專利名稱：斑點(diǎn)叉尾鮰病毒現(xiàn)場快速檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物病原檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(ChannelCatfish Virus,簡稱CCV)的現(xiàn)場快速高靈敏檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
斑點(diǎn)叉尾鮰病毒是ー種有囊膜的雙鏈DNA病毒，含囊膜的完整病毒粒子直徑為175nm 200nm ;其核衣殼為二十面體，直徑90nm 105nm。該病毒又稱鲴魚皰疫病毒I型(Ictaluridherpes virus I),國際病毒分類委員會(ICTV)第八次報告的最新病毒分類系統(tǒng)將其歸類為皰疫病毒科(Herpes virus)、鲴魚皰疫病毒屬(Ictaluri virus)。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒主要感染斑點(diǎn)叉尾鲴和鲴魚兩種經(jīng)濟(jì)魚類，患病魚發(fā)病時表現(xiàn)出水腫、眼突出、鰭條和肌肉出血等癥狀，組織病理學(xué)變化為腎管和腎間組織廣泛壞死。該病毒引起的斑點(diǎn)叉尾 鲴病毒病(Channel Catfish Virus disease, CCVD)是一種嚴(yán)重的、急性致死性傳染病，最先報道于美國，目前主要在北美地區(qū)流行，其傳播速度快、死亡率高，一旦發(fā)病就會給斑點(diǎn)叉尾鲴養(yǎng)殖帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。斑點(diǎn)叉尾鲴在國內(nèi)的養(yǎng)殖始于上世紀(jì)80年代，因養(yǎng)殖效益高，目前已成為我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之ー；隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以和養(yǎng)殖密度的増加，養(yǎng)殖期間大規(guī)模爆發(fā)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒病的風(fēng)險也大大增加了。所以研究并建立CCV的快速檢測預(yù)警技木，加強(qiáng)斑點(diǎn)叉尾鮰苗種和成魚類檢疫以及養(yǎng)殖水體環(huán)境的監(jiān)測，對預(yù)防病毒感染，有效切斷病毒傳播，保障我國斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展就顯得尤為迫切和重要。目前，CCV檢測還主要依賴于病毒分離培養(yǎng)、病理切片法、電鏡觀察法、抗體雜交和PCR檢測法。病毒分離培養(yǎng)法需要專門的培養(yǎng)條件及細(xì)胞系并且耗時較長，不適于進(jìn)行預(yù)警監(jiān)測；病理切片法不能直接對病毒進(jìn)行檢測，只能利用發(fā)病的組織病理征兆進(jìn)行檢測，并且還局限于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行；電子顯微鏡技術(shù)雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但其操作復(fù)雜、耗費(fèi)時間長、準(zhǔn)確性低；用抗體雜交檢測法檢測CCV雖然在速度上優(yōu)于病理切片法，但其靈敏度較低，在CCV尚未引發(fā)感染或感染的極早期很難用抗體法檢測出來；ccv的PCR檢測法，雖然克服了前面幾種方法的缺點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下能實(shí)現(xiàn)對CCV的相對快速、準(zhǔn)確檢測，但由于常規(guī)的PCR檢測需要昂貴的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，使得PCR檢測法難以用于現(xiàn)場的快速檢測，這大大限制了 PCR檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。進(jìn)行斑點(diǎn)叉尾鮰病毒早期檢測并采取預(yù)防措施是水產(chǎn)養(yǎng)殖中降低斑點(diǎn)叉尾鮰病毒流行風(fēng)險、減少發(fā)病照成巨額經(jīng)濟(jì)損失的有效手段，所以建立簡單、快速、高靈敏的檢查方法，并開發(fā)適于現(xiàn)場應(yīng)用的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒檢測試劑盒就尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種斑點(diǎn)叉尾鮰病毒現(xiàn)場快速檢測試劑盒及檢測方法，即適于生產(chǎn)現(xiàn)場應(yīng)用、快速、高靈敏度且易操作的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒檢測方法，并將檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化，同時將檢測試劑集中于規(guī)范的試劑盒中，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，使CCV的檢測更準(zhǔn)確、靈敏、快速、安全和方便。