專利名稱：焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
5-氟尿嘧啶(5-FU)目前仍然是使用最廣泛的抗葉酸類抗腫瘤藥物，用于多種實(shí)體腫瘤，如結(jié)直腸癌、乳腺癌等的藥物治療。5-FU可使部分患者得到顯效治療，但常伴隨者嚴(yán)重的胃腸道毒副作用和血液毒性反應(yīng)，甚至導(dǎo)致治療失敗。5-FU在體內(nèi)大部分經(jīng)過(guò)二氫嘧啶脫氫酶(DPD)代謝失活，少部分是經(jīng)過(guò)胸苷磷酸化酶(TP)代謝成其活性代謝產(chǎn)物2’ -脫氧-5-氟尿嘧啶磷酸鹽(2’ -dFUMP)。除5-FU外，氟化嘧啶類藥物如卡培他濱、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脫氧氟尿苷等，是5-FU的前藥，需在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成5-FU起抗腫瘤作用。 二氫嘧啶脫氫酶是5-FU催化代謝限速酶，85%的5_FU經(jīng)其代謝成非活性代謝產(chǎn)物。因此，遺傳導(dǎo)致的酶活性不足，可導(dǎo)致代謝改變和嚴(yán)重藥物毒性反應(yīng)。二氫嘧啶脫氫酶編碼的基因是DPYD，為人lp22染色體上，長(zhǎng)950bp，有23個(gè)外顯子。至今已發(fā)現(xiàn)超過(guò)30種SNPs和缺失突變，大多數(shù)對(duì)DH)酶功能無(wú)影響，少部分使酶活性降低，甚至導(dǎo)致酶功能缺失。最常見(jiàn)的可導(dǎo)致嚴(yán)重毒性反應(yīng)的突變是14外顯子1986位A — G改變(DPYD*2A等位基因，rs3918290)，其編碼的產(chǎn)物為無(wú)活性的酶。酶活性嚴(yán)重降低，導(dǎo)致5-氟尿嘧啶在體內(nèi)蓄積，引起嚴(yán)重粘膜炎、粒細(xì)胞減少癥、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至死亡。大量研究表明，DH)酶活性降低的患者中有40%攜帶DPYD*2A基因突變，其中有60%的患者5-FU治療后發(fā)生4級(jí)嚴(yán)重的粒細(xì)胞減少血液毒性。DH)酶活性正?；颊呓?jīng)5-FU治療后只有10%發(fā)生嚴(yán)重毒副反應(yīng)。因此，DH)基因分型可能是一種預(yù)測(cè)5-FU治療導(dǎo)致致命毒性反應(yīng)發(fā)生概率的有效遺傳分析手段，為臨床醫(yī)生制定藥物治療方案提供參考。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它將5，10-MTHF轉(zhuǎn)變成5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)。葉酸抑制劑(5-氟尿嘧啶、培美曲塞、卡培他濱、替加氟等)的抗癌活性與腫瘤細(xì)胞內(nèi)5，10-亞甲基四氫葉酸濃度呈正相關(guān)。因此，MTHFR的活性將直接影響體內(nèi)5，10-MTHF的濃度，從而影響葉酸抑制劑的抗癌作用。MTHFR基因位于I號(hào)染色體，具有多態(tài)性，最常見(jiàn)的突變是位于4號(hào)外顯子的rsl801133。rsl801133發(fā)生頻率較高，普通人群AA突變純合子發(fā)生率為25%。具有AA型突變等位基因的患者，MTHFR酶活性的下降使得細(xì)胞內(nèi)亞甲基四氫葉酸積聚，增強(qiáng)了 5-FU活性代謝產(chǎn)物5-FdUMP對(duì)胸苷酸合成酶的抑制作用，導(dǎo)致了嚴(yán)重的骨髓抑制不良反應(yīng)。有研究表明，5-FU治療后，AA型患者77%產(chǎn)生了 3-4級(jí)毒性反應(yīng)，GA和GG型患者出現(xiàn)這種毒性反應(yīng)的只有6%和8%，突變純合子產(chǎn)生毒性反應(yīng)的概率是其它基因型的9到12倍。因此，MTHFR是也是預(yù)測(cè)5-FU療效的因子。綜上所述，DPYD和MTHFR基因多態(tài)性是影響抗葉酸類制劑需求劑量差異性的主要因素，開(kāi)發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)DPYD和MTHFR基因多態(tài)性的試劑盒將為抗葉酸類制劑的臨床個(gè)體化治療起到積極的推動(dòng)作用。
焦磷酸測(cè)序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測(cè)要求。

發(fā)明內(nèi)容
DPYD (rs3918290)和MTHFR (rsl801133)基因多態(tài)性是影響抗葉酸類制劑劑量個(gè)體差異的最主要因素。本發(fā)明提供一種檢測(cè)影響臨床抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥治療的用藥基因DPYD (SEQ ID NO. I)和MTHFR (SEQ ID NO. 2)多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為
所述焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引
物
(1)擴(kuò)增引物
DPYD (rs3918290)上游引物5’ - GGT GTC AAA GTG TCA CTG AAC TA -3’ (SEQ IDNO. 3)；
MTHFR (rsl801133)上游引物:5，_ AAG GCC ACC CCG AAG CAG GGA GCT -3，(SEQ IDNO. 4)；
DPYD (rs3918290)下游引物5’ - CTC TTG TTT TAG ATG TTA AAT CAC -3，(SEQ IDNO. 5)；
