一種來源于莫哈維芽孢桿菌的低溫耐有機(jī)溶劑脂肪酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種來源于莫哈維芽孢桿菌（Bacillus?mojavensis?WBRD1.10062302，CGMCC4961）的脂肪酶，該脂肪酶對甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亞砜、正己烷等多種有機(jī)溶劑有較好的耐受性。因而該脂肪酶將具有生物柴油、醫(yī)藥工業(yè)、食品、油脂化工、環(huán)境保護(hù)、洗滌劑、紡織、造紙等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種來源于莫哈維芽孢桿菌的低溫耐有機(jī)溶劑脂肪酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來源于莫哈維芽孢桿菌的低溫耐有機(jī)溶劑脂肪酶。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一類特殊的酯鍵水解酶，廣泛存在于動物組織、植物和微生物體中。脂肪酶具有催化疏水性的油脂變成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在無機(jī)溶劑中保持高催化活力和極強(qiáng)穩(wěn)定性，以及脂肪酶對底物的廣譜性/特殊專一性，賦予了脂肪酶在食品油脂加工、洗滌劑、生物柴油、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等工業(yè)的巨大應(yīng)用價(jià)值(CN201010599106)。
[0003]在食品油脂加工及油脂化工行業(yè)可以利用脂肪酶制取脂肪酸和甘油、進(jìn)行油脂改性、制備特種油脂、提高中性油得率和制備單甘酯等。該行業(yè)對于脂肪酶在溫度、催化活性、底物選擇性以及有機(jī)溶劑耐受性等多個(gè)方面特性的需求多種多樣。
[0004]在洗滌劑中加入脂肪酶具有提高去污能力、降低表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量、減少環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。洗滌劑行業(yè)對脂肪酶特性的需求包括在洗滌體系中的良好的脂肪酶活性及穩(wěn)定性，其最適PH和pH穩(wěn)定區(qū)間均在堿性范圍內(nèi)。另外因?yàn)樵趤喼薜闹袊?、日本都是常溫或低溫洗滌，因此開發(fā)合適洗滌用的低溫脂肪酶則成為當(dāng)前洗滌劑用脂肪酶研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0005]在生物柴油工業(yè)中，酶法生產(chǎn)生物柴油是生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向。該方法的主要瓶頸之一是脂肪酶的熱穩(wěn)定性和對甲醇等短鏈有機(jī)醇的耐受性(李宇揚(yáng)，孫佩慧，胡基埂等.中國生物工程雜志，2008，28 (10): 136-140)。另外低溫脂肪酶的應(yīng)用可以大大降低生物柴油反應(yīng)所需的熱能，在節(jié)能、環(huán)保、安全等方面都可進(jìn)一步得到改善。如CN200810033414所述，用于全細(xì)胞`催化生產(chǎn)柴油的基因工程菌由于最適催化溫度低而降低了反應(yīng)所需的熱能，有利于節(jié)約能源，因此低溫脂肪酶的應(yīng)用將使得生物柴油的生產(chǎn)更加f倉泛。
[0006]在醫(yī)藥工業(yè)上，可以用脂肪酶來催化有機(jī)合成反應(yīng)，如合成手性胺、硫氮酮等(Jaeger K.E., Reetz Μ.T.Trends in Biotechnology.1998，16:396 - 403),如此就要求月旨肪酶具有較強(qiáng)的有機(jī)溶劑耐受性、較強(qiáng)的催化活性等。
[0007]綜上所述，脂肪酶可以應(yīng)用于食品加工、油脂化工、醫(yī)藥加工、洗滌劑及生物柴油等多個(gè)行業(yè)。其中低溫脂肪酶因?yàn)槠涞蜏卮呋钚远纱蟠蠼档头磻?yīng)能耗。隨著世界能源緊缺，石油價(jià)格上漲，節(jié)能降耗成為世界范圍內(nèi)亟待解決的熱點(diǎn)問題。低溫脂肪酶的研究因此在國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注。發(fā)現(xiàn)了許多低溫脂肪酶，如Acinetobacter sp.、Bacillus sphaericus、Pseudomonas sp.、Serratia marcescens 等細(xì)菌可產(chǎn)低溫月旨肪酶，Trichosporon pullulans、Mortella sp.> Yarrowia lipolytica、Yersinia sp.等真菌產(chǎn)低溫脂肪酶)。但是這些低溫脂肪酶大都熱穩(wěn)定性能較差，這也是其商業(yè)化的瓶頸之一(BJoseph, Pff Ramteke, G Thomas.Biotechnol Adv, 2008，26:457-470)。[0008]與水相催化相比，酶在有機(jī)相中的催化反應(yīng)有許多優(yōu)點(diǎn)，例如，增加反應(yīng)物的溶解度、分離簡單、改變酶的選擇性等，所以某些耐有機(jī)溶劑脂肪酶也被廣泛地應(yīng)用于食品、制藥、精細(xì)化工、有機(jī)合成等領(lǐng)域。但脂肪酶在有機(jī)溶劑中容易變性或酶活力下降，雖然國內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)研究了不同方法來增加酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，但還是無法滿足工業(yè)化的需求。因此尋找天然耐有機(jī)溶劑的脂肪酶，使其在有機(jī)溶劑或含有有機(jī)溶劑的環(huán)境中具有較高的催化活性，已成為脂肪酶研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。