本發(fā)明一個方面是提供用于檢測斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物組，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1-4 ;具體信息如下上游引物I SEQ ID NO 1 5’-AGGGAGGTCACCACGAGCATTTTGTCGCGGACAGGGTCATG-3’下游引物I SEQ ID NO 2 5’-TCGCCCTCTGGGTGATCGTTTTTGGGATCTCTCGTGGGGAATG-3’上游引物2 SEQ ID NO 3 :5’ -GAGATCGCCATCGGTTCG-3’
·
下游引物2 SEQ ID NO :4 :5’ -ACCGGGGCTCCAGTCT-3，。本發(fā)明的另一個方面提供一種用于檢測斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的試劑盒，包括如下的組分(I)采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，內(nèi)裝蒸餾水；(3)核酸變性管，內(nèi)裝TE緩沖液；(4)擴(kuò)增檢測管，內(nèi)裝擴(kuò)增反應(yīng)液和染料，擴(kuò)增反應(yīng)液組成成分如下擴(kuò)增引物的上游引物I和下游引物I各I 2μ M，擴(kuò)增引物的上游引物2和下游引物2各O. I
0.4μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 O. 8 2. 0mM,MgCl24 IOmM, Betaine (甜菜堿)0. 6
1.2M, Tris-HCllO 40mM，KC110 20mM，MgSO4I 4mM，(NH4) 2S046 12mM，Triton X-100
O.05% I. 0%, Bst DNA 聚合酶 2 25U ;(5)陰性對照管，內(nèi)裝無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，內(nèi)裝吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，為親水性且易揮發(fā)的醇類物質(zhì)；(8)分別封裝于無菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙簽和吸管。染料可以選鈣黃綠素與金屬離子形成的配合物，也可以選分子生物學(xué)中應(yīng)用的核酸染料。選用鈣黃綠素時，需將O. 5 50mM金屬離子與f 80 μ M鈣黃綠素形成的配合物預(yù)混于擴(kuò)增反應(yīng)液中。核酸染料為分子生物學(xué)研究中常用的核酸染料，為SYBR Green、GelRed,GelGreen、Go IdView 或 GeneFinder 中的任一種。上述的FTA膜片是由英國Whatman公司用來制備核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小于I平方毫米的紙片。本發(fā)明的試劑盒用于非疾病和治療目的的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的檢測，例如對飼料和養(yǎng)殖水體的檢測。用本發(fā)明上述檢測試劑盒檢測CCV的方法，按下列步驟進(jìn)行(I)取樣品組織約O. 02 I. Og置于采樣管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，靜置I 20min ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，震蕩漂洗:T5min以洗滌FTA膜片；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測管內(nèi)，將擴(kuò)增檢測管置于55 65° C條件下保溫40 70min ；(6)將擴(kuò)增檢測管上下反復(fù)甩動l_3min ；(7)用力向下甩動擴(kuò)增檢測管，使管內(nèi)混有染料的擴(kuò)增反應(yīng)液集聚于擴(kuò)增檢測管底部，用眼睛觀察反應(yīng)液，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則表示該樣品的CCV檢測結(jié)果為陽性，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的CCV檢測結(jié)果為陰性。在上述步驟中，從第(4)步開始應(yīng)將作為陰性對照的無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、作為陽性對照的吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片，以及吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測。