專利名稱：一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法。
背景技術：
微生物培養(yǎng)基是人工配制的供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、一定比例的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，同時，培養(yǎng)基也為微生物提供除營養(yǎng)外的其他生長所必須的環(huán)境條件。培養(yǎng)基的組成對菌體生長繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品質(zhì)量 及產(chǎn)量等都有著重要的影響。因此，培養(yǎng)基的配方成分、各配方成分的含量比例，以及培養(yǎng)基的制備方法都會對微生物的生長造成重大影響。選擇適合的培養(yǎng)基是微生物發(fā)酵生產(chǎn)中至關重要的一步。但是，傳統(tǒng)的培養(yǎng)基篩選方法如下固定一個基本組分配方，以單個組分含量為變量，進行遙瓶發(fā)酵培養(yǎng)，然后分時間段取樣，檢測各選擇變量下的菌體生長濃度，畫出菌體生長曲線，進而判斷適合該菌種的培養(yǎng)基配方成分及其比例。這種傳統(tǒng)篩選方法需要做很多次的培養(yǎng)實驗，操作繁瑣，費時費力，不便于進行大量的培養(yǎng)基篩選實驗，而且容易造成實驗誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術的不足，提供一種步驟簡單、操作方便、所得菌體生長曲線準確度高、篩選結果可靠性高的節(jié)約時間和人力成本的快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，它包括以下步驟(I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀；(2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基SI :制備菌懸液，它包括以下步驟Sll :用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)被測增殖菌種；S12 :用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到被測菌種菌懸液；S2 :制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟S21 :分別根據(jù)各待篩選培養(yǎng)基的不同配方配制被測菌種的培養(yǎng)基S22 :在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基；(3)接種被測菌種菌懸液，它包括以下步驟S3 :培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ;
S4 :菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ;(4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好，將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ;(5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ；(6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基?？焖俸Y選流感嗜血桿菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟 (I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀；(2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基SI :制備菌懸液，它包括以下步驟Sll :用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)流感嗜血桿菌；S12 :用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到流感嗜血桿菌菌懸液；S2 :制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟S21 :配制各待篩選的流感嗜血桿菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下氯化血紅素0. 0005 0. 003,輔酶10. 0005 0. 003,酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；S22 :在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基；(3)接種流感嗜血桿菌菌懸液，它包括以下步驟S3 :培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ;S4 :菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ;(4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好,將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ;(5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ；(6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基?？焖俸Y選A群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟(I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀；(2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基SI :制備菌懸液，它包括以下步驟Sll :用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)A群腦膜炎奈瑟氏菌；
S12 :用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到A群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液；S2 :制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟S21 :配制各待篩選的A群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下酸水解酪蛋白0 3，胰蛋白胨0 3，L-半胱氨酸0. 002，磷酸二氫鈉0. 1，硫酸鎂0. 05，葡萄糖0. 2，氯化鈉0. 2，酵母浸粉0. 5 ；S22 :在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基；(3)接種A群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液，它包括以下步驟S3 :培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ;S4 :菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng) 基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ;(4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好，將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ;(5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ；(6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基?？焖俸Y選C群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟(I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀；(2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基SI :制備菌懸液，它包括以下步驟Sll :用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)C群腦膜炎奈瑟氏菌；S12 :用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到C群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液；S2 :制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟S21 :配制各待篩選的C群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下葡萄糖0 0. 5，酵母浸粉0 0. 6，酸水解酪蛋白2，胰蛋白胨2，L-半胱氨酸0. 002，磷酸二氫鈉0. 1，硫酸鎂0. 05,氯化鈉0. 2 ；S22 :在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基；(3)接種C群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液，它包括以下步驟S3 :培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ;S4 :菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ;(4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好,將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ;