[0009]據(jù)報(bào)道，已經(jīng)成功分離純化了 70多種芽孢桿菌屬的脂肪酶(M Guncheva, DZhiryakova.J Mol catal B:Enzym, 2011，68:1-21),其中具備低溫、中溫條件下穩(wěn)定性好或耐有機(jī)溶劑的芽孢桿菌來源脂肪酶的文獻(xiàn)和專利也不少，但是，幾乎沒有同時(shí)兼具這三種特性的芽孢桿菌脂肪酶的報(bào)道。因此，急需一種兼具這三種特性的芽孢桿菌脂肪酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供一種脂肪酶及其編碼基因，該脂肪酶具有低溫脂肪酶活性、寬廣的pH穩(wěn)定性、0-50°C條件下高穩(wěn)定性以及對多種有機(jī)溶劑良好的耐受性等特點(diǎn)，因而該脂肪酶在生物柴油、醫(yī)藥工業(yè)、食品加工、油脂化工、環(huán)境保護(hù)、洗滌劑、紡織、造紙等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0011]本發(fā)明的脂肪酶含有以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列組成:
[0012](I)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID NO:2第29 — 210位所示的氨基酸序列；或
[0014](3 )在(I)或(2 )的氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有脂肪酶活性的由(I)或(2)衍生的脂肪酶。
[0015]本發(fā)明還包括編碼本文所述脂肪酶的核酸。
[0016]優(yōu)選的，本發(fā)明的核酸也可以是含有以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成的核酸:
[0017](I) SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0018](2)在嚴(yán)格條件下與(I)所限定的核苷酸序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0019]本發(fā)明還包括含有本發(fā)明編碼序列的載體(優(yōu)選是表達(dá)載體)以及含有所述載體的轉(zhuǎn)化重組細(xì)胞(例如大腸桿菌)等。
[0020]在一具體實(shí)施例中,本發(fā)明的脂肪酶來自莫哈韋芽孢桿菌(Bacillus mojavensisWBRD1.10062302，CGMCC4961)。
[0021]Lip2-2的最適作用溫度為35°C，在0_50°C溫浴Ih酶活保持穩(wěn)定；最適作用pH為
8.5，pH穩(wěn)定范圍為pH4-l I，且在pH3.0的環(huán)境下24h后仍能保存超過60%的酶活力；該脂肪酶對甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、異辛烷、二甲基亞砜、正己烷、苯、甲苯等多種有機(jī)溶劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受特性等。因此本發(fā)明所提供的脂肪酶Lip2-2具有低溫脂肪酶特性且在0-50°C條件下保持穩(wěn)定，具有更為寬廣的PH穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性。具有如此特性的新穎脂肪酶無疑將在食品加工、油脂化工、生物柴油、有機(jī)合成、洗滌劑、環(huán)境修復(fù)等多個(gè)行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，在洗滌行業(yè)，低溫、弱堿性環(huán)境下，油性污垢難以去除，本發(fā)明所述脂肪酶具備低溫、耐熱性良好、堿性作用環(huán)境等優(yōu)良特性，適合于在低溫洗滌領(lǐng)域的應(yīng)用；在污水處理和環(huán)境修復(fù)方面，作為低溫酶，本發(fā)明脂肪酶可用于寒冷環(huán)境下的污水處理和環(huán)境修復(fù)，另一方面，由于對多種有機(jī)溶劑表現(xiàn)耐受，該酶可對苯、甲苯、丙酮等有機(jī)溶劑污染區(qū)域進(jìn)行處理；在生物柴油工業(yè)中，脂肪酶的應(yīng)用瓶頸是其熱穩(wěn)定性和對甲醇等短鏈有機(jī)醇的耐受性，本發(fā)明脂肪酶在上述兩方面表現(xiàn)優(yōu)良特性，因此適合生物柴油領(lǐng)域的應(yīng)用，加之，本發(fā)明脂肪酶的低溫作用特性可以降低生物柴油反應(yīng)所需的熱能，在節(jié)能、環(huán)保、安全等方面都可進(jìn)一步得到改善。
[0022]因此，本發(fā)明也提供一種組合物，所述組合物含有本發(fā)明的脂肪酶。該組合物可以是洗滌組合物，用于洗滌油性污垢，例如在低溫、弱堿性環(huán)境下進(jìn)行洗滌。洗滌組合物還可含有適于洗滌用的其它各種已知成分，例如其它的洗滌劑、溶劑等。本發(fā)明的組合物也可以是用于處理污水的組合物。例如，可用于處理廢紙脫墨過程中所產(chǎn)生的廢水等。該組合物還可用于對有機(jī)溶劑(例如苯、甲苯、丙酮等)污染區(qū)域進(jìn)行處理。本發(fā)明的組合物也可是用于制備生物柴油。