本發(fā)明的試劑盒中匯集CCV現(xiàn)場快速檢測所需的FTA膜片、TE緩沖液、擴(kuò)增反應(yīng)液、染料等試劑和研磨棒、牙簽、吸管等器材，使得CCV的檢測能夠快速有序地進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了檢測過程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，使得操作規(guī)范、不易出錯；本發(fā)明依據(jù)優(yōu)選的CCV基因組中0RF8保守區(qū)序列所設(shè)計的擴(kuò)增引物能有效檢測CCV的所有毒株，而與其他病毒的衣殼蛋白 又無同源性，檢測特異性非常好；采用醇類物質(zhì)對取樣后的FTA膜片進(jìn)行快速干燥處理，使得樣品核酸的制備時間大大縮短；采用內(nèi)置染料的方法，在反應(yīng)結(jié)束后不用打開反應(yīng)管即可直接對反應(yīng)液進(jìn)行染色，避免了打開反應(yīng)管再添加染料使后續(xù)待檢樣品被擴(kuò)增產(chǎn)物污染而造成假陽性的結(jié)果，從而大大提高了該方法在檢測中應(yīng)用的可靠性。采用本發(fā)明的方法和試劑盒只需廣I. 5小時就可完成CCV的檢測；并且檢測過程無需昂貴的儀器設(shè)備如離心機(jī)、PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)，僅需水浴鍋或金屬浴甚至更簡單的保溫裝置即可；而且檢測結(jié)果非常容易判別；與0^已有檢測技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測方法成本非常低，整個過程不涉及有毒試劑，對操作人員和環(huán)境都非常安全，并且檢測靈敏度極高，可以替代斑點(diǎn)叉尾鮰病毒之前的相關(guān)檢測方法如病理切片法、電鏡觀察法、抗體檢測法和PCR檢測法；本發(fā)明的檢測試劑盒不僅可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用，也可在野外的生產(chǎn)現(xiàn)場使用，對加強(qiáng)CCV的流行病學(xué)監(jiān)測和疾病防控意義重大，具有很高的推廣應(yīng)用價值。說明書附I :使用本發(fā)明試劑盒檢測斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的特異性的電泳圖，其中，M:DL2000Marker，泳道1-6 分別為陽性對照膜片，SVCV，GCRV，IHNV, TRIBV,陰性對照膜片；圖2 .使用本發(fā)明試劑盒檢測人工感染和健康的斑點(diǎn)叉尾鮰樣本的電泳圖， 其中，M DL2000Marker,泳道1_5分別為陽性對照膜片，樣本I，樣本2，樣本3，陰性對照膜片。
具體實(shí)施例方式首先，本發(fā)明利用針對CCV的基因組0RF8中保守區(qū)段設(shè)計的4條特異引物和一種DNA聚合酶，在恒定溫度下保溫一段時間即可完成對目的核酸的擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對CCV的快速和高靈敏檢測。為了進(jìn)一步縮短檢測時間、消除檢測過程中可能發(fā)生的污染、簡化檢測步驟，使檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟陴B(yǎng)殖現(xiàn)場開展，本發(fā)明對CCV的檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化。首先對FTA卡制備核酸的方法進(jìn)行了簡化在用FTA卡制備樣品核酸的標(biāo)準(zhǔn)步驟中，需要將被樣品勻漿液潤濕的FTA膜片在室溫下干燥至少一個小時，然后才能進(jìn)行漂洗；本發(fā)明通過在被樣品勻漿液潤濕的FTA膜片上滴加親水性且易揮發(fā)的醇類物質(zhì)(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使?jié)櫇竦腇TA膜片在室溫條件下僅需幾分鐘即可完成干燥過程，大大縮短了樣品核酸制備的時間。在利用等溫擴(kuò)增方法檢測病原時，目前普遍采用擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)管中添加核酸染料以判斷檢測結(jié)果的方法；由于等溫擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物量非常大，這種打開反應(yīng)管再添加核酸染料的方法極易導(dǎo)致后續(xù)待檢樣品被污染而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性；有報道和專利采用在擴(kuò)增反應(yīng)試劑中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染風(fēng)險，但卻增加了成本；本發(fā)明通過在用于擴(kuò)增反應(yīng)的小管內(nèi)預(yù)置染料，可有效消除污染風(fēng)險，又不增加成本。