MTHFR (rsl801133)下游引物5’ -GGG GAC GAT GGG GCA AGT -3，(SEQ ID NO. 6)； 其中，DPYD下游引物的5’進(jìn)行生物素標(biāo)記，MTHFR上游引物5’標(biāo)記生物素；
(2)測(cè)序引物
DPYD (rs3918290)測(cè)序引物5，- GCT GAC TTT CCA GAC AAC -3，(SEQ ID NO. 7)；MTHFR (rsl801133)測(cè)序引物5’ - CGT GAT GAT GAA ATC G -3’ (SEQ ID NO. 8)；在實(shí)際應(yīng)用中，可以對(duì)上述引物作適當(dāng)改變，只要保證設(shè)計(jì)的引物與上述引物同源性達(dá)95%以上即可；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測(cè)序的常規(guī)試劑。所述應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測(cè)抗葉酸類制劑用藥基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟
(1)DNA 提?。?br> (2)聚合酶鏈反應(yīng)
配制 50 ill PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 10. 0 u I, dNTP 2. Oyl，上游引物l.Oul,下游引物 l.Oiil，rTaql. OiU，水 31. OiU，模板 4. OiU ;循環(huán)程序?yàn)?5°C 5min預(yù)變性；依次在95°C 30S,52°C 30S,72°C 30S，進(jìn)行38個(gè)循環(huán);72°C保持5min，最終保持在4 °C，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。本發(fā)明的試劑盒對(duì)DPYD (rs3918290)目標(biāo)序列和MTHFR (rsl801133)目標(biāo)序列進(jìn)行分析和檢測(cè)；其中，DPYD (rs3918290)目標(biāo)序列包括野生型AACGTAAGTGTG (SEQID NO. 9)和突變型 AACATAAGTGTG (SEQ ID NO. 10)，擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度為 74bp ；MTHFR(rsl801133)目標(biāo)序列包括野生型 GCTCCCGC (SEQ ID NO. 11)和突變型 ACTCCCGC (SEQID NO. 12)，擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)為167bp。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對(duì)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥基因進(jìn)行快速檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于臨床上抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥方案制定的基因檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具 有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。


圖I為本發(fā)明DPYD rs3918290野生型純合子焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖2為本發(fā)明MTHFR rsl801133野生型純合子焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖3為本發(fā)明MTHFR rsl801133突變型雜合子焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖4為本發(fā)明MTHFR rsl801133突變型純合子焦磷酸測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)上述試劑盒及檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例I :
DPYD (rs3918290)上游引物5’ - GGT GTC AAA GTG TCA CTG AAC TA -3’ (SEQ IDNO. 3)；
MTHFR (rsl801133)上游引物:5，_ AAG GCC ACC CCG AAG CAG GGA GCT -3，(SEQID NO. 4)；
DPYD (rs3918290)下游引物5’ - CTC TTG TTT TAG ATG TTA AAT CAC -3’ (SEQID NO. 5)；
MTHFR (rsl801133)下游引物:5，_ GGG GAC GAT GGG GCA AGT -3，(SEQ ID NO. 6)；DPYD (rs3918290)測(cè)序引物5，- GCT GAC TTT CCA GAC AAC -3，(SEQ ID NO. 7)；MTHFR (rsl801133)測(cè)序引物5’ - CGT GAT GAT GAA ATC G -3’ (SEQ ID NO. 8)；
I. DNA提取
I. I實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下
(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng)標(biāo)識(shí)處打勾V ; (2)異丙醇(如無(wú)，可用無(wú)水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對(duì)應(yīng)標(biāo)本唯一性標(biāo)識(shí)做好標(biāo)記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室溫離心20秒；