(5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ；(6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。本發(fā)明還包括一個對實驗中需用到的設備器材在使用前進行滅菌的步驟，它包括以下步驟( I )將生物安全柜、酶標儀和恒溫培養(yǎng)振蕩器置于C級潔凈環(huán)境下，用臭氧熏蒸除菌；(II)將微發(fā)酵透氣膜封口膜、微孔板和移液器的吸頭進行121°C的濕熱滅菌30mino 本發(fā)明所述的移液器采用250 U I移液器。本發(fā)明所述的微孔板采用96孔微孔板。本發(fā)明所述的酶標儀采用8通道全波長酶標儀。本發(fā)明的有益效果是將被測菌種菌懸液及不同配方的待篩選培養(yǎng)基分別加入微孔板中的各小孔內(nèi)同時進行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔一段時間采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對660nm波長可見光的吸光值，從而得到被測菌體的生長曲線，得出不同配方及配方比例的培養(yǎng)基對該菌種生長的影響，最終完成培養(yǎng)基的篩選；本篩選方法步驟簡單、操作方便、所得菌體生長曲線準確度高、篩選結果可靠性高且篩選速度快、減輕了工作人員的工作量，降低了培養(yǎng)基篩選成本，可適用于大量的培養(yǎng)基篩選實驗。
具體實施例方式下面結合實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。實施例I本實施例的被測菌種選用流感嗜血桿菌Hib，對氯化血紅素及輔酶I濃度不同的Hib培養(yǎng)基進行篩選?？焖俸Y選流感嗜血桿菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟(I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、250 Ul移液器、96孔微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和8通道全波長酶標儀；它還包括一個對實驗中需用到的設備器材在使用前進行滅菌的步驟，它包括以下步驟( I )將生物安全柜、8通道全波長酶標儀和恒溫培養(yǎng)振蕩器置于C級潔凈環(huán)境下，用臭氧熏蒸除菌；(II)將微發(fā)酵透氣膜封口膜、96孔微孔板和250 Ul移液器的吸頭進行121°C的濕熱滅菌30min ；(2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基SI :制備菌懸液，它包括以下步驟Sll :用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)流感嗜血桿菌，Hib菌種按照文獻公開的方法(Anderson,1977. INFCTION AND IMMUNITY. Vol 15. No. 2，P472477)進行培養(yǎng)，采用 CY 培養(yǎng)基，成分為每升培養(yǎng)基含IOg酸水解酪蛋白、5g酵母提取物、5g葡萄糖、Img氯化血紅素、Img輔酶I、0. IM PB、20g 瓊脂，pH 值為 7. 6 ；S12 :用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到流感嗜血桿菌菌懸液；S2 :制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟S21 :配制各待篩選的流感嗜血桿菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各 組分的重量比如下AlBl組氯化血紅素0.0005，輔酶10. 0005，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A1B2組氯化血紅素0.0005，輔酶10. 001，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A1B3組氯化血紅素0.0005，輔酶10. 002，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A1B4組氯化血紅素0.0005，輔酶10. 003，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A2B1組氯化血紅素0.001，輔酶10. 0005，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;S22 :在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基；(3)接種流感嗜血桿菌菌懸液，它包括以下步驟S3 :培養(yǎng)基移液至微孔板采用250 U I移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加A 96孔微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200iil ;S4 :菌懸液移液至微孔板采用250 U I移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的96孔微孔板的小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50iil ;(4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將96孔微孔板的各小孔封好,將整個96孔微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8h ；(5)檢測吸光值每隔lh，取出96孔微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用8通道全波長酶標儀Multiskan GO檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對660nm波長可見光的吸光值OD66tl,每次檢測完成后，迅速蓋上微發(fā)酵透氣膜封口膜以避免染菌，放回恒溫培養(yǎng)振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng);(6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。實施例2本實施例的被測菌種選用流感嗜血桿菌Hib，對氯化血紅素及輔酶I濃度不同的Hib培養(yǎng)基進行篩選?？焖俸Y選流感嗜血桿菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟(I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、250 Ul移液器、96孔微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和8通道全波長酶標儀；它還包括一個對實驗中需用到的設備器材在使用前進行滅菌的步驟，它包括以下步驟( I )將生物安全柜、8通道全波長酶標儀和恒溫培養(yǎng)振蕩器置于C級潔凈環(huán)境下，用臭氧熏蒸除菌；(II)將微發(fā)酵透氣膜封口膜、96孔微孔板和250 Ul移液器的吸頭進行121°C的濕熱滅菌30min ；(2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基SI :制備菌懸液，它包括以下步驟Sll :用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)流感嗜血桿菌；Hib菌種按照文獻公開的方法(Anderson,1977. I NFCTION AND IMMUNITY. Vol 15. No. 2，P472_477)進行培養(yǎng)，采用 CY 培養(yǎng)基，成分為每升培養(yǎng)基含IOg酸水解酪蛋白、5g酵母提取物、5g葡萄糖、Img氯化血紅素、Img輔酶I、0. lMPB、20g 瓊脂，pH 值為 7. 6 ；S12 :用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到流感嗜血桿菌菌懸液；