本發(fā)明含有兩種方法將染料預(yù)置于擴(kuò)增反應(yīng)的小管，其一是將金屬離子與鈣黃綠素形成的配合物(即染料)與擴(kuò)增反應(yīng)液預(yù)先混合，置于擴(kuò)增反應(yīng)小管內(nèi)；其二是先將核酸染料粘附到擴(kuò)增反應(yīng)管的內(nèi)側(cè)上方或蓋子內(nèi)側(cè)，等擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后再通過上下反復(fù)震蕩使擴(kuò)增反應(yīng)液和核酸染料混合；這樣反應(yīng)結(jié)束后無須打開擴(kuò)增反應(yīng)管就能完成擴(kuò)增產(chǎn)物的染色，消除了打開擴(kuò)增反應(yīng)管再添加核酸染料過程中反應(yīng)液可能濺出造成后續(xù)待檢樣品被污染的風(fēng)險。另夕卜，在用FTA卡制備樣品核酸的標(biāo)準(zhǔn)步驟中，需要用Whatman公司(英國)專門的純化試劑反復(fù)漂洗FTA膜片；而本發(fā)明無需專門的純化試劑，采用普通的蒸餾水漂洗即可完成FTA膜片的純化，不僅簡化了檢測的操作步驟，還降低了實(shí)驗(yàn)成本。為了使該檢測方法在生產(chǎn)現(xiàn)場具有更強(qiáng)的實(shí)用性，本發(fā)明在上述優(yōu)化整個檢測方法的基礎(chǔ)上，將檢測CCV病毒所需的試劑及器材進(jìn)行了組裝、配套，使之標(biāo)準(zhǔn)化，形成了檢測試劑盒。 以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I :本發(fā)明的檢測試劑盒由以下部件組成(可檢測4個樣品的包裝)(I)采樣管，4個，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，6個，每個管內(nèi)裝有Iml的蒸餾水；(3)核酸變性管，6個，每個管內(nèi)裝有20μ L的TE緩沖液(含IOmMTris-HCl和ImMEDTA, ρΗ8. O)；(4)擴(kuò)增檢測管,6個,每個管內(nèi)裝有24 μ L擴(kuò)增反應(yīng)液和I μ L的染料,擴(kuò)增反應(yīng)液組成成分如下擴(kuò)增引物的上游引物I和下游引物I各I. 6 μ Μ，擴(kuò)增引物的上游引物2和下游引物 2 各 O. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, MgCl28mM, Betaine (甜菜堿)
I.2M, Tris-HC120mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-100 0. 1%, Bst DNA 聚合酶8U ;染料為25 μ M鈣黃綠素和8mM氯化錳形成的配合物；引物信息如下上游引物I (SEQ ID NO 1) 5’-AGGGAGGTCACCACGAGCATTTTGTCGCGGACAGGGTCATG-3，下游引物I (SEQ ID NO 2)5’-TCGCCCTCTGGGTGATCGTTTTTGGGATCTCTCGTGGGGAATG-3’上游引物2 (SEQ ID NO 3)5’-GAGATCGCCATCGGTTCG-3’下游引物2 (SEQ ID NO 4)5，-ACCGGGGCTCCAGTCT-3，。(5)陰性對照管，I個，內(nèi)裝無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，I個，內(nèi)裝吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，I管，內(nèi)裝500 μ L無水乙醇；
(8) FTA膜片(4片)、研磨棒(4個)、牙簽(6個)和吸管(I個)分別封裝于無菌袋中；(9)包裝盒(I個)，內(nèi)裝一塊有多個小孔的海綿塊，海綿塊上有小孔4X6個；(10)使用說明書，I份。實(shí)施例2 :本發(fā)明的檢測試劑盒也可由以下部件組成(可檢測4個樣品的包裝)(I)采樣管，4個，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，6個，每個管內(nèi)裝有Iml的蒸餾水；(3)核酸變性管，6個，每個管內(nèi)裝有20μ L的TE緩沖液(含IOmMTris-HCl和ImM EDTA, ρΗ8. O)；(4)擴(kuò)增檢測管,6個,每個管內(nèi)裝有25 μ L擴(kuò)增反應(yīng)液和IyL的核酸染料,擴(kuò)增反應(yīng)液組成成分如下擴(kuò)增引物的上游引物I和下游引物I各I. 6 μ Μ，擴(kuò)增引物的上游引物 2 和下游引物 2 各 O. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, MgCl28mM, Betaine (甜菜堿)I. 2M, Tris-HC120mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-100 0. 1%, Bst DNA聚合酶8U ;核酸染料I μ L,成分為稀釋10倍的GeneFinder ,且核酸染料已粘附固定于擴(kuò)增檢測管的管蓋內(nèi)側(cè)。