I.8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；
I.9開(kāi)Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 12 打開(kāi) Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見(jiàn)白色絮狀gDNA析
出； I. 15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 16打開(kāi)Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；
I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 19打開(kāi)Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；
I.20在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開(kāi)蓋側(cè)放風(fēng)干；
I.21目測(cè)沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過(guò)夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸濃度測(cè)定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標(biāo)清樣本唯一性編號(hào)，并用透明膠帶纏繞保護(hù)；
1.24保存核酸標(biāo)本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應(yīng)
2.I在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制50 Ul PCR擴(kuò)增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
IOxPCRbufferlO.Opl
dNTP2JfZ
上游引物l^1
(每種引物加&-5叫
下鏃引物L(fēng)0P1
(每種引物加0.5,ul) rTaq1.0|il
"zKHoiH
注上游引物和下游引物各有兩種，這里的I. Oiil是指每種上游引物各加0. 5iU，以及每種下游引物各加0.5iil。2. 2在標(biāo)本制備區(qū)對(duì)盛有g(shù)DNA模板短暫離心后添加4. 0 U I至擴(kuò)增體系中，在PCR管壁上標(biāo)記標(biāo)本唯一丨丨生標(biāo)識(shí)，管蓋上標(biāo)記檢測(cè)項(xiàng)目代號(hào)。PCR管震蕩混勻,桌面離心機(jī)上短暫離心；
2.3在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括如下引物 (1)擴(kuò)增引物上游引物:5，-GGT GTC AAA GTG TCA CTG AAC TA-3，；5’ - AAG GCC ACC CCG AAG CAG GGA GCT _3’，該引物 5’ 標(biāo)記生物素； 下游引物:5，-CTC TTG TTT TAG ATG TTA AAT CAC-3’，該引物5，標(biāo)記生物素；5’ - GGG GAC GAT GGG GCA AGT -3’ ； (2)測(cè)序引物:5，-GCT GAC TTT CCA GAC AAC -3，； 5’ - CGT GAT GAT GAA ATC G -3’。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測(cè)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(1)DNA 提??； (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制 50 ill PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 2. Oyl，上游引物l.Oul,下游引物 l.Oul, rTaql. Ou l,7jC 31. 0 yl，模板 4. 0 ;循環(huán)程序?yàn)?5°C 5min預(yù)變性；依次在95°C 30S,52°C 30S,72°C 30S，進(jìn)行38個(gè)循環(huán);72°C保持5min，最終保持在4°C，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)抗葉酸類制劑個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法。具體是指DPYD(rs3918290)和MTHFR(rs1801133)單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包含如SEQIDNO.3—8所示的引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、高通量DPYD(rs3918290)和MTHFR(rs1801133)的檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)抗葉酸類制劑用藥實(shí)現(xiàn)安全合理有效的個(gè)體化給藥。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102796814SQ20121023045
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者周宏灝 申請(qǐng)人:周宏灝