[0023]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物是在適于本發(fā)明細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的脂肪酶的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞而獲得的包含所述脂肪酶的發(fā)酵液。
[0024]本發(fā)明也包括本發(fā)明脂肪酶、多核苷酸、細(xì)胞和組合物等在食品加工、油脂化工、生物柴油、有機(jī)合成、洗滌劑、環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。
[0025]尤其是，本發(fā)明包括本發(fā)明的脂肪酶、多核苷酸、細(xì)胞和組合物在處理污染或制備生物柴油中的用途。
[0026]本文中，污染包括但不限于油性污垢、污水、或是有機(jī)溶劑如苯、甲苯、丙酮等造成的污染。
[0027]本發(fā)明提供一種 處理污染的方法，所述方法包括使本發(fā)明的脂肪酶或組合物與污垢接觸，從而溶解污垢而除去 污垢。
[0028]在優(yōu)選的實(shí)施例中，在適于細(xì)胞表達(dá)所述脂肪酶的條件下培養(yǎng)前述細(xì)胞，從而獲得包含所述脂肪酶的發(fā)酵液，將所述發(fā)酵液用于洗滌油性污垢、處理污水或污染、或用于制備生物柴油。
[0029]本發(fā)明也包括脂肪酶的制備方法，所述方法包括在適于細(xì)胞表達(dá)所述脂肪酶的條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的細(xì)胞，從而表達(dá)所述脂肪酶。本發(fā)明的制備方法還包括純化所述脂肪酶的步驟。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1:Lip2-2的SDS-PAGE圖，其中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，I顯示0.1445U的Lip2-2, 2 顯示 0.289U 的 Lip2_2。
[0031]圖2:Lip2-2的反應(yīng)溫度和酶活力關(guān)系曲線。
[0032]圖3:Lip2_2的溫度穩(wěn)定性曲線。
[0033]圖4:Lip2-2的反應(yīng)pH和酶活力關(guān)系曲線。
[0034]圖5:Lip2-2的pH穩(wěn)定性曲線。
[0035]圖6:Lip2_2水解三油精反應(yīng)的底物及產(chǎn)物的薄層色譜圖(TLC圖)，其中，I顯示無添加酶(空白對照)，2顯示Rhizomucor miehei脂肪酶(RML)，3顯示RML，4顯示Lip2_2，5顯示 Lip2_2。[0036]圖7:Lip2-2對不同碳鏈長度脂肪酸酯鍵的作用。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明涉及低溫耐有機(jī)溶劑脂肪酶及其編碼序列。
[0038]本發(fā)明的脂肪酶來自莫哈韋芽孢桿菌(Bacillus mojavensis WBRDl.10062302，CGMCC4961)，具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、寬廣范圍pH的穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性。
[0039]在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的脂肪酶如SEQ ID NO:2所示，其為莫哈韋芽孢桿菌脂肪酶Lip2-2的包含信號肽的完整氨基酸序列，其中1-28位氨基酸為信號肽區(qū)域。[0040]本發(fā)明包括SEQ ID NO: 2的變異形式，包括但并不限于:一個(gè)或多個(gè)(通常為1_10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。這些變異形式仍然具有本發(fā)明脂肪酶的活性。優(yōu)選是保守性變異形式。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行保守性取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能?！靶阅芟嘟蛳嗨频陌被帷卑ɡ?，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在本發(fā)明脂肪酶中用來自同一側(cè)鏈類的另一氨基酸殘基替換一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)，將不會在實(shí)質(zhì)上影響其活性。
[0041]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢必在所表達(dá)的蛋白末端引入了一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、獲得自動分泌到宿主細(xì)胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白Α、如6His或Flag的標(biāo)簽，或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)。應(yīng)理解，這些氨基酸序列的存在不會影響到所得脂肪酶的活性。因此，本發(fā)明也包括在本發(fā)明脂肪酶的C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸所得的脂肪酶，這些脂肪酶仍具有本文所屬的熱穩(wěn)定性、寬廣范圍的PH穩(wěn)定性以及有機(jī)溶劑耐性。例如本發(fā)明的脂肪酶可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基或6His。
