專利名稱：產(chǎn)低溫乳糖酶的拉恩氏菌篩選及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從新疆天山凍土中分離得到的拉恩氏菌R3 (Rahnella sp. R3);本發(fā)明涉及該拉恩氏菌R3 (Rahnella sp. R3)的篩選及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
乳糖酶(β-D-半乳糖苷水解酶，EC3. 2. I. 23)，可來源于植物、動物和微生物，能夠催化乳糖中β_半乳糖苷鍵水解為葡萄糖和半乳糖。乳糖是牛乳中最主要的碳水化合物，含量約為4. 5% 5.0%。某些人群不能吸收利用乳糖，會引發(fā)乳糖不耐癥。目前，解決乳糖不耐癥的最佳方法是用乳糖酶水解乳糖來生產(chǎn)低乳糖或者無乳糖乳制品?，F(xiàn)在商業(yè)化的乳糖酶大多是常溫型的，酶的最適反應(yīng)溫度是37°C或者更高，在低溫下催化活性很低。由于乳品加工大部分操作都是在低溫(4°C左右)進行，因此在乳品加工采用常溫型或耐熱型乳糖酶水解乳糖并不合適，而低溫乳糖酶在低溫有較高活性，能在低溫下有效水解牛乳中 的乳糖，因此具有很好的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)外報道分離篩選的產(chǎn)低溫乳糖酶菌株主要來自于極地和深海，多數(shù)為細菌，少數(shù)為酵母。天山凍土屬我國高海拔高山常年凍土類型，在這種凍土環(huán)境中微生物產(chǎn)生了一系列適應(yīng)低溫、寡營養(yǎng)、強輻射、凍融等極端因子的分子機制，為凍土微生物生理生化多樣性提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選產(chǎn)低溫乳糖酶且酶活較高的菌株，經(jīng)鑒定，分類命名為拉恩氏菌R3 (Rahnella sp. R3)，于2012年6月26日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址中國.武漢.武漢大學(xué)，，保藏編號CCTCC NO M 2012250，采用單因素實驗及正交實驗的方法進行該菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化，獲得最優(yōu)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。I.篩選方法(I)初篩吸取富集后的培養(yǎng)液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15°C培養(yǎng)，篩選藍色菌落，分離純化，斜面保存。(2)復(fù)篩選取上限溫度為40°C，即在該溫度不生長的菌株為低溫菌，選取此菌為試驗菌株?；罨泵姹２卦囼灳?，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基于15°C進行搖瓶培養(yǎng)(50mL/250mL)48h。提取粗酶液，測定15°C下水解活力，選取活性較高菌R3為試驗菌株。2.發(fā)酵條件優(yōu)化(I)培養(yǎng)基組成對菌體產(chǎn)酶的影響選取蛋白胨、酵母浸膏、乳糖、氯化鈉4個因子，采用4因素3水平的正交表L16(34)設(shè)計實驗，考察不同培養(yǎng)基對菌體產(chǎn)酶的影響。根據(jù)極差分析(見表I)，產(chǎn)酶影響因子排序為乳糖>蛋白胨>氯化鈉>酵母膏，最優(yōu)組合為A3B3C3Dp按照最優(yōu)組合的培養(yǎng)基進行實驗，測得發(fā)酵液酶活為5. 84U/mL，高于表中的任一值。
表I發(fā)酵培養(yǎng)基組成正交試驗設(shè)計與結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)低溫乳糖酶的拉恩氏菌篩選方法，包括以下步驟 (1)初篩吸取富集后的培養(yǎng)液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15°C培養(yǎng)，篩選藍色菌落，分離純化，斜面保存。
(2)復(fù)篩選取上限溫度為40°C不生長的菌株為試驗菌株?；罨泵姹２卦囼灳?，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基于15°C進行搖瓶培養(yǎng)(50mL/250mL)48h。提取粗酶液，測定15°C下水解活力，選取高酶活菌株Rahnella sp. R3為產(chǎn)低溫乳糖酶的菌株。
2.一種利用產(chǎn)低溫乳糖酶的拉恩氏菌制備產(chǎn)酶發(fā)酵液的方法，其特征在于 (1)采用入權(quán)利I所述的產(chǎn)低溫乳糖酶的Rahnellasp. R3為生產(chǎn)菌株； (2)設(shè)定最佳發(fā)酵工藝乳糖5%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化鈉0.3%，裝液量為250mL三角瓶裝50mL，培養(yǎng)基初始pH7. O ±O. 2 ;接種量4%，15°C，200r. mirT1發(fā)酵32h。
3.權(quán)利要求I所述的拉恩氏菌R3(Rahnella sp. R3)菌株具有以下特征 (1)生長特征菌株最適生長溫度為15°C;最適生長pH為7 (2)菌體特征革蘭氏陰性，短桿菌，長度I.5μπι 2μπι，有莢膜，無芽孢。
(3)菌落特征菌落呈黃色，圓形隆起，質(zhì)地粘稠，邊緣光滑，不透明，易挑取。
(4)生理生化特征發(fā)酵D-葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，明膠水解試驗顯陰性，賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶及精氨酸雙水解酶都呈陰性，硝酸鹽還原、MR(甲基紅)、VP(伏-普二氏試驗)呈陽性。可發(fā)酵乳糖、麥芽糖、蔗糖、L-鼠李糖、棉籽糖、纖維素糖。
全文摘要
本發(fā)明是一種拉恩氏菌R3(Rahnella sp.R3)篩選及培養(yǎng)方法，采用細菌富集培養(yǎng)基(1/4TSB)及以乳糖為底物、X-Gal為顯色劑瓊脂鑒定平板初篩與發(fā)酵酶活測定復(fù)篩的方法獲得高產(chǎn)低溫乳糖酶菌株Rahnella sp.R3。采用單因素實驗與正交實驗分析獲得最佳發(fā)酵產(chǎn)酶配方與發(fā)酵條件，最終搖瓶發(fā)酵水平可達5.92U/mL。
文檔編號C12N9/38GK102965287SQ20121022873
公開日2013年3月13日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者楊瑞金, 沈蓮蓮, 華霄 申請人:江南大學(xué)