S2 :制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟S21 :配制各待篩選的流感嗜血桿菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下A2B2組氯化血紅素0.001，輔酶10. 001，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；A2B3組氯化血紅素0.001，輔酶10. 002，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；A2B4組氯化血紅素0.001，輔酶10. 003，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；A3B1組氯化血紅素0.002，輔酶10. 0005，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A3B2組氯化血紅素0.002，輔酶10. 001，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；S22 :在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基；(3)接種流感嗜血桿菌菌懸液，它包括以下步驟S3 :培養(yǎng)基移液至微孔板采用250 Ul移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加A 96孔微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為250 ill ；S4 :菌懸液移液至微孔板采用250 Ul移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的96孔微孔板的小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為60iil ;(4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將96孔微孔板的各小孔封好,將整個96孔微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)IOh ；(5)檢測吸光值每隔2h，取出96孔微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用8通道全波長酶標儀Multiskan GO檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對660nm波長可見光的吸光值OD66tl,每次檢測完成后，迅速蓋上微發(fā)酵透氣膜封口膜以避免染菌，放回恒溫培養(yǎng)振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng);(6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。實施例3本實施例的被測菌種選用流感嗜血桿菌Hib，對氯化血紅素及輔酶I濃度不同的Hib培養(yǎng)基進行篩選。快速篩選流感嗜血桿菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟(I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、250 Ul移液器、96孔微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和8通道全波長酶標儀；它還包括一個對實驗中需用到的設備器材在使用前進行滅菌的步驟，它包括以下步驟( I )將生物安全柜、8通道全波長酶標儀和恒溫培養(yǎng)振蕩器置于C級潔凈環(huán)境下，用臭氧熏蒸除菌；(II)將微發(fā)酵透氣膜封口膜、96孔微孔板和250 Ul移液器的吸頭進行121°C的濕熱滅菌30min ； (2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基SI :制備菌懸液，它包括以下步驟Sll :用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)流感嗜血桿菌，Hib菌種按照文獻公開的方法(Anderson,1977. I NFCTION AND IMMUNITY. Vol 15. No. 2，P472_477)進行培養(yǎng)，采用 CY 培養(yǎng)基，成分為每升培養(yǎng)基含IOg酸水解酪蛋白、5g酵母提取物、5g葡萄糖、Img氯化血紅素、Img輔酶I、0. IM PB、20g 瓊脂，pH 值為 7. 6 ；S12 :用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到流感嗜血桿菌菌懸液；S2 :制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟S21 :配制各待篩選的流感嗜血桿菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下A3B3組氯化血紅素0.002，輔酶10. 002，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A3B4組氯化血紅素0.002，輔酶10. 003，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A4B1組氯化血紅素0.003，輔酶10. 0005，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A4B2組氯化血紅素0.003，輔酶10. 001，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A4B3組氯化血紅素0.003，輔酶10. 002，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A4B4組氯化血紅素0.003，輔酶10. 003，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖S22 :在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基；(3)接種流感嗜血桿菌菌懸液，它包括以下步驟S3 :培養(yǎng)基移液至微孔板采用250 U I移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加A 96孔微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200iil ;S4 :菌懸液移液至微孔板采用250 Ul移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的96孔微孔板的小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50iil ;(4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將96孔微孔板的各小孔封好,將整個96孔微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)IOh ；(5)檢測吸光值每隔2h，取出96孔微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用8通道全波長酶標儀Multiskan GO檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對660nm波長可見光的吸光值OD66tl,每次檢測完成后，迅速蓋上微發(fā)酵透氣膜封口膜以避免染菌，放回恒溫培養(yǎng)振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng);(6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。實施例I 實施例3中，各待篩選培養(yǎng)基中酸水解酪蛋白的濃度均為1%，酵母提取物的濃度均為0. 5%葡萄糖的濃度也均為0. 5% ;氯化血紅素及輔酶I的濃度如表I所示
權利要求
1.一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀； (2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基 51:制備菌懸液，它包括以下步驟 511:用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)被測增殖菌種； 512:用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到被測菌種菌懸液； 52:制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟 521:分別根據(jù)各待篩選培養(yǎng)基的不同配方配制被測菌種的培養(yǎng)基 522:在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基； (3)接種被測菌種菌懸液，它包括以下步驟 53:培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ; 54:菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ; (4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好，將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ; (5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ； (6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于快速篩選流感嗜血桿菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟 (1)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀； (2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基 51:制備菌懸液，它包括以下步驟 511:用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)流感嗜血桿菌； 512:用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到流感嗜血桿菌菌懸液； 52:制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟 521:配制各待篩選的流感嗜血桿菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下氯化血紅素0. 