[0042]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明脂肪酶包括與SEQ ID NO:2的序列相同性為至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%的氨基酸序列。
[0043]本文所用術(shù)語“序列相同性”或“相同性”指比對兩條序列以最大程度提高亞基匹配，即考慮缺口和插入時(shí)，兩條序列中相應(yīng)位置上相同亞基的百分?jǐn)?shù)。兩條序列中的亞基位置被同一核苷酸或氨基酸占據(jù)時(shí)存在序列相同性，例如，若兩個(gè)DNA分子的某個(gè)給定位置都被腺嘌呤占據(jù)，則這兩個(gè)分子在該位置上相同。例如，若在長度為10個(gè)氨基酸的序列中有7個(gè)位置與長度為10個(gè)氨基酸的第二序列的相應(yīng)位置相同，則這兩個(gè)序列具有70%序列相同性。通常采用序列分析軟件(例如，位于威斯康星州麥迪遜53705大學(xué)大道1710號的威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心的遺傳計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group, University ofWisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, ffis.53705)的序列分析軟件包)，測定序列相同性。
[0044]根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的脂肪酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
[0045]本發(fā)明還包括SEQ ID NO:2的活性片段。SEQ ID NO:2的活性片段通常含有SEQID NO:2的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約150個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明也包括含有SEQ ID NO:2的活性片段、且保留SEQ ID NO:2的脂肪酶活性的多肽序列。
[0046]本發(fā)明的脂肪酶可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。
[0047]本申請包括本發(fā)明脂肪酶的編碼序列，SEQ ID NO:1顯示了本發(fā)明脂肪酶的編碼序列之一。所述“編碼序列”包括編碼本發(fā)明所述脂肪酶的核酸序列，與SEQ ID N0:1高度同源的序列或在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1雜交的核苷酸序列或與上述分子高度同源的家族基因分子。提到核苷酸序列時(shí)，本文所用的“高度同源”可以指與所提及序列的相同性為至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%的核苷酸序列。編碼本發(fā)明脂肪酶的序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有差別的核苷酸序列。
[0048]編碼本發(fā)明脂肪酶的序列包括:只編碼成熟脂肪酶的編碼序列；成熟脂肪酶的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟脂肪酶蛋白的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
[0049]本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的脂肪酶的片段、類似物、衍生物和變異形式。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的蛋白的功能。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼本發(fā)明脂肪酶的多核苷酸。
[0050]本發(fā)明的脂肪酶的編碼序列可選自:(i)SEQ ID NO:1 ;和(ii)與⑴對應(yīng)的RNA序列在嚴(yán)格條件下與⑴或(ii)限定的序列雜交的分子。
[0051]如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指:(I)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2 X SSC,0.1%SDS, 60 °C ;或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補(bǔ)序列，或者可以是與(a)中所限定序列的互補(bǔ)性為至少50%、優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上的序列。
[0052]本發(fā)明的脂肪酶的編碼序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0053]本發(fā)明采用對硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)法來測定脂肪酶的活力大小，該方法以對硝基苯棕櫚酸酯為反應(yīng)底物，通過脂肪酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物對硝基苯酚(p-NP)，該產(chǎn)物在405-410nm波長下具有強(qiáng)烈吸收。酶活力單位定義為:I個(gè)單位即指在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘催化釋放Iymol的p-NP所需的酶量。該方法是國內(nèi)外測定脂肪酶活力的常用方法，操作簡便，反應(yīng)快且靈敏度高，是一種精確而高效的活力測定方法。