(5)陰性對照管，I個，內(nèi)裝無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，I個，內(nèi)裝吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，I管，內(nèi)裝500 μ L異丙醇；(8) FTA膜片(4片)、研磨棒(4個)、牙簽(6個)和吸管(I個)分別封裝于無菌袋中；(9)包裝盒(I個)，內(nèi)裝一塊有多個小孔的海綿塊，海綿塊上有小孔4X6個；(10)使用說明書，I份。實(shí)施例3 :使用本發(fā)明的檢測試劑盒檢測不同魚類病毒驗(yàn)證檢測試劑盒的特異性(I)分別取鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)感染樣品、草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)感染樣本、傳染性造血組織壞死病病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, I HNV)感染樣本、大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus, TRIBV)感染樣本腎組織各約0. Ig置于采樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置IOmin ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測管內(nèi)，55飛5°C保溫60min ；(6)將擴(kuò)增檢測管上下反復(fù)甩動2min ；(7)然后用力向下甩動擴(kuò)增檢測管，用眼睛觀察擴(kuò)增反應(yīng)液。在上述步驟中從第4步開始，將無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反應(yīng)，分別用作檢測的陰性和陽性對照。結(jié)果表明，陽性FTA膜片的檢測管出現(xiàn)了綠色，提示有CCV存在；陰性對照的檢測管顯示橙黃色，提示無CCV存在；SVCV、GCRV、IHNV和TRBIV感染樣本對應(yīng)的檢測管均呈現(xiàn)橙黃色，提示無CCV存在，這表明本發(fā)明的引物和試劑盒對CCV是特異的，檢測過程中不會產(chǎn)生假陽性。為了驗(yàn)證上述結(jié)果，從各檢測管內(nèi)分別取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果如圖I所示，從圖中可以看出，陽性對照對應(yīng)的泳道有LADDER樣電泳條帶出現(xiàn)，而其他四種魚類病毒感染樣本、陰性對照對應(yīng)泳道均無核酸條帶出現(xiàn)；將陽性對照對應(yīng)泳道中的分子量約170bp的電泳條帶切膠回收進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)該條帶序列與CCV上游引物I和下游引物I間序列一致；所以電泳結(jié)果及測序結(jié)果均證實(shí)本發(fā)明的引物和試劑盒可以特異性的擴(kuò)增CCV核酸，而不會與其他魚類病毒交叉產(chǎn)生假陽性。實(shí)施例4 :使用本發(fā)明的檢測試劑盒檢測斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的方法(I)取人工感染的斑點(diǎn)叉尾鮰樣本I個(樣本I)、健康的斑點(diǎn)叉尾鮰樣本2個(樣本2和樣本3)，分別取其腎組織約O. Ig置于采樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿狀； (2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將對應(yīng)編號的FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置IOmin ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到對應(yīng)編號的漂洗管內(nèi)，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到對應(yīng)編號的擴(kuò)增檢測管內(nèi)，55 65° C 保溫 60min;(6)將擴(kuò)增檢測管上下反復(fù)甩動2min ；(7)然后用力向下甩動擴(kuò)增檢測管，用眼睛觀察擴(kuò)增反應(yīng)液。在上述步驟中從第4步開始，將無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反應(yīng)，分別用作檢測的陰性和陽性對照。結(jié)果表明，用作陽性對照的檢測管出現(xiàn)了綠色，而用作陰性對照的檢測管中是橙黃色，這表明陽性對照和陰性對照工作正常；病毒感染的樣本I對應(yīng)的檢測管呈現(xiàn)綠色，提示有CCV存在，樣本2和樣本3對應(yīng)的檢測管呈現(xiàn)橙黃色，提示無CCV存在，與預(yù)期結(jié)果一致。為了驗(yàn)證上述結(jié)果，從各檢測管內(nèi)分別取產(chǎn)物2 μ L進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，陽性對照、樣本I對應(yīng)的泳道有LADDER樣電泳條帶出現(xiàn)，樣本2和樣本3及陰性對照檢測管對應(yīng)泳道均無核酸條帶出現(xiàn)，該結(jié)果亦與預(yù)期一致。