)整液相基質(zhì)中的以下幾種離子的終濃度為:Na+0-300mmol/L、Cr0-300mmol/L、Ca2+0-300mmol/L、HCO^O-SOOmmol/L、K+0-300mmol/L ； (5)將步驟(4)得到的胰島組織團(tuán)粗提物與密度1.084g/mlDextran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分離液混合，按粗提物與分離液1:5_1:10的體積比例下于混勻器中混勻后，加入離心管底部，然后再向離心管中依次加入與1.084g/ml分離液等體積的密度為1.065g/ml、1.060g/ml、1.054g/ml、1.036g/ml 的 Dext ran 或 Ficoll 或 percoll 或碘克沙醇分離液；0-25°C離心，0-800rpm，0-10min，在此基礎(chǔ)上提高轉(zhuǎn)速到1000_2500rpm，繼續(xù)離心l-60min ;胰島組織細(xì)胞于離心管中分層，取分離出的每層細(xì)胞，用上述液相基質(zhì)離心清洗2-3次，其中位于密度1.084g/ml與1.065g/ml間細(xì)胞層，即為所要獲取的分離純化好的胰島。
3.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于:灌注膠原酶的用量與胰腺組織重量的關(guān)系為0.5-5ml/g ;胰島組織粗提物與與高滲液或低滲液的體積比為1:1-1:50。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的制備方法，其特征在于:所述哺乳動(dòng)物的胰腺組織為人、猴、豬、狗、貓或嚙齒類等各種哺乳動(dòng)物的胰腺組織。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103509750SQ201210222446
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】馬小軍, 李娜, 張英, 于煒婷, 陳立, 李珅, 郭昕, 王雨 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所