[0054]下文將以具體實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。應(yīng)理解，本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施方式。實(shí)施例中所采用的反應(yīng)試劑、條件等，除非另有說明，否則為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑、條件等。[0055]實(shí)施例1:脂肪酶基因的克隆
[0056]1.保守序列的獲取
[0057]根據(jù)脂肪酶基因的保守區(qū)域Oxyanion hole和Activity center的保守序列P (V/I)V(M/L) (V/L)HG和AHS(M/Q)GG，設(shè)計(jì)的兼并引物見表1:
[0058]表1引物信息
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽含有選自以下的氨基酸序列: (1)SEQID NO:2所示的氨基酸序列；或 (2)SEQ ID NO:2第29 — 210位所示的氨基酸序列；或 (3 )在(I)或(2 )的氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有SEQ ID NO:2的脂肪酶活性的由(I)或(2)衍生的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，所述多肽由所述(I)一(3)中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列組成。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其特征在于，所述多肽在(I)一(3)中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列的任一端還含有標(biāo)簽序列。
4.一種多核苷酸,選自: (1)編碼權(quán)利要求1一 3中任一項(xiàng)所述的分離的多肽的多核苷酸；和 (2)與(I)所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有: (1)SEQID ΝΟ:1所示的核苷酸序列；或 (2)在嚴(yán)格條件下與(I)所限定的核苷酸序列雜交且編碼具有SEQID NO:2的脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列。
6.一種含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
7.一種含權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體的細(xì)胞，優(yōu)選的，所述細(xì)胞為重組表達(dá)細(xì)胞。
8.一種制備權(quán)利要求7所述的細(xì)胞的方法，其特征在于，將權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
9.權(quán)利要求1所述脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述方法包括在適于細(xì)胞表達(dá)所述脂肪酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，從而表達(dá)所述脂肪酶。
10.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1 一 3中任一項(xiàng)所述的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述組合物是在適于細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求I 一 3中任一項(xiàng)所述的多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞而獲得的包含所述多肽的發(fā)酵液。
12.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述組合物是洗滌劑。
13.權(quán)利要求1一 3中任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸、權(quán)利要求7所述的細(xì)胞、或權(quán)利要求10或11所述的組合物在處理污染或制備生物柴油中的用途。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，所述污染是油性污垢或污水。
15.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述污染是有機(jī)溶劑如苯、甲苯、丙酮等造成的污染。
16.一種處理污染的方法，其特征在于，所述方法包括使權(quán)利要求1 一 3中任一項(xiàng)所述的多肽或權(quán)利要求10或11所述的組合物與污垢接觸，從而溶解污垢而除去污垢。
【文檔編號】C12N15/63GK103525783SQ201210228810
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月3日
【發(fā)明者】陳苗苗, 徐正軍, 周美鳳, 常桂芳, 許駿 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司