本實(shí)施例結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的引物和試劑盒可以特異性擴(kuò)增CCV感染魚體內(nèi)的CCV核酸而不產(chǎn)生假陰性，同時也不會與魚體內(nèi)基因組核酸交叉產(chǎn)生假陽性。實(shí)施例5 :使用本發(fā)明試劑盒檢測餌料、水體中病毒存在情況使用實(shí)施例I或?qū)嵤├?中的檢測試劑盒，按下列步驟進(jìn)行(I)取斑點(diǎn)叉尾鮰鮮活餌料(樣本I和樣本2)約O. lg、養(yǎng)殖水體中100目篩絹過濾物約O. 2克(樣本3和樣本4)、人工感染CCV斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖水100目過濾物約O. I克(樣本5)置于采樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置IOmin ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測管內(nèi)，55飛5°C保溫60min ；
(6)將擴(kuò)增檢測管上下反復(fù)甩動2min ；(7)然后用力向下甩動擴(kuò)增檢測管，用眼睛觀察擴(kuò)增反應(yīng)液，如果呈現(xiàn)綠色則表示該樣品的CCV檢測結(jié)果為陽性，如果呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的CCV檢測結(jié)果為陰性。在上述步驟中從第4步開始，應(yīng)將無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反應(yīng)，分別用作檢測的陰性和陽性對照。結(jié)果表明，用作陽性對照的檢測管出現(xiàn)了綠色，而用作陰性對照的檢測管中是橙黃色,這表明陽性對照和陰性對照工作正常；樣本I、樣本2、樣本3和樣本4對應(yīng)的檢測管呈現(xiàn)橙黃色，這說明樣本1、2、3和4均未有CCV的污染；樣本5對應(yīng)的檢測管呈綠色，表明樣本5有CCV污染存在。 實(shí)施例6 :利用Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法和本發(fā)明快速核酸制備方法制備斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸為了驗(yàn)證本發(fā)明中快速核酸制備方法制備核酸的效果，分別利用Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法和本發(fā)明快速核酸制備方法分別從感染CCV的斑點(diǎn)叉尾鮰中制備病毒核酸。首先利用Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法制備病毒核酸(I)取約10-20毫克的斑點(diǎn)叉尾鮰腎組織放入I. 5mL離心管中，加入100 μ L份PBS緩沖液，用研磨棒將組織研磨成漿狀；(2)用吸液管將研磨的組織勻漿液加到FTA卡的樣品圓圈內(nèi)，大約每個圓圈加25 μ L ；(3)將加好樣品的FTA卡室溫放置干燥至少一個小時；(4)用一個鉆取工具從所上述干燥后的FTA卡上取下直徑約2. Omm的圓片，放進(jìn)
I.5mL離心管中；(5)在上述離心管中加入200 μ LFTA純化試劑(Whatman，產(chǎn)品編號WG120204)，靜置5分鐘；(6)用吸液管將離心管內(nèi)的FTA純化試劑全部吸出；(7)重復(fù)步驟(5)——(6)兩次；(8)在上述離心管中加入 200 μ L TE 緩沖液(IOmMTris-HCl，O. ImM EDTA,pH8. O),
靜置5分鐘；(9)用吸液管將離心管內(nèi)的TE緩沖液全部吸出；(10)重復(fù)步驟(8) - (9)兩次；(11)將上述離心管內(nèi)的圓片在室溫下干燥大約一個小時，圓片即可用于核酸的擴(kuò)增了。利用本發(fā)明中快速核酸制備方法按下面的步驟制備斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸(I)取約10-20毫克的斑點(diǎn)叉尾鮰脾腎臟組織放入I. 5mL離心管中，用研磨棒將其研磨成漿狀；(2)用吸液管將研磨的組織勻漿液加到3個FTA卡的樣品圓圈內(nèi)，大約每個圓圈加5 μ L ；(3)將3個FTA卡上分別滴加100 μ L甲醇、無水乙醇和異丙醇，室溫放置3飛分鐘；(4)用一個鉆取工具從所上述3個FTA卡上分別取下直徑約2. Omm的圓片放進(jìn)
I.5mL離心管中；(5)在上述離心管中加入800 μ L滅菌水，劇烈震蕩廣3分鐘；(6)取出離心管內(nèi)的圓片即可用于核酸的擴(kuò)增了。從上述過程中可以看出，采用Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法大約需要2個多小時才能完成核酸制備，而采樣本發(fā)明的快速核酸制備方法大約只需要5 10分鐘就可以完成核酸制備；所以與Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法相比，本發(fā)明的快速核酸制備方法具有操作簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例7Whatman_FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法和本發(fā)明快速核酸制備方法制備核酸的效果對比用實(shí)施例5中Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法和本發(fā)明快速核酸制備方法制備的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸分別作為模板，進(jìn)行等溫擴(kuò)增反應(yīng)，每個擴(kuò)增反應(yīng)中含25 μ L擴(kuò)增反應(yīng)液，擴(kuò)增反應(yīng)液組成成分如下擴(kuò)增引物的上游引物I和下游引物I各I. 5 μ Μ，擴(kuò)增引物的上游引物2和下游引物2各O. 3 μ M，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各I. 5mM, MgCl27mM,Betaine (甜菜堿)I. 3M, Tris-HC120mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-100
0.1%, Bst DNA聚合酶8U;等溫擴(kuò)增反應(yīng)條件為63°C保溫60分鐘，然后90° C保持5分鐘；最后將每個反應(yīng)管中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明快速核酸制備方法(制備核酸過程中采用了甲醇、無水乙醇和異丙醇等揮發(fā)性醇類作為快速干燥液)制備的核酸均可以有效用作等溫擴(kuò)增反應(yīng)的模板，并且擴(kuò)增效果略好于采用Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法制備的核酸的擴(kuò)增效果。綜上所述，本發(fā)明檢測試劑盒及其檢測方法不僅可以應(yīng)用于斑點(diǎn)叉尾鮰樣品中CCV的檢測，還可應(yīng)用于斑點(diǎn)叉尾鮰餌料中CCV的檢測；本發(fā)明快速核酸制備方法制備斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的質(zhì)量不遜于Whatman-FTA卡標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法核酸的質(zhì)量，還兼具有快速、簡便、低成本的特點(diǎn)。本發(fā)明中所述的FTA膜片是英國Whatman公司用來制備核酸的FTA卡片JfFTA卡片裁切成尺度為長X寬不小于I毫米Xl毫米的紙片或打孔成直徑不小于I毫米的紙片即可制成FTA膜片。本發(fā)明的試劑盒所使用的試劑和材料引物由上海生物工程有限責(zé)任公司合成；乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜堿(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、KCUMgSO4, (NH4)2SO4, MgCl2, Triton X-100購自上海生物工程有限責(zé)任公司；無水乙 醇、甲醇、異丙醇、鈣黃綠素、氯化錳等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；等溫擴(kuò)增用的BstDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等購自NEB公司；核酸染料GeneFinder 購自廈門百維信生物科技有限公司。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物組，其特征在于，引物的核苷酸序列分別為SEQID NO :1-4。
2.一種用于檢測斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的試劑盒，包括如下的組分 (1)采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品； (2)漂洗管，內(nèi)裝蒸餾水； (3)核酸變性管，內(nèi)裝TE緩沖液； (4)擴(kuò)增檢測管，內(nèi)裝擴(kuò)增反應(yīng)液和染料，擴(kuò)增反應(yīng)液組成成分如下擴(kuò)增引物的上游引物I和下游引物I各I 2iiM，擴(kuò)增引物的上游引物2和下游引物2各0. I 0.4iiM，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmMjMgCl2 4 10mM，Betaine 0. 6 I. 2M,Tris-HCl10 40mM，KCl 10 20mM，MgSO4 I 4mM，(NH4)2SO4 6 12mM，Triton X-100 0. 