0005 0. 003,輔酶10. 0005 0. 003,酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ； 522:在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基； (3)接種流感嗜血桿菌菌懸液，它包括以下步驟 53:培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ;S4:菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ; (4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好，將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ; (5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ； (6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于快速篩選A群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟 (1)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀； (2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基 51:制備菌懸液，它包括以下步驟 511:用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)A群腦膜炎奈瑟氏菌； 512:用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到A群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液； 52:制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟 521:配制各待篩選的A群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下酸水解酪蛋白0 3，胰蛋白胨0 3，L-半胱氨酸0. 002，磷酸二氫鈉0. 1，硫酸鎂0. 05，葡萄糖0. 2，氯化鈉0. 2，酵母浸粉0. 5 ； 522:在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基； (3)接種A群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液，它包括以下步驟 53:培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ; 54:菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ; (4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好，將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ; (5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ； (6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于快速篩選C群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基的方法包括以下步驟 (I)準備設備器材準備實驗所需用到的設備器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微發(fā)酵透氣膜封口膜、恒溫培養(yǎng)振蕩器和酶標儀；(2)制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基 51:制備菌懸液，它包括以下步驟 511:用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)C群腦膜炎奈瑟氏菌； 512:用生理鹽水將菌體洗脫下來，得到C群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液； 52:制備各待篩選的培養(yǎng)基，它包括以下步驟 521:配制各待篩選的C群腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各組分的重量比如下葡萄糖O 0. 5，酵母浸粉0 0. 6，酸水解酪蛋白2，胰蛋白胨2，L-半胱氨酸0. 002，磷酸二氫鈉0. 1，硫酸鎂0. 05,氯化鈉0. 2 ； 522:在生物安全柜中用無菌濾膜進行除菌過濾，得到各待篩選的培養(yǎng)基； (3)接種C群腦膜炎奈瑟氏菌菌懸液，它包括以下步驟 53:培養(yǎng)基移液至微孔板采用移液器將步驟S2所得的各培養(yǎng)基分別加入微孔板的小孔中，每個小孔內(nèi)分別加入一種待篩選的培養(yǎng)基，并記錄每個小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，其中，每個小孔內(nèi)加入的培養(yǎng)基的量為200 250iil ; 54:菌懸液移液至微孔板采用移液器將步驟SI所得的菌懸液接種到已加有培養(yǎng)基的微孔板小孔中，其中，每個小孔內(nèi)加入的菌懸液的量為50 60iil ; (4)振蕩培養(yǎng)用微發(fā)酵透氣膜封口膜將微孔板的各小孔封好，將整個微孔板置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中緩慢振蕩培養(yǎng)8 IOh ; (5)檢測吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭開微發(fā)酵透氣膜封口膜，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液對可見光的吸光值OD ； (6)作生長曲線、對比篩選根據(jù)單個小孔內(nèi)不同時段的吸光值OD作出菌體的生長曲線，結合步驟S3所記錄的各小孔內(nèi)所加入的培養(yǎng)基的配方及其配方比例，篩選出適合該菌種使用的培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于它還包括一個對實驗中需用到的設備器材在使用前進行滅菌的步驟，它包括以下步驟 (I )將生物安全柜、酶標儀和恒溫培養(yǎng)振蕩器置于C級潔凈環(huán)境下，用臭氧熏蒸除菌； (II)將微發(fā)酵透氣膜封口膜、微孔板和移液器的吸頭進行121°C的濕熱滅菌30min。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于所述的移液器采用250iU移液器。
7.根據(jù)權利要求I所述的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于所述的微孔板采用96孔微孔板。
8.根據(jù)權利要求I所述的一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，其特征在于所述的酶標儀采用8通道全波長酶標儀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速篩選微生物培養(yǎng)基的方法，它包括以下步驟制備菌懸液及各待篩選的培養(yǎng)基；培養(yǎng)基移液至微孔板；菌懸液接種移液至微孔板；微孔板封口、振蕩培養(yǎng)8～10h；每隔1～2h，采用酶標儀檢測各小孔內(nèi)發(fā)酵液的吸光值OD；作生長曲線、對比、完成篩選。本發(fā)明的有益效果是將被測菌種菌懸液及不同配方的待篩選培養(yǎng)基分別加入微孔板中的各小孔內(nèi)同時進行發(fā)酵培養(yǎng)，實現(xiàn)篩選的步驟簡單、操作方便、所得菌體生長曲線準確度高、篩選結果可靠性高且篩選速度快、減輕了工作人員的工作量，降低了培養(yǎng)基篩選成本，可適用于大量的培養(yǎng)基篩選實驗。
文檔編號C12Q1/02GK102747131SQ20121023000
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權日2012年7月4日
發(fā)明者伍長華, 關曉峰, 吳強, 楊永華, 羅力心, 陳庚 申請人:成都歐林生物科技股份有限公司