05% I.0%, Bst DNA 聚合酶 2 25U ; (5)陰性對照管，內(nèi)裝無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片； (6)陽性對照管，內(nèi)裝吸附了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片； (7)快速干燥液，為親水性且易揮發(fā)的醇類物質(zhì)； (8)分別封裝于無菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙簽和吸管； 其中的上游引物I和下游引物I、上游引物2和下游引物2為權(quán)利要求I所述的引物組，其序列信息如下 上游引物I的序列為SEQ ID NO 1 ； 下游引物I的序列為SEQ ID NO 2 ； 上游引物2的序列為SEQ ID NO 3 ； 下游引物2的序列為SEQ ID NO :4。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的組分(4)擴(kuò)增檢測管中的染料為鈣黃綠素與金屬離子形成的配合物。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的組分(4)擴(kuò)增檢測管中的染料為分子生物學(xué)中應(yīng)用的核酸染料。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的核酸染料為SYBRGreen、GelRed、GelGreen、Go I dV i ew 或 GeneFinder 中的任一種。
6.如權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于所述的FTA膜片是由英國Whatman公司用來制備核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小于I平方毫米的紙片。
7.權(quán)利要求2所述的試劑盒的用途，其特征在于，是用于非疾病和治療目的的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的檢測。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒的用途，其特征在于是對飼料和養(yǎng)殖水體進(jìn)行斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的檢測。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒的用途，其特征在于，是按下列步驟進(jìn)行的 (1)取樣品組織約0.02 I. Og置于采樣管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀； (2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤濕； (3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，靜置l 20min； (4)用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，震蕩漂洗3 5min以洗滌FTA膜片； (5)再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測管內(nèi)，將擴(kuò)增檢測管置于55 65° C條件下保溫40 70min ; (6)將擴(kuò)增檢測管上下反復(fù)甩動l_3min； (7)用力向下甩動擴(kuò)增檢測管，使管內(nèi)混有染料的擴(kuò)增反應(yīng)液集聚于擴(kuò)增檢測管底部，用眼睛觀察反應(yīng)液，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則表示該樣品的CCV檢測結(jié)果為陽性，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的CCV檢測結(jié)果為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(CCV)現(xiàn)場快速檢測試劑盒及檢測方法，試劑盒中包含有序列為SEQ ID NO1-4的引物。本發(fā)明的試劑盒使得CCV的檢測能夠快速有序地進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了檢測過程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，使得操作規(guī)范、不易出錯；優(yōu)選的CCV基因組中ORF8保守區(qū)序列所設(shè)計的擴(kuò)增引物能有效檢測CCV的毒株，而與其他病毒核酸序列又無同源性，檢測特異性非常好；采用醇類物質(zhì)對取樣后的FTA膜片進(jìn)行快速干燥處理，使得樣品核酸的制備時間大大縮短；采用內(nèi)置染料的方法，在反應(yīng)結(jié)束后不用打開反應(yīng)管即可直接對反應(yīng)液進(jìn)行染色，避免了打開反應(yīng)管再添加染料使后續(xù)待檢樣品被擴(kuò)增產(chǎn)物污染而造成假陽性的結(jié)果，從而大大提高了該方法在檢測中應(yīng)用的可靠性。
文檔編號C12N15/11GK102703609SQ201210229899
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者劉莉, 史成銀, 張慶利, 王勤濤, 閻毅